CN102618604A - 一种环脂肽化合物的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种发酵培养基，该培养基中含有：氨基酸或其衍生物0.5％-5.0％、难溶性有机氮源0.5-3.0％、碳源1.0％-10.0％。使用本发明培养基进行式I化合物的生物发酵，可以使发酵水平稳定地达到0.5g/L以上，最高可达到1.0g/l。采用Coleophoma empetri F-11899(FERM BP2635)的诱变后菌株，更是可达到1.5g/L。由于发酵水平高，在后处理过程中有机溶剂的用量相对减少，从而降低了生产成本，具有很高的经济价值，更符合工业化生产的需要。

Description

一种环脂肽化合物的制备方法
技术领域
本发明涉及一种生物合成环脂肽化合物的方法，具体地说，涉及一种生物发酵，制备式I化合物的方法。
背景技术
真菌感染已经成为免疫缺陷病人发病率和死亡率居高不下的主要原因。在过去的20年里，霉菌感染的发病率显著增加。真菌感染的高危人群包括重症病人，外科病人以及那些患有HIV感染，血癌和其它肿瘤疾病的病人。那些经过器官移植的病人同样是真菌感染的高危人群。
棘球白素作为一类新的抗真菌药物，在治疗由念珠菌或曲霉引起的感染方面效果良好。这类药物又以卡泊芬净和米卡芬净为代表。棘球白素类药物通过抑制1，3-β糖苷键的形成来抑制真菌，从而更好地减小了对人体的伤害，在高效的同时尽可能的降低了副作用，因此它们在使用过程中比传统抗真菌药更安全。
FK463(米卡芬净)是如式III所示的化合物，它是以式I化合物FR901379为前体通过酶解除掉侧链后得到式II化合物FR179642，然后经过化学修饰得到的。可见，要得到米卡芬净，式I化合物的发酵产量是关键。
但长期以来式I化合物的发酵一直停留在一个很低的水平，尽管人们都在为寻找一个廉价，高产的培养基而努力，但收效甚微。这就使得式I化合物的制备难度加大，成本提高，从而间接使FK463长期处于一个较高的价位。因此人们迫切需要一种廉价高效合成式I化合物的方法。
日本滕泽藤泽药业品工业株式会社在Improvement of FR901379production by mutant selection and medium optimization(Journal ofBioscience and Bioengineering，VOL 107No.5，530-534，2009)中以可溶性淀粉代替玉米淀粉降低灭菌后培养基的黏度，并加入硫酸盐和磷酸盐控制发酵过程中pH，得到了A-3培养基。之后此公司又在Scale-up fermentation ofechinocandin type antibiotic FR901379(Journal of Bioscience andBioengineering，VOL 109 No.2，138-144，2010)中对A-3培养基进行了进一步改进，在A-3培养基中加入了较高浓度的硫酸铵进一步降低黏度，并以玉米浆代替棉籽粉从而得到了一种使得式I化合物产量相对更高的培养基A-4。
但式I化合物产量还需更进一步的提高，且上述培养基的黏度依旧很高，而且发酵过程中菌体生长呈球状，不利于发酵过程中的溶氧控制及后续过滤操作。
本发明的作者通过创造性的思考和大量的试验，逐渐探索出了一种可以使式I化合物高产的培养基，而且用此培养基发酵时黏度低，溶氧容易控制，菌丝体不呈球状生长。
Figure BDA0000046339400000021
Figure BDA0000046339400000031
发明内容
本发明需要解决的技术难题是为式I化合物发酵生产菌提供一种可以使式I化合物更高产的培养基。
为此，发明人在摇瓶试验中首先选用小分子的有机物为碳源大大降低了培养基的黏度，并通过优化实验确定了本发明中的碳源物质的种类及其含量。从可能作为前体物质的角度考虑，作者通过添加各种氨基酸或其盐来提高其产式I化合物的能力，并通过优化确定了本发明中的氨基酸或其盐的种类及其含量。此外培养基还加入了酵母提取物和各种微量的金属离子，以提供菌体生长所需的微量元素和生长因子。通过上述对培养基的改进，菌株在摇瓶中产式I化合物的能力大大提高，且发酵液黏度很低，菌体非常容易过滤。
