CN102634416A

CN102634416A - 一种紫苏子油酶解富集α-亚麻酸的方法

Info

Publication number: CN102634416A
Application number: CN2012101077637A
Authority: CN
Inventors: 万明利; 李用城
Original assignee: CHENGDU WANJIAFANG TECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: CHENGDU WANJIAFANG TECHNOLOGY Co Ltd
Priority date: 2012-04-13
Filing date: 2012-04-13
Publication date: 2012-08-15

Abstract

本发明“一种紫苏子油酶解富集α-亚麻酸的方法”涉及生物技术和精细化工技术，主要解决相邻碳原子数相同而烯键不同富集高纯度α-亚麻酸(ALA)的关键控点，将紫苏子油中的ALA含量从62.4％富集达到≥90％，具体步骤为：1.脂肪酶酶苏子油得混合脂肪酸，用尿素包络法分离成饱和脂肪酸和混合不饱和脂肪酸，得固相和液相；2.固相中萃取饱和脂肪酸，回收率61％；3.液相中萃取油酸、亚油酸和ALA，液相进行温度梯度冷冻，得固相和液相；4.固相中萃取油酸、亚油酸，收率59％；5.液相中萃取ALA，回收率51％，含量93.47％。本发明最突出的特点是将植物性油脂富集高纯度ALA，社会、经济效益尤为显著。

Description

一种紫苏子油酶解富集α-亚麻酸的方法

技术领域

本发明涉及生物酶技术和油脂精细化工络合、冷冻技术，属生物技术与精细化工相结合的一种紫苏子油酶解富集α-亚麻酸的方法。

背景技术

由于世界工业化对社会生态环境和人类健康的不利影响引起各国政府和人民越来越多的关注，从天然资源中分离纯化生物活性物质来调节人体的生理机能，预防各种慢性疾病，已成为食品科学、医学、营养学诸学科研究的热点。这类物质既具有一般食品的营养功能，又具有调节生理机能的功能，在功能性保健品领域已被广泛应用。α-亚麻酸(ALA)就是这类物质的代表。

α-亚麻酸(ALA)为全顺式9、12、15十八碳三烯酸，淡黄色或无色液体，溶点11.3℃，沸点230～232℃(17mm Hg)，相对密度0.9164，溶于乙醇、乙醚。主要代谢产物二十碳五烯酸(Eicosapentαenoαte EPA)、二十二碳六烯酸(Docαaαhexaenoate DHA)。ALA、EPA、DHA组成n-3系列不饱和脂肪酸(Polyunsatαyated fatty acid PUFA)。ALA是EPA和DHA的前体。EPA是体内三烯酸前列腺素(PGl₃TXA₃)的前体。DHA是大脑、视网膜、神经系统磷脂的主要成分。国际n-3PUFA专业协会1990年确认“ALA是对人体健康非常有益的必需脂肪酸”。1993年WHO/FAO联合声明：“鉴于ALA的重要性和人体普遍摄取不足的现状，建议专项补充ALA”。1998年国际营养协会(IBNA)确认：“二十一世纪脑营养食品就是ALA”。大量研究实验证实：ALA具有调节心脑血管、降低血脂、血压、调节脂质代谢、抗心律失常、抗炎症抗过敏反应、预防癌症、增强智力和视力等功效。据报导：国内年需纯度80％以上的ALA 2000吨左右。

在我国有一类富含α-亚麻酸的植物资源，对他们的研究已引起国内众多研究院所的高度重视，但在应用最新高新技术分离纯化得到高纯度α-亚麻酸方面我们同一些发达国家相比，我们还存在一定差距，往往只能将低纯度的产品以原料或中间体出售产品附加值低，资源消耗严重，而高纯度的产品往往需要进口。因此，分离纯化获得高纯度的α-亚麻酸是一项具有显著的社会、经济效益的大事。

