CN102643802B

CN102643802B - 八角基因组dna的提取方法

Info

Publication number: CN102643802B
Application number: CN201210145923.7A
Authority: CN
Inventors: 陈海云; 陈少瑜; 宁德鲁; 吴涛; 耿树香; 谷丽萍; 白平; 李勇杰; 毛云玲; 张艳丽; 肖良俊; 马婷; 王洋; 贺娜
Original assignee: Yunnan Academy of Forestry
Current assignee: Yunnan Academy of Forestry
Priority date: 2012-05-13
Filing date: 2012-05-13
Publication date: 2014-04-23
Anticipated expiration: 2032-05-13
Also published as: CN102643802A

Abstract

本发明提供一种八角基因组DNA的提取方法，在八角粉末中加入CTAB提取液，混匀，离心后得到上清液A；在上清液A中加入等体积的氯仿︰异戊醇溶液，混匀，离心，再在所得上清液中加入等体积的氯仿︰异戊醇溶液，混匀、静置、离心分离得上清液B；在B中加入-30℃的无水乙醇后，离心得沉淀物；采用常规试剂盒所用的吸附柱再次纯化沉淀物，经洗脱、静置、离心后，将所得的洗脱液再次返回到吸附柱中，离心得到的液体即为八角基因组DNA溶液。本发明综合了CTAB法和试剂盒提取方法的特点，最终得到顽拗类植物八角高质量的基因组DNA。

Description

八角基因组DNA的提取方法

技术领域

本发明涉及一种顽拗类植物基因组DNA的提取方法，具体涉及八角基因组DNA的提取方法，属于分子生物学技术领域。

背景技术

顽拗类植物（Recalcitrant plant taxa）是指那些由于特殊细胞结构和高含量次生产物而使得基因组DNA的提取非常困难的一类植物。这些次生产物主要包括多糖、多酚、蛋白质以及其他一些未知的粘性极强的化合物。提取DNA时，它们通常与核基因组DNA共同沉淀或者捆绑在一起，严重地影响了DNA质量，导致扩增、酶切等分子操作难以进行。有许多林木树种属于这一类植物，八角便是其中的一种。

八角（Illicium verum Hook. f.）为八角科（Illiciaceae）八角属（Illicium Linn.）植物，常绿乔木，是我国南亚热带地区特有的一种经济价值很高的香料树种，也是著名的“药食同源”的树种之一。八角叶片中含有丰富的多糖、蛋白质、莽草酸、维生素等次生物，这让它具有了较高的利用价值，但同时给其基因组DNA的提取也带来了较大的困难。采用分子标记技术进行八角种质资源遗传多样性研究，揭示其遗传多样性水平和遗传结构状况，对于高效地建立八角种质资源基因库、八角遗传育种以及八角种质的进一步开发利用具有非常重要的指导意义。

基因组DNA的提取是分子生物学研究的基础，常用的基因组DNA提取方法有：CTAB法、改良CTAB法、SDS法、高盐沉淀法、试剂盒等。采用上述几种方法提取八角基因组DNA时都出现研磨样加入提取液后变得非常粘稠，提取的DNA样品由于含有大量的次生物不易溶于TE缓冲液，缠搅在其中的粘性物致使DNA检测时上样困难、电泳困难。凝胶电泳检测显示DNA得率很低，上样孔或样道非常亮（见图1～4）。

发明内容

为了解决八角次生物含量高导致的高质量DNA提取困难的问题，本发明对常用的CTAB方法加以改良，同时结合试剂盒提取的某些步骤，获得了一种八角基因组DNA提取的有效方法。

本发明通过下列技术方案实现：一种八角基因组DNA的提取方法，其特征在于经过下列各步骤：

（1）按每100 g八角粉末加入6～8 L提取液的量，在八角粉末中加入55～65℃的CTAB提取液，混匀，在55～65℃下保温30～60分钟，其间晃动3～4次，使其充分混合，得混合物；

（2）将步骤（1）的混合物在转速为8000～12000 rpm下，离心分离5～10分钟，得到上清液A；

（3）在步骤（2）所得上清液A中加入等体积的氯仿与异戊醇溶液，其中，氯仿︰异戊醇的体积比为24︰1，混匀后在室温下静置5～10分钟，再在8000～12000 rpm下离心分离5～10分钟，取出上清液；在上清液中再次加入等体积的体积比为24︰1的氯仿与异戊醇溶液，混匀后室温静置5～10分钟，离心分离，得到上清液B；

（4）按上清液B体积的2～3倍的量，在上清液B中，加入-30 ℃的无水乙醇，产生絮状沉淀，离心得沉淀物；

（5）采用植物DNA提取试剂盒的吸附柱将步骤（4）所得沉淀物，按试剂盒程序进行漂洗、室温静置、离心洗脱，得洗脱液；

（6）将步骤（5）所得的洗脱液返回到吸附柱中，室温下静置5～10分钟，再在8000～12000 rpm下离心分离2分钟，所得的液体即为八角基因组DNA溶液。

所述步骤（1）的八角粉末是：在八角叶片或者枝条或者果实或者其它部位中（干样），按常规加入液氮研磨成的粉末。

所述步骤（1）的CTAB提取液为：母液是含有1.4 mol/L的NaCI、100 mmol/L的Tris-HCI、20 mmol/L的EDTA的混合溶液，母液的pH为8.0，常规灭菌；使用时在每100ml母液中加入3g的CTAB，2g的PVP和2ml的β-巯基乙醇。