发明人将上述培养基放大到50L时菌体并不能正常生长，菌量较少且易结成球，式I化合物的产量也较低。发明人在排除了接种量、溶氧、搅拌剪切等原因后，通过添加难溶性有机氮源可以很好的解决此问题，于是通过进一步的优化试验确定了本发明中的有机氮源的种类及其含量。
通过上述对培养基的进一步改进，菌株在50L体系中产式I化合物的能力大大提高，且发酵液黏度很低，菌体非常容易过滤。发明人又将上述培养基放大到3000L，结果与50L体系中相同。
本发明所用的菌种为Coleophoma empetri F-11899(FERM BP2635)，以及通过诱变选育的菌株。例如但不限于中国专利申请CN201010587865.4中记载的诱变选育菌株，保藏号为CGMCC 4129。
发明人是在Coleophoma empetri F-11899(FERM BP2635)的基础上完成了本发明，并且发现该培养基同样适用于后续的多个诱变后菌株。
本发明所述制备式I化合物的培养基中必须含有如下基质：
(1)氨基酸或其盐；
(2)难溶性有机氮源；
(3)糖醇；
该培养基中需含有氨基酸或其盐，所述氨基酸为谷氨酸，脯氨酸，鸟氨酸，苏氨酸或其盐中的一种及一种以上的混合物，优选谷氨钠，脯氨酸。在培养基中的浓度在0.5-5.0wt％时效果特别好。
该培养基中需含有部分难溶性有机氮源，所述有机氮源可以是豆粕、大豆分离蛋白、花生粉、棉籽饼粉、黄豆饼粉一种及一种以上的混合物，优选棉籽饼粉、黄豆饼粉，花生粉等颗粒性的难溶有机氮源。在培养基中的浓度在0.5-3.0wt％时效果特别好。
该培养基中需含有糖醇作碳源，所述糖醇为丙三醇(甘油)、赤藓糖醇、木糖醇、核糖醇、阿拉伯糖醇、山梨醇、甘露醇和半乳糖醇中的一种或一种以上的混合物，优选山梨醇、甘露醇和半乳糖醇等己糖醇。在培养基中的浓度在1.0-10.0wt％时效果特别好，更优选的浓度为2.0-8.0wt％。
本发明培养基中还需含有一定量的其他基质，如酵母提取物，镁盐，硫酸盐及其它微量元素等。
在本发明的一个优选例中，所述的菌培养过程中还补加了糖醇和氨基酸或其盐。
其中，补加糖醇和氨基酸或其盐的时间优选在培养40-80小时。补加糖醇的量为每天0.5％-3％，补加氨基酸或其盐的量为每天0.1％-1％，以初始培养液的体积计。具体的补料时间和量需根据初始培养基中糖醇及氨基酸或其盐的含量来确定：初始培养基中含量高，补料的时间可以适当延迟，补料量适当减少；初始培养基中含量低，补料的时间可以适当提前，补料量适当增加。
本发明过程中所使用的种子培养基及部分工艺参数的控制参照文献Scale-up fermentation of echinocandin type antibiotic FR901379(Journalof Bioscience and Bioengineering，VOL 109 No.2，138-144，2010)中种子的培养方法和发酵工艺参数的控制。
本发明的主要优点在于：
1、本发明提供了一种可以使式I化合物发酵效价大幅提高的培养基，由于该培养基中式I化合物效价的提高，减少了提取及后处理过程中有机溶剂的使用量，减轻了对环境的破坏。
2、本发明提供了一种大大降低发酵黏度，并改善菌体生长形态的培养基，由于该培养基使黏度低并改善了菌体生长形态，易于发酵过程中溶氧控制，并且发酵后菌体非常容易过滤，降低了能耗和生产成本。
3、本发明使式I化合物发酵的产量大幅提高，从而降低了式I化合物及后续式II化合物和式III化合物的生产成本，更有益于式I化合物的工业化生产及式III化合物的推广。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究，通过传统的发酵培养基优化手段，获得的一种适合发酵生产式I化合物的培养基，在此种发酵培养基的基础上完成了本发明。
如本文所用，“如式I所示化合物”或“式I化合物”可以互换使用，都是指具有以下结构式的化合物或其药学上可接受的盐：
Figure BDA0000046339400000051
其中，R表示H或者药学上可接受的能形成加成盐的阳离子。
