CN102584846A - 一种抗甲型h1n1流感病毒的莪术醇衍生物 - Google Patents

Abstract

本发明属于医药技术领域，涉及通式（Ⅰ）所示的具有抗甲型H1N1流感病毒活性的新化合物，其中R₁和R₂如说明书中所定义。本发明还涉及所述化合物的用途和制备方法，以及这些化合物可以和药学上可接受的载体结合，制备临床上可接受的治疗甲型H1N1流感病毒感染性疾病的药物。通式（Ⅰ）的结构 （Ⅰ）

Description

一种抗甲型H1N1流感病毒的莪术醇衍生物

技术领域

本发明涉及医药技术领域，确切的说是涉及一种抗甲型H1N1流感病毒的莪术醇衍生物。

背景技术

流感（流行性感冒）是由流感病毒引起的严重危害人、畜禽健康的一种传染性强，传播速度快的急性病毒性呼吸道传染病，是一种典型的人畜共患病。医学界公认：流感的危害不亚于艾滋病和战争。流感所引起的并发症和死亡非常严重。据世卫组织(WHO)发布的公告，全球每年流感病例为 6亿-12亿例，死亡 50万-100万人，其中重症流感病例 300万-500万例，重症流感的病死率为 8%-10%。流感除造成大量人口发病及死亡外，还会给一个国家造成巨大经济损失和社会负担。据最新统计，仅美国每年因流感造成的经济损失高达 710亿-1670亿美元。因此可以说流感是严重威胁人类健康的疾病之一，流感的预防刻不容缓。

依据流感病毒核蛋白（NP）和基质蛋白（MP）抗原性差异可将流感病毒分为甲、乙、丙三型。其中甲型流感容易引起大规模流行，国内外关注的主要是甲型流感病毒。甲型流感病毒，根据表面抗原 HA 和 NA 的不同，可分为若干亚型，目前已发现 16 种HA（H1-H16）、9 种 NA（N1-N9）抗原（J Virol, 2005, 79：2814-2822）。2009年席卷全球的甲型H1N1流感，截至2010年1月，导致全球208个国家和地区报告了25万病例，其中12799人死亡。H1N1流感病毒以人为主要传染源，主要通过感染者咳嗽和打喷嚏等产生的飞沫或气溶胶经呼吸道传播，也可通过口、鼻腔、眼睛等处黏膜直接或间接接触传播（Annu Rev Immunol，2001，19：683-765）。

抗病毒化学药的研究起始于20世纪50年代，迄今为止仍然是治疗病毒性疾病的主要手段，但成效不显著，至今特异、有效的抗病毒化合物仍很少，而且抗病毒谱较狭窄，且极易产生耐药性。目前主要有两类抗流感病毒药物：一类是流感病毒神经氨酸酶抑制剂类，包括达菲和扎那米韦；另一类是金刚烷类，包括金刚烷胺和金刚乙胺。对于甲型H1N1流感治疗药物中临床非常有效的就是达菲即磷酸奥司他韦胶囊，它能够阻止病毒在受感染的人体内繁殖，而甲型H1N1流感病毒对金刚烷类药物具有抗药性。因此，治疗甲型H1N1流感的药物极其有限，而且由于现有药物在临床上的广泛应用，会使得病毒发生变异，从而产生不同程度的耐药性。而一些中药，如金银花、连翘、穿心莲、板蓝根、黄芩等（实用医药杂志，2007，14：3218-3219），具有较好的抗病毒作用，但药效成分的复杂性或不明确性，给临床用药带来潜在的安全性问题，特别是双黄连、鱼腥草等中药注射剂，时常可见临床上出现副作用的报道（药物流行病学杂志，2005，14: 148-151；药物流行病学杂志，2007，16：25-26）。因此，寻找高效、低毒的抗H1N1流感病毒的药物已成为医药界关注的课题。

中药莪术及其挥发油制剂作为抗病毒药物广泛应用于临床。2010版药典规定莪术醇为临床抗病毒药物莪术油质量控制的指标成分。药理学研究表明莪术醇具有抗病毒、抗肿瘤、保肝、抗早孕等多方面的作用。莪术醇具有与莪术油一致的药理活性，因此，莪术醇是莪术油的主要药效成分之一。但由于其水溶性很差，只易溶于乙醇、丙酮、氯仿等小极性有机溶剂中，长期以来一直未能开发为临床用药。鉴于其结构中化学可变化位点的局限，截止目前采用有机化学方法对它进行结构修饰的报道比较少。本课题组对莪术醇进行了化学结构修饰研究，并发现了具有良好抗甲型H1N1流感病毒的活性衍生物。