紫苏(Perilla frutescens[L])是富含α-亚麻酸的植物之一。其别名红苏、赤苏、香苏，原产于喜马拉雅山和中国南部地区，为唇形科紫苏属唯一的一种草本植物，是一种世界性泛化种。中国种植应用紫苏已有2000年历史，药用紫苏子、紫苏叶、紫苏梗已列入药典。紫苏是国家卫生部首批颁布的60种药食植物之一。徐爱遐等对53种富含α-亚麻酸植物进行了系统检测，发现紫苏为9种含60％左右的ALA的植物之首。从种植、规模、市价诸因素比较，在9种植物中，认定紫苏、亚麻(Linaceoe usitatissinum)、杜仲(Eucommia ulmoides)是最具有开发价值的物种。近几十年来大量实验证明：紫苏富含油脂、蛋白质、挥发油、黄酮类化合物、维生素、微量元素。特别是富含有人体必需脂肪酸(EFA)ALA达60％，已成为研究开发ALA的首选物种。

发明内容

脂肪酸碳原子数相同而烯键不同导致的分离困难，是目前国内企业无法生产高纯度α-亚麻酸、尚未能突破的关键控制点。从本发明主要解决这个问题，从而产生高纯度α-亚麻酸，促进n-3PUFAs产业发展，建设环保型、节能型、高科技、高效益现代农业。

本发明的技术方案包括下列步骤：

紫苏子油酶解成混合脂肪酸。酶解条件：脂肪酶是由(condida Lipolytica(Hαrrisoa)Diddens et Lodder)AS2.3198、AS2.3199、AS2.3200三种之一生产发酵代谢的产物，用量为2000～3000u/g._oil，油水比1∶1～3，加紫苏子油4％的吐温-80(M_吐温/V_油)、0.1～0.5％十二烷基苯磺酸钠，调节PH 7.0～8.0，控温38～42℃，酶解48～52h，酶解度(DH)90～95％。酶解到终点，加入0.1～0.5％顺酐或H₂O₂、0.1～0.5％％活性碳粉末，加温至70～90℃，搅拌脱色60～90min，趁热用80～120目筛网抽滤，除去滤得滤液，自然冷却待油水分层明晰，从分液漏斗下部缓缓排放水层(水层提取甘油)，上部油层在70～90℃，0.1Mpα真空脱水60～90min，再加Na₂SO₄、CaCl₂、MgSO₄三种之一脱水，得混合脂肪酸。采用GC-9A气相色谱仪测定其混合脂肪酸组成含量：棕榈酸C_16.07.2％，硬脂酸C_18.07.6、油酸C_18.1n 15.1％、亚油酸C_18.2n 13.7％、亚麻酸C_18.3n 62.4％。理化性质：比重，按GB/T 1985测定为0.9245，折光率按BG/T 5527-1985测定为1.4748，碘值按GB/T5532-1985测定为185.3，皂化值按GB/T 5534-1985测定为190.0，酸值按GB/T 5530-1985测定为2.7。

混合脂肪酸采用尿素包络法分离为饱和脂肪酸和混和不饱和脂肪酸。由于脂肪酸种类不同，碳链长度和饱和程度不同，当尿素溶解于正己烷、乙醇混合有机溶剂中，遇到有机物时，尿素分子之间通过强大的氢键力在有机物分子周围形成宽大的六方晶系，即尿素包络物，呈长或短、粗或细的晶体。饱和脂肪酸与尿素形成稳定的包络物，而低不饱和脂肪酸包络物很不稳定，利用其特性将饱和脂肪酸和烯酸分离。溶剂为正己烷、甲醇和乙醇的混合溶剂、尿素为工业级。尿素包络条件：混合脂肪酸(V)∶尿素(M)∶溶剂(V)＝1∶0.5～3∶3～4.5。首先将尿素在60～70℃彻底溶解于有机溶剂后，调PH 2～3，控温60～80℃流加混合脂肪酸反应2～3h，移至冷冻器中进行第一次温度梯度冷冻，温度梯度0℃～-5℃～-10℃，每个梯度冷冻滞留时间4～6h，冷冻12～18h后经80～120目筛网抽滤得固相和液相。