药学上可接受的盐优选：包括金属盐例如碱金属盐(如钠盐、钾盐)、碱土金属盐(如钙盐、镁盐等)、铵盐、与有机碱形成的盐(如三甲胺盐、三乙胺盐、吡啶盐、甲基吡啶盐、二环己铵盐、N，N’-二苄基乙二胺盐等)等、有机酸加成盐(如甲酸盐、乙酸盐、三氟乙酸盐、马来酸盐、酒石酸盐、甲磺酸盐、苯磺酸盐、甲苯磺酸盐等)、无机酸加成盐(如盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、硫酸盐、磷酸盐等)、与氨基酸(如精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸等)形成的盐等。
本发明所用的菌种为Coleophoma empetri F-11899(FERM BP2635)，以及通过诱变选育的菌株。例如但不限于中国专利申请CN201010587865.4中记载的诱变选育菌株，保藏号为CGMCC 4129。
本发明的生产方法，诱变选育菌株和发酵条件不同之外，其他条件与现有报道技术中生产式I化合物的方法基本相同，例如，式I化合物提取、纯化工艺。
本发明生产式I化合物的发酵条件，除含有上述必须营养元素，如氨基酸、难溶性有机氮源、糖醇以外，还需含有酵母提取物，镁盐，硫酸盐及其它微量元素等。在pH5.5至6.5(较佳地pH5.7-6.2)和20℃至30℃(较佳地23℃至28℃)条件下进行发酵。
一些优选的培养基如下：
斜面培养基采用马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)，其组成为：马铃薯30％，葡萄糖2％，琼脂1.5％。
种子培养基采用文献Scale-up fermentation of echinocandin typeantibiotic FR901379(Journal of Bioscience and Bioengineering，VOL 109No.2，138-144，2010)中的配方，其组成为，蔗糖1％，棉籽饼粉2％，干酵母1％蛋白胨1％，KH2PO4 0.2％，CaCO3 0.2％，消泡剂0.05％。
发酵培养基(比较例中)采用文献Scale-up fermentation of echinocandintype antibiotic FR901379(Journal of Bioscience and Bioengineering，VOL109 No.2，138-144，2010)中的配方，其组成为，可溶性淀粉12％，米糠油3％，玉米浆4％，(NH4)2SO4 1％，KH2PO4 0.5％，MgSO4·7H2O 0.2％，Adekanol LG-109 0.05％。
本发明中发酵培养基组成为：氨基酸或其盐(优选谷氨钠，脯氨酸)0.5-5.0wt％，难溶性有机氮源(优选黄豆饼粉、棉籽饼粉、花生粉)0.5-3.0wt％，糖醇(优选山梨醇、甘露醇和半乳糖醇)2.0-8.0wt％，(NH4)2SO40.1-1.0％，KH2PO4 0.1-0.5wt％，MgSO4·7H2O 0.02-0.2wt％，微量元素1.0-2.0wt％，消泡剂0.05wt％。
微量元素：FeSO4·7H2O 10g/L，MnSO4·H2O 10g/L，ZnSO4·7H2O 2g/L，CaCl2 0.7g/L，H3BO3 0.56g/L，CuCl2·2H2O 0.25g/L，(NH4)6Mo7O24·7H2O0.19g/L，浓盐酸500ml/L。
一种优选的发酵生产式I化合物的过程如下：
菌株Coleophoma empetri F-11899(FERM BP2635)或诱变菌株CGMCC 4129于25℃斜面上培养6-10天后即成熟，挑取成熟的菌丝体或孢子接入种子培养基，然后于25℃在摇床上以转速280RPM培养2-4天。
发酵培养基接入2-10％的种子培养液，然后在全自动发酵罐上培养，培养温度为23℃至28℃，pH维持在pH5.7-6.2。菌体生长至3-6天后，每天补入1-6％的碳源(糖醇，淀粉)，并同时补入1-4％的氮源(氨基酸如：脯氨酸、谷氨酸、苏氨酸等)，培养一般维持8-12天。
式I化合物的测定方法如下：
取一定体积的发酵液，加入2倍发酵液体积的甲醇，搅拌提取式I化合物，然后通过离心去除菌丝体，HPLC外标法测定提取液中式I化合物的含量。
实施例中式I化合物HPLC检测所用的方法：
在Waters分析性HPLC体系上进行分析。反相HPLC分析用于测定FR901379、PneumocandinB0及其它类似物。反相分析采用CALESIL ODS色谱柱(粒径5μm，4.6mmi.d×250mm)，并且保持在35℃。以50％乙腈/0.5％磷酸二氢铵水溶液作流动相，流速为1ml/分钟，并在210nm下UV检测。