上述母液（200 mL）的配制是先称取16.363g NaCI、2.428g Tris-base、1.489g EDTA，再用HCl调pH为8.0，然后定容至200 mL。

所述步骤（5）的试剂盒为北京索莱宝科技有限公司生产的Solarbio植物基因组DNA提取试剂盒。

所述步骤（5）使用吸附柱时，若出现黄绿色，需加入无水乙醇600 uL后，再离心分离。

本发明具有下列优点和效果：

（1）对传统的CTAB法进行了改良，提高了提取液中CTAB的含量；同时加大了提取液的用量，由通常的干样的10～20倍提高到60～80倍；这样不仅去除了部分蛋白等次生物，还让尽量多的DNA（或其螯合物）溶于上清液中，以得到量大、纯度高的八角基因组DNA；

（2）利用试剂盒吸附柱和漂洗液去除残留的多糖、蛋白质等次生物，提高DNA的纯度。

（3）如果只运用CTAB法（或SDS、高盐法），虽得到的八角基因组DNA量大，但杂质太多，尤其多糖难以去除，无法得到高质量DNA（如图1～3）；如果只运用试剂盒法，一是用的样品量和提取液量很有限，二是样品粉末加入提取液后变得特别粘稠，致使吸附柱完全被阻塞，此法去杂质的效果较好，但DNA的得率却非常的低（如图4）。

本发明综合了CTAB法和试剂盒提取方法的特点，得到高质量的与杂质彻底分离的八角基因组DNA。经检测用本发明方法得到的八角基因组DNA质量较高，这可由图5清楚看到；用该八角基因组DNA进行RAPD-PCR扩增，得到较好的扩增结果，如图6所示。

附图说明

图1 传统CTAB法提取的八角DNA凝胶电泳检测图片；

图2 传统SDS法提取的八角DNA凝胶电泳检测图片；

图3 传统高盐法提取的八角DNA凝胶电泳检测图片；

图4 试剂盒法提取的八角DNA凝胶电泳检测图片；

图5 本发明方法提取的八角DNA凝胶电泳检测图片；

图6 本发明方法提取的DNA的RAPD-PCR扩增凝胶电泳检测图片。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步说明。

实施例1

（1）在0.1 g八角叶片（干样）中加入液氮研磨成粉末；

（2）在步骤（1）的八角叶片粉末中加入65 ℃的CTAB提取液6 mL，充分混匀，在65 ℃水浴下保温40分钟，其间晃动4次，使其充分混合，得混合物；其中CTAB提取液为：母液是含有1.4 mol/L的NaCI、100 mmol/L的Tris-HCI、20 mmol/L的EDTA的混合溶液，其配制如下：称取16.363 g 的NaCI、2.428 g的Tris-base、1.489 g的EDTA，用HCl调pH为8.0，然后定容至200 mL，并经常规灭菌处理；使用时在200ml母液中加入3g的CTAB，4g的PVP和4ml的β-巯基乙醇；

（3）将步骤（2）所得混合物在12000 rpm转速下，离心分离10分钟，得到上清液A；

（4）在步骤（3）的上清液A中加入等体积的氯仿与异戊醇溶液，且氯仿︰异戊醇的体积比为24︰1，混匀后在室温下静置5分钟，再在12000 rpm下离心分离10分钟，取出上清液；在上清液中再次加入等体积的氯仿︰异戊醇溶液（24︰1），混匀后室温静置并离心，得到上清液B；

（5）按上清液B体积的2.0倍量，在步骤（4）所得上清液B中，加入-30 ℃的无水乙醇，混匀后产生絮状沉淀，离心得沉淀物；

（6）将步骤（5）的沉淀物采用北京索莱宝科技有限公司生产的Solarbio植物基因组DNA提取试剂盒，并按该试剂盒的操作程序进行如下操作：

在12000 rpm下离心分离1分钟，除去废液；若出现黄绿色，加入无水乙醇600 uL后再离心分离；

在吸附柱中加入600 uL试剂盒中的漂洗液，再在12000 rpm下离心分离1分钟，除去废液；

将吸附柱放在室温下静置5分钟；

在吸附柱正中加入试剂盒中的洗脱液50 uL，室温下静置5分钟，再在12000 rpm下离心分离2分钟；

（7）将步骤（6）离心后所得的洗脱液返回到吸附柱中，室温下静置5分钟，再在12000 rpm下离心分离2分钟，所得的液体即为八角基因组DNA溶液。

实施例2

（1）在0.1 g八角叶片（干样）中加入液氮研磨成粉末；

（2）在步骤（1）的八角叶片粉末中加入50 ℃的CTAB提取液8mL，充分混匀，在50 ℃水浴下保温60分钟，其间晃动3次，使其充分混合，得混合物；其中CTAB提取液同实施例1；