从固相中萃取饱和脂肪酸。它包括按固相体积加入1～2倍溶剂，在60～70℃条件下反应60～90min，蒸发回收溶剂，留在罐内油层按油脂溶液体积加入0.5～1倍去离子水混合均匀，静置冷却至常温待油水分层清晰，从罐底部缓慢排放水层，将水层加热至100～110℃，待沸腾液中出现浑浊时，降温至40～60℃，尿素结晶形成后，过滤得尿素粗结晶体，重复一次得精品。尿素回收率80～85％左右；上层油水在80～90℃，0.1Mpα真空脱水60～90min，再用Na₂SO₄、CaCl₂、MgSO₄三种之一脱水得饱和脂肪酸C_16∶0、C_18∶0，回收率58～63％，其中含有2～3％的油酸。

从液相中逐级分离油酸、亚油酸。它包括将液相置于冷冻器，进行第二次温度梯度冷冻，冷冻温度梯度：0℃～-3℃～-7℃～-10℃，每个梯度滞留时间4～6h，冷冻过程序时间16～24h，经80～120目筛网抽滤再次得到固相和液相。

从第二次固相中萃取油酸亚油酸。它包括按固相体积加入1～2倍混合溶剂反萃取2～4h，蒸发回收溶剂。留存罐内油层，按油层容积加入0.2～0.5倍去离子水混匀，静置等油水分层明晰时，从罐底缓慢排放水层，水层按前面所述，得油酸、亚油酸混合脂肪酸，回收率55～60％，其中油酸占58～62％，亚油酸占38～42％。

从第二次液相中萃取ALA。它包括第二冷冻抽滤所得的液相，按液相体积加入1～2倍混合溶剂，反萃取2～4h，蒸馏回收溶剂，所剩油层在80～90℃，0.1Mpα真空脱水，最后用Na₂SO₄、CaCl₂、MgSO₄三种之一脱水得ALA。回收率50～55％，含量90～95％，其中含有2～3％的油酸。

本项技术紫苏子油酶解富集α-亚麻酸，由于ALA在紫苏子油中含量达62.4％，占主导成分。因此只实施了两次温度梯度冷冻。若油脂ALA组分降低，而饱和脂肪酸、油酸、亚油酸组分含量占据主导，相应的则必须进行第三次温度梯度冷冻。

本项发明技术采用酶法、尿素包络法、温度梯度冷冻法相结合，从紫苏子富集获得高纯度α-亚麻酸，其技术可开发多种油脂富集ALA，也可从多种油脂中萃取所需的某种脂肪酸。因此，本发明技术的科学性显著、实用性广泛，具有较高的经济价值。

具体实施方式

遵循研究实验为基础，中试获取参数，逐步实现规模化生产的实施原则。

实施例

一种紫苏子油酶解富集α-亚麻酸的实施步骤：

紫苏子油酶解成混合脂肪酸的方法：酶解条件为取100Kg紫苏子油，

酶耗量2.4×10⁷u，油水比1∶2，加入紫苏子油4％的吐温-80，0.1％十二烷基苯磺酸钠，0.1％冰乙酸。调节PH 7.0，控温40℃，酶解48h，检测酶解度(DH)≥90％。

酶解到终点后，加入1000ml顺酐，2000ml H₂O₂，1.5kg粉末活性碳，升温至80℃搅拌脱色2h，趁热抽滤，弃滤渣，得滤液，冷却至常温静置待油水分层明晰时，从分液漏斗底部排放甘油水。用石乳水调至PH7.5，升温至80℃，趁热抽滤，少量水洗涤石乳渣。合并滤液和洗液泵入浓缩罐，调压至0.1Mpa，110℃脱水。脱水后继续升温收集110～180℃馏出物即为粗甘油，粗甘油经脱色脱水处理即得约6Kg，纯度≥95％的甘油。甘油收率多少是检验酶解度的重要因素。上部油层调控至0.1Mpa、80～90℃真空脱水后，再用Na₂SO₄脱水，即得混合脂肪酸，经检测其成分为*：棕榈酸C_16.07.2％，硬脂酸C_18.07.6、油酸C_18.1n 15.1％、亚油酸C_18.02n 13.7％、亚麻酸C_18.3n 62.4％。本步骤存在未被酶解的残油，浓缩、脱色过程有耗省，总耗量10％左右。