实施例中发酵液粘度测定方法是本领域公知的方法：例如通过Brookfield粘度计进行测定。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则所有的百分数、比率、比例、或份数按重量计。
本发明中的重量体积百分比中的单位是本领域技术人员所熟知的，例如是指在100毫升的溶液中溶质的重量。
除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
实施例1
发酵菌种制备Coleophoma empetri F-11899(FERM BP2635)
参照文献Scale-up fermentation of echinocandin type antibioticFR901379(Journal of Bioscience and Bioengineering，VOL 109 No.2，138-144，2010)中种子的培养方法制备Coleophoma empetri F-11899(FERMBP2635)的种子液，以备后面式I化合物发酵之用。
斜面培养基采用马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)，其组成为：马铃薯30％，葡萄糖2％，琼脂1.5％。
种子培养基组成：蔗糖1％，棉籽饼粉2％，干酵母1％蛋白胨1％，KH2PO4 0.2％，CaCO3 0.2％，消泡剂0.05％。
菌株Coleophoma empetri F-11899(FERM BP2635)于25℃斜面上培养6-10天后即成熟，挑取成熟的菌丝体或孢子接入种子培养基，然后于25℃在摇床上以转速280RPM培养2-4天。
实施例2
发酵菌种制备(诱变菌株CGMCC 4129)
参照文献Scale-up fermentation of echinocandin type antibioticFR901379(Journal of Bioscience and Bioengineering，VOL 109 No.2，138-144，2010)中种子的培养方法制备诱变菌株CGMCC 4129的种子液，以备后面式I化合物发酵之用。
斜面培养基采用马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)，其组成为：马铃薯30％，葡萄糖2％，琼脂1.5％。
种子培养基组成：蔗糖1％，棉籽饼粉2％，干酵母1％蛋白胨1％，KH2PO4 0.2％，CaCO3 0.2％，消泡剂0.05％。
菌株CGMCC 4129于25℃斜面上培养6-10天后即成熟，挑取成熟的菌丝体或孢子接入种子培养基，然后于25℃在摇床上以转速280RPM培养2-4天。
实施例3
制备式I化合物
在250ml摇瓶中，加入50ml含有甘露醇浓度5％，酵母提取物浓度0.5％，L-脯氨酸浓度1％，棉籽饼粉浓度1％，硫酸铵浓度0.1％，硫酸镁浓度0.06％，微量元素溶液浓度0.1％，MES浓度2％的培养基，调pH为5.5±0.5，121℃灭菌30min，将实施例1中获得的种子1ml(2％)接种到该培养液中，25℃ 280r/m培养240小时结束培养，取样分析，最终培养液的粘度为2200cp，其中式I化合物的含量为0.5g/L。
微量元素：FeSO4·7H2O 10g/L，MnSO4·H2O 10g/L，ZnSO4·7H2O 2g/L，CaCl2 0.7g/L，H3BO3 0.56g/L，CuCl2·2H2O 0.25g/L，(NH4)6Mo7O24·7H2O0.19g/L，浓盐酸500ml/L。
实施例4
制备式I化合物
在250ml摇瓶中，加入50ml含有甘露醇浓度4％，谷氨酸钠浓度1％，苏氨酸浓度0.8％，黄豆饼粉浓度2％，酵母提取物浓度0.8％，硫酸铵浓度0.2％，硫酸镁浓度0.05％，微量元素溶液浓度0.1％，MES浓度2.5％的培养基，调pH为5.5±0.5，121℃灭菌30min，将实施例2中获得的种子1ml(2％)接种到该培养液中，25℃280r/m培养240小时结束培养，取样分析，最终培养液的粘度为2300cp，其中式I化合物的含量为1.94g/L。