（3）将步骤（2）的混合物在转速为8000 rpm下，离心分离8分钟，得到上清液A；

（4）在步骤（3）所得上清液A中加入等体积的氯仿︰异戊醇溶液，其中氯仿︰异戊醇的体积比为24︰1，混匀后在室温下静置10分钟，再在8000 rpm下离心分离10分钟，取出上清液；在上清液中再次加入等体积的氯仿︰异戊醇溶液（24︰1），混匀后室温静置并离心，得到上清液B；

（5）按上清液B体积的2.5倍量，在步骤（4）所得上清液B中，加入-30 ℃的无水乙醇，混匀后产生絮状沉淀，过滤分离得沉淀物；

（6）将步骤（5）的沉淀物采用与实施例1相同的试剂盒，并按试剂盒的操作程序进行如下操作：

在10000 rpm下离心1分钟，除去废液；

在吸附柱中加入600 uL试剂盒中的漂洗液，再在10000 rpm下离心分离1分钟，除去废液；

将吸附柱放在室温下静置5分钟；

在吸附柱正中加入试剂盒中的洗脱液或TE 80 uL，室温静置5分钟，再在10000 rpm下离心分离2分钟；

（7）将步骤（6）离心后所得的洗脱液加回到吸附柱中，室温静置5分钟，再在10000 rpm下离心分离2分钟，所得的液体即是八角基因组DNA溶液。

实施例3

（1）在0.1 g八叶片角样品（干样）中加入液氮研磨成粉末；

（2）在步骤（1）的八角粉末中加入预热55 ℃的CTAB提取液7 mL，充分混匀，在55 ℃水浴下保温30分钟，其间晃动3次，使其充分混合，得混合物；其中CTAB提取液同实施例1；

（3）将步骤（2）的混合物在10000 rpm转速下，离心分离8分钟，得到上清液A；

（4）在步骤（3）所得上清液A中加入等体积的氯仿︰异戊醇溶液，其中氯仿︰异戊醇的体积比为24︰1，混匀后在室温下静置8分钟，再在10000 rpm下离心分离8分钟，取出上清液；在上清液中再次加入等体积的氯仿︰异戊醇溶液（24︰1），混匀后室温静置并离心，得到上清液B；

（5）按上清液B体积的3.0倍量，在步骤（4）所得上清液B中，加入-30 ℃的无水乙醇，混匀后产生絮状沉淀，过滤分离得沉淀物；

在8000 rpm下离心1分钟，除去废液；

在吸附柱中加入600 uL试剂盒中的漂洗液，再在8000 rpm下离心分离1分钟，除去废液；

将吸附柱放在室温下静置8分钟；

在吸附柱正中加入试剂盒中的TE 100 uL，室温静置10分钟，再在8000 rpm下离心分离2分钟；

（7）将步骤（6）离心后所得的洗脱液返回到吸附柱中，室温静置5分钟，再在8000 rpm下离心分离2分钟，所得的液体即是八角基因组DNA溶液。

Claims

1.一种八角基因组DNA的提取方法，其特征在于经过下列各步骤：

（1）按每100 g八角粉末加入6～8 L CTAB提取液的量，在八角粉末中加入预热55～65 ℃的CTAB提取液，混匀，在55～65 ℃下保温30～60分钟，其间晃动3～4次，使其充分混合，得混合物；其中：CTAB提取液为：母液是含有1.4 mol/L的NaCI、100 mmol/L的Tris-HCI、20 mmol/L的EDTA的混合溶液，母液的pH为8.0，常规灭菌；使用时在每100ml母液中加入3g的CTAB，2g的PVP和2ml的β-巯基乙醇；

（2）将步骤（1）的混合物在转速为8000～12000 rpm下，离心5～10分钟，得到上清液A；

（3）在步骤（2）所得上清液A中加入等体积的氯仿与异戊醇的混合溶液，其中，氯仿︰异戊醇的体积比为24︰1，混匀后在室温下静置5～10分钟，再在8000～12000 rpm下离心分离5～10分钟，取出上清液；在上清液中再次加入等体积的体积比为24︰1的氯仿与异戊醇溶液，混匀后室温静置5～10分钟，离心分离，得到上清液B；

（4）按上清液B体积的2～3倍的量，在上清液B中加入-30 ℃的无水乙醇，产生絮状沉淀，离心得沉淀物；

（5）采用植物DNA提取试剂盒的吸附柱将步骤（4）所得沉淀物，按该试剂盒操作程序进行漂洗、室温静置、离心洗脱，得洗脱液；

（6）将步骤（5）所得的洗脱液返回到吸附柱中，室温下静置5～10分钟，再在8000～12000 rpm下离心2分钟，所得的液体即为八角基因组DNA溶液。