尿素包络法与温度梯度冷冻法结合分离饱和脂肪酸和不饱和脂肪酸。反应条件为混合脂肪酸∶尿素∶溶剂为1∶1∶3(溶剂为正己烷和乙醇各占50％)，先将尿素在60℃溶解于溶剂中，流加混合脂肪酸，控温60～70℃反应2h，冷至常温，盛入冷冻器进行第一次温度梯度冷冻。冷冻过程为0℃～-5℃～-10℃，每个温度梯度滞留6h，观察上部油层清亮时，即可用80目筛网抽滤，得固相和液相。从固相中萃取饱和脂肪酸和回收尿素，从滤液中萃取不饱和脂肪酸。

从固相回收尿素和提取饱和脂肪酸，包括按固相体积加入2倍的混合溶剂反萃取，反萃取温度60℃，搅拌萃取2h，抽滤回收溶剂后，按萃取罐内的油层容积加入等量去离子水混合均匀，常温静置待油水分层明晰后，从分离漏斗下部排放水层，将水层转入浓缩罐，升温110℃，搅拌、真空脱水，待罐内溶液出现浑浊时，停止搅拌和加热，从夹层通入冷却水，其冷却过程就是尿素结晶过程，冷却温度决定尿素回收的多少，等尿素结晶成型后，抽滤得尿素粗品，再结晶一次得纯品，回收率85％。上层油层转入罐内，升温至105℃，真空脱水后再用Na₂SO₄脱水，得饱和脂肪酸C_16.0、C_18.0和油酸C_18.1n7.4kg。饱和脂肪酸回收率59％，含量96％。

从液相中分离油酸、亚油酸和ALA。它包括第一次冷冻抽滤的液相，置入冷却器进行第二次温度梯度冷冻，冷冻梯度：0℃～-3℃～-7℃～-10℃，前三个梯度滞留时间6h，最后一个冷冻8h，观察冷冻物固液分层明晰时同，真空抽滤得固相和液相。

从固相中萃取油酸、亚油酸和尿素。它包括按固相体积加入2倍的混合溶剂，反萃取4h，蒸发回收溶剂。油层加入其等量(以容积计)去离子水混合，静置待油水分层明晰后，从下部排放水溶液，依照前面回收尿素的操作回收尿素。回收量为尿素总投入量的10％左右，加上前面回收的85％的尿素，总回收率95％左右。油层在90℃、0.1Mpa真空脱水，90分钟后用Na₂SO₄脱水得油酸和亚油酸混合脂肪酸，总质量11.4kg，其中油酸占40％左右。

从液相中萃取ALA。它包括第二次冷冻抽滤的滤液(即液相)加入其体积2倍的混合溶剂反萃取4h，蒸馏回收溶剂后的油层在70℃、0.1Mpa真空脱水1h，最后用Na₂SO₄脱水得α-亚麻酸34.2kg，含量93.74％，油酸含量约1％，α-亚麻酸回收率51％。

本实例重复操作参数稳定可靠。因此，可逐级扩大规模进入工业化生产。

Claims

1.一种紫苏子油酶解富集α-亚麻酸的方法，它包括将含有棕榈酸C_16.0、硬脂酸C_18.0、油酸C_18.1n、亚油酸C_18.2n、α-亚麻酸C_18.3n的紫苏子油，经以下步骤，逐级分离获得饱和脂肪酸、油酸、亚油酸和α-亚麻酸：一、紫苏子油酶解成混合脂肪酸；二、采用尿素包络法将混合脂肪酸分离成饱和脂肪和混合不饱和脂肪酸；三、从固相中萃取饱和脂肪酸和回收尿素；四、从液相中分离油酸、亚油酸和α-亚麻酸；五、从固相萃取油酸和亚油酸；六、从液相中萃取高纯度的α-亚麻酸。