微量元素：FeSO4·7H2O 10g/L，MnSO4·H2O 10g/L，ZnSO4·7H2O 2g/L，CaCl2 0.7g/L，H3BO3 0.56g/L，CuCl2·2H2O 0.25g/L，(NH4)6Mo7O24·7H2O0.19g/L，浓盐酸500ml/L。
实施例5
制备式I化合物
在50L的发酵罐中，加入29L自来水，600g黄豆饼粉(浓度2％)，2400g甘露醇(浓度8％)，600g L-脯氨酸(浓度2％)，240g酵母提取物(浓度0.8％)，30g硫酸氨(浓度0.1％)，12g硫酸镁(浓度0.04％)，30ml微量元素溶液(浓度0.1％)，用氢氧化钠或盐酸调pH为5.5±0.5，121℃灭菌30min，将实施例1中获得的种子接种到该培养液中，种子液体积为0.9L(3％)，得到30L培养液。控制通气量1-2vvm，溶氧80％以上，pH6.0±0.5，及培养温度25±5℃，培养至60小时，每天补加甘露醇1％，L-脯氨酸0.5％(以初始培养液的体积30L计)。培养240小时，结束培养，取样分析，最终培养液的粘度为4500cp，其中式I化合物的含量为0.50g/L。
微量元素：FeSO4·7H2O 10g/L，MnSO4·H2O 10g/L，ZnSO4·7H2O 2g/L，CaCl2 0.7g/L，H3BO3 0.56g/L，CuCl2·2H2O 0.25g/L，(NH4)6Mo7O24·7H2O0.19g/L，浓盐酸500ml/L。
实施例6
制备式I化合物
在50L的发酵罐中，加入29L自来水，150g黄豆饼粉(浓度0.5％)，300g甘露醇(浓度1％)，750g L-脯氨酸(浓度2.5％)，750g谷氨酸钠(浓度2.5％)，240g酵母提取物(浓度0.8％)，30g硫酸氨(浓度0.1％)，12g硫酸镁(浓度0.04％)，30ml微量元素溶液(浓度0.1％)，用氢氧化钠或盐酸调pH为5.5±0.5，121℃灭菌30min，将实施例1获得的种子接种到该培养液中，用量为0.9L(3％)，得到30L培养液。控制通气量1-2vvm，溶氧80％以上，pH6.0±0.5，及培养温度25±5℃，培养至40小时，每天补加甘露醇1.5％，L-脯氨酸0.8％(以初始培养液的体积30L计)。培养240小时，结束培养，取样分析，最终培养液的粘度为2300cp，其中式I化合物的含量为0.43g/L。
实施例7
制备式I化合物
在50L的发酵罐中，加入29L自来水，900g黄豆饼粉(浓度3.0％)，3000g甘露醇(浓度10％)，150g L-脯氨酸(浓度0.5％)，30g苏氨酸(浓度0.1％)，240g酵母提取物(浓度0.8％)，30g硫酸氨(浓度0.1％)，12g硫酸镁(浓度0.04％)，30ml微量元素溶液(浓度0.1％)，用氢氧化钠或盐酸调pH为5.5±0.5，121℃灭菌30min，将实施例1获得的种子接种到该培养液中，用量为0.9L(3％)，得到30L培养液。控制通气量1-2vvm，溶氧80％以上，pH6.0±0.5，及培养温度25±5℃，培养至80小时，每天补加甘露醇0.5％，L-脯氨酸1％(以初始培养液的体积30L计)。培养240小时，结束培养，取样分析，最终培养液的粘度为2600cp，其中式I化合物的含量为0.44g/L。
微量元素：FeSO4·7H2O 10g/L，MnSO4·H2O 10g/L，ZnSO4·7H2O 2g/L，CaCl2 0.7g/L，H3BO3 0.56g/L，CuCl2·2H2O 0.25g/L，(NH4)6Mo7O24·7H2O0.19g/L，浓盐酸500ml/L。
实施例8
制备式I化合物
在50L的发酵罐中，加入29L自来水，300g棉籽饼粉(浓度1.0％)，2400g甘露醇(浓度8.0％)，900g谷氨酸钠(浓度3.0％)，300g苏氨酸(浓度1.0％)，240g酵母提取物(浓度0.8％)，30g硫酸氨(浓度0.1％)，12g硫酸镁(浓度0.04％)，30ml微量元素溶液(浓度0.1％)，用氢氧化钠或盐酸调pH为5.5±0.5，121℃灭菌30min，将实施例1中式I化合物的种子接种到该培养液中，用量为0.9L(3％)，得到30L培养液。控制通气量1-2vvm，溶氧80％以上，pH6.0±0.5，及培养温度25±5℃，培养至60小时，每天补加甘露醇1％，苏氨酸0.3％(以初始培养液的体积30L计)，培养240小时，结束培养，取样分析，最终培养液的粘度为2100cp，其中式I化合物的含量为0.58g/L。
微量元素：FeSO4·7H2O 10g/L，MnSO4·H2O 10g/L，ZnSO4·7H2O 2g/L，CaCl2 0.7g/L，H3BO3 0.56g/L，CuCl2·2H2O 0.25g/L，(NH4)6Mo7O24·7H2O0.19g/L，浓盐酸500ml/L。
实施例9
制备式I化合物
在50L的发酵罐中，加入29L自来水，600g花生粉(浓度2％)，600g甘露醇(浓度2％)，600g L-脯氨酸(浓度2％)，240g酵母提取物(浓度0.8％)，30g硫酸氨(浓度0.1％)，12g硫酸镁(浓度0.04％)，30ml微量元素溶液(浓度0.1％)，用氢氧化钠或盐酸调pH为5.5±0.5，121℃灭菌30min，将实施例1中获得的种子接种到该培养液中，用量为0.9L(3％)，得到30L培养液。控制通气量1-2vvm，溶氧80％以上，pH6.0±0.3，及培养温度25±2℃，培养至50小时，每天补加甘露醇3％，L-脯氨酸0.5％(以初始培养液的体积30L计)。培养240小时，结束培养，取样分析，最终培养液的粘度为2900cp，其中式I化合物的含量为0.52g/L。
微量元素：FeSO4·7H2O 10g/L，MnSO4·H2O 10g/L，ZnSO4·7H2O 2g/L，CaCl2 0.7g/L，H3BO3 0.56g/L，CuCl2·2H2O 0.25g/L，(NH4)6Mo7O24·7H2O0.19g/L，浓盐酸500ml/L。
实施例10
制备式I化合物
在50L的发酵罐中，加入29L自来水，600g棉籽饼粉(浓度2％)，1800g甘露醇(浓度6％)，600g L-脯氨酸(浓度2％)，240g酵母提取物(浓度0.8％)，30g硫酸氨(浓度0.1％)，12g硫酸镁(浓度0.04％)，30ml微量元素溶液(浓度0.1％)，用氢氧化钠或盐酸调pH为5.5±0.5，121℃灭菌30min，用实施例2中获得的种子液，接种到该培养液中，用量为0.9L(3％)，得到30L培养液。控制通气量1-2vvm，溶氧80％以上，pH6.0±0.5，及培养温度25±2℃，培养至50小时，每天补加甘露醇1％，L-脯氨酸0.5％(以初始培养液的体积30L计)。培养240小时，结束培养，取样分析，最终培养液的粘度为2300cp，其中式I化合物的含量为2.5g/L。
微量元素：FeS04·7H2O 10g/L，MnSO4·H2O 10g/L，ZnSO4·7H2O 2g/L，CaCl2 0.7g/L，H3BO3 0.56g/L，CuCl2·2H2O 0.25g/L，(NH4)6Mo7O24·7H2O0.19g/L，浓盐酸500ml/L。
实施例11
制备式I化合物
在50L的发酵罐中，加入29L自来水，300g棉籽饼粉(浓度1％)，2400g山梨醇(浓度8％)，600g L-脯氨酸(浓度2％)，120g酵母提取物(浓度0.4％)，30g硫酸氨(浓度0.1％)，30g硫酸镁(浓度0.1％)，30ml微量元素溶液(浓度0.1％)，用氢氧化钠或盐酸调pH为5.5±0.5，121℃灭菌30mi n，用实施例2中获得的种子液，接种到该培养液中，用量为0.9L(3％)，得到30L培养液。控制通气量1-2vvm，溶氧80％以上，pH6.0±0.5，及培养温度25±2℃，培养至70小时，每天补加山梨醇1％，L-脯氨酸0.5％(以初始培养液的体积30L计)。培养240小时，结束培养，取样分析，最终培养液的粘度为2300cp，其中式I化合物的含量为2.0g/L。
微量元素：FeSO4·7H2O 10g/L，MnSO4·H2O 10g/L，ZnSO4·7H2O 2g/L，CaCl2 0.7g/L，H3BO3 0.56g/L，CuCl2·2H2O 0.25g/L，(NH4)6Mo7O24·7H2O0.19g/L，浓盐酸500ml/L。
实施例12
制备式I化合物