2.权利要求1所述的“一、紫苏子油酶解成混合脂肪酸”，它包括：酶的来源为解脂假丝酵母(condida Lipolytica(Harrisoa)Diddens et Lodder)AS2.3198、AS2.3199、AS2.3200三种之一生产发酵代谢的产物，用量为2000～3000u/g.oil，油水比1∶1～3，加紫苏子油2～6％的吐温-80(M_吐温/V_油)、0.1～0.5％十二烷基苯磺酸钠，调节PH 7.0～8.0，控温38～42℃，酶解48～52h，酶解度(DH)90～95％，酶解到终点，加入0.1～0.5％顺酐或H₂O₂、0.1～0.5％％活性碳粉末，加温至70～90℃，搅拌脱色60～90min，趁热用80～120目筛网抽滤，除去滤得滤液，自然冷却待油水分层明晰，从分液漏斗下部缓缓排放水层(水层提取甘油)，上部油层在70～90℃，0.1Mpa脱水60～90min，再加Na₂SO₄、CaCl₂、MgSO₄三种之一脱水，得混合脂肪酸。

3.权利要求1所述的“采用尿素包络法将混合脂肪酸分离成饱和脂肪和混合不饱和脂肪酸”，它包括对权利要求2所得的混合脂肪酸进行分离，尿素包络反应条件为混合脂肪酸∶尿素∶溶剂＝1∶0.5～3∶3～4.5，溶剂为正己烷、甲醇、乙醇的混合溶剂，在60～70℃将尿素溶解于溶剂中，流加混合脂肪酸反应2～3h，移至冷冻器进行第一次温度梯度冷冻。温度冷冻梯度从0℃～-5℃～-10℃，每个温度梯度滞留时间4～6h，冷冻12～18h后，冷冻液经80～120目筛网抽滤得固相和液相。

4.权利要求1所述的“从固相中萃取饱和脂肪酸和回收尿素”，它包括按权利3所得的固相体积加入1～2倍溶剂，在60～70℃条件下反应60～90min，蒸发回收溶剂，留在罐内油层按油脂溶液体积加入0.5～1倍的去离子水混合均匀，静置冷却至常温待油水分层清晰，从罐底部缓慢排放水层，将水层加热至100～110℃，待沸腾液中出现浑浊时，降温至40～60℃，尿素结晶形成后，过滤得尿素粗结晶体，重复一次得精品，尿素回收率80～85％左右；上层油水在80～90℃，0.1Mpa真空脱水60～90min，再用Na₂SO₄、CaCl₂、MgSO₄三种之一脱水得饱和脂肪酸C_16∶0、C_18∶0，回收率58～63％，其中含有2～3％的油酸。

5.权利要求1所述的“从液相中分离油酸、亚油酸和α-亚麻酸”，它包括将权利要求4所得的液相置于冷冻器，进行第二次温度梯度冷冻，冷冻温度梯度：0℃～-3℃～-7℃～-10℃，每个梯度滞留时间4～6h，冷冻时间16～24h，经80～120目筛网抽滤再次得到固相和液相。

6.权利要求1所述的“从固相萃取油酸和亚油酸”，它包括按权利要求5所得的固相体积加入1～2倍混合溶剂反萃取2～4h，蒸发回收溶剂，留存罐内油层的按其容积加入0.2～0.5倍去离子水混匀，静置等油水分层明晰时，从罐底缓慢排放水层，在80～90℃，0.1Mpa真空脱水60～90min，再用Na₂SO₄、CaCl₂、MgSO₄三种之一脱水得油酸、亚油酸混合脂肪酸，回收率55～60％。

7.权利要求1所述的“从液相中萃取高纯度的α-亚麻酸”，它包括按权利要求5所得的液相体积加入1～2倍混合溶剂，反萃取2～4h，蒸馏回收溶剂，所剩油层在80～90℃，0.1Mpa真空脱水，最后用Na₂SO₄、CaCl₂、MgSO₄三种之一脱水得ALA，回收率50～55％，含量90～95％，其中含有2～3％的油酸。

8.本项技术基于紫苏子油α-亚麻酸含量相对较高，而饱和脂肪酸、油酸、亚油酸的含量相对较低，故仅做了两次冷冻处理，若待处理油脂中亚油酸含量较高时，则富集α-亚麻酸须进行第三次温度梯度冷冻，将亚油酸萃取出去，才能获得高纯度的α-亚麻酸。