在50L的发酵罐中，加入29L自来水，600g棉籽饼粉(浓度2％)，2400g半乳糖醇(浓度8％)，300g谷氨酸钠(浓度1％)，120g酵母提取物(浓度0.4％)，60g硫酸氨(浓度0.2％)，15g硫酸镁(浓度0.05％)，30ml微量元素溶液(浓度0.1％)，用氢氧化钠或盐酸调pH为5.5±0.5，121℃灭菌30min，用实施例2中获得的种子液，接种到该培养液中，用量为0.9L(3％)，得到30L培养液。控制通气量1-2vvm，溶氧80％以上，pH6.0±0.5，及培养温度25±2℃，培养至60小时，每天补加半乳糖醇1％，谷氨酸钠0.5％(以初始培养液的体积30L计)。培养240小时，结束培养，取样分析，最终培养液的粘度为2600cp，其中式I化合物的含量为1.8g/L。
对比例1
在50L的发酵罐中，按照文献Scale-up fermentation of echinocandintype antibiotic FR901379(Journal of Bioscience and Bioengineering，VOL109 No.2，138-144，2010)中式I化合物的发酵方法，分别对Coleophomaempetri F-11899(FERM BP2635)以及诱变菌株CGMCC 4129进行培养，结果得到的最终培养液粘度分别为11000cp和9800cp，其中式I化合物的含量分别为0.2g/L和1.4g/L。
对比例2
在50L的发酵罐中，按照EP0431350B1实施例1中式I化合物的发酵方法，分别对Coleophoma empetri F-11899(FERM BP2635)以及诱变菌株CGMCC 4129进行培养，得到的最终培养液的粘度为10500cp和9400cp，其中式I化合物的分别为含量为0.14g/L和1.2g/L。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并非用以限定本发明的实质技术内容范围，本发明的实质技术内容是广义地定义于申请的权利要求范围中，任何他人完成的技术实体或方法，若是与申请的权利要求范围所定义的完全相同，也或是一种等效的变更，均将被视为涵盖于该权利要求范围之中。

Claims (11)

1.一种制备如式I所示化合物或其盐的方法，其特征在于，在含有氨基酸或其盐、难溶性有机氮源、糖醇作碳源的培养基中培养菌株Coleophomaempetri F-11899(FERM BP2635)或及其诱变菌株，获得式I化合物或其盐；
Figure FDA0000046339390000011
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述氨基酸为谷氨酸、脯氨酸、鸟氨酸、苏氨酸或其盐中的一种或一种以上的混合物。
3.如权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，以培养基的总重量计，所述氨基酸或其盐的浓度在0.5-5.0wt％。
4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述难溶性有机氮源为豆粕、大豆分离蛋白、花生粉、棉籽饼粉、黄豆饼粉中的一种或一种以上的的混合物。
5.如权利要求1或4所述的制备方法，其特征在于，以培养基的总重量计，所述难溶性有机氮源的浓度在0.5-3.0wt％。
6.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的糖醇为丙三醇(甘油)、赤藓糖醇、木糖醇、核糖醇、阿拉伯糖醇、山梨醇、甘露醇和半乳糖醇中的一种或一种以上的混合物。
7.如权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，以培养基的总重量计，所述糖醇的浓度在1.0-10.0wt％。
8.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述菌株的培养是在20℃至30℃，pH5.5至6.5下进行。
9.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的菌株培养过程中可以补加糖醇和氨基酸或其盐。
10.如权利要求9所述的制备方法，其特征在于，所述补加糖醇和氨基酸或其盐的时间是在培养40-80小时左右。
11.如权利要求9或10所述的制备方法，其特征在于，所述补加糖醇的量为每天0.5％-3％，补加氨基酸或其盐的量为每天0.1％-1％，以初始培养液的体积计。
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