发明内容

本发明的首要目的在于提供新的莪术醇衍生物。

本发明的另一目的在于提供所述莪术醇衍生物的制备方法。

本发明的再一目的在于提供所述莪术醇衍生物在治疗甲型H1N1流感病毒感染性疾病方面的应用。

本发明所述的化合物具有通式Ⅰ的结构：

Ⅰ

其中，R₁代表芳香氧基、酰氧基、C_1-6环状脂肪氨基（包括含O、S等原子的杂环）、苄氨基；R₂代表OH或OAc。

本发明的新的莪术醇衍生物的化学名称和化学结构式优选如下：

 (1S, 4S, 5S, 7S, 8R)-5, 8-环氧-9,10-烯-14-对醛基苯氧基愈创木醇 (1)

(1S, 4S, 5S, 7S, 8R)-5, 8-环氧-9, 10-烯-8-羟基-14-愈创木醇乙酸酯 (2)

                                                          

(1S, 4S, 5S, 7S, 8R)-5, 8-环氧-9, 10-烯-8-羟基-14-愈创木醇琥珀酸酯 (3)

(1S, 4S, 5S, 7S, 8R)-5, 8-环氧-9, 10-烯-8, 14-愈创木二醇乙酸酯(4)

  

(1S, 4S, 5S, 7S, 8R)-5, 8-环氧-9, 10-烯-14-四氢吡咯基愈创木醇 (5)

(1S, 4S, 5S, 7S, 8R)-5, 8-环氧-9, 10-烯-14-哌啶基愈创木醇 (6)

(1S, 4S, 5S, 7S, 8R)-5, 8-环氧-9, 10-烯-14-N-甲基哌嗪基愈创木醇 (7)

(1S, 4S, 5S, 7S, 8R)-5, 8-环氧-9, 10-烯-14-吗啉基愈创木醇 (8)

(1S, 4S, 5S, 7S, 8R)-5, 8-环氧-9, 10-烯-14-硫代吗啉基愈创木醇 (9)

(1S, 4S, 5S, 7S, 8R)-5, 8-环氧-9,10-烯-14-对甲氧基苄氨基愈创木醇 (10)

本发明提供了上述化合物的制备方法：

莪术醇在m-CPBA的作用下，得到了14位双键环氧化后，在碱性条件下，通过开环脱水，形成了关键的中间体(1S, 4S, 5S, 7S, 8R)-5, 8-环氧-9, 10-烯-8, 14-愈创木二醇，在此中间体的基础上，直接合成上述化合物3和4；并将中间体醇羟基转化为反应活性比较高的卤代烃，设计并合成了上述化合物1-2和5-10。

所述莪术醇衍生物可以作为甲型H1N1流感病毒感染疾病的治疗药物。

所述抗H1N1流感病毒药物含有治疗有效量的上述莪术醇衍生物和药学上可接受的载体。

本发明莪术醇衍生物可与药学意义上可用的各种辅料制成各种常规制剂和剂型，采用口服、胃肠外（例如，肌内、腹膜内、静脉内、脑池内注射或者输注、皮下注射或者植入，或通过吸入喷雾剂，或经鼻、阴道、直肠、舌下或者局部给药途径）给药的方式，例如，可为片剂、酊剂、含水或油混悬剂、可分散性粉剂、颗粒剂、乳剂、糖浆剂、注射剂、硬胶囊或者软胶囊等，用于治疗抗甲型H1N1流感病毒感染疾病。

本发明相对现有技术具有如下的优点及效果：

（1）提供了新的抗甲型H1N1流感病毒的化合物，其中化合物4和8抗甲型H1N1流感病毒活性较达菲更强；（2）本发明上述化合物的制备工艺简单，药品纯度高、质量稳定，易于进行大规模工业生产，具有良好的研究开发前景。

具体实施方式

本发明可通过下面的实施例加以说明。

实施例1：本发明化合物(1)的制备

中间体的制备：

    将m-CPBA(17.2g，1mol)溶解于二氯甲烷(100ml)中，0℃下加入到莪术醇(11.8g，0.05mol)的二氯甲烷(100ml)溶液中，保持0℃搅拌2小时。反应结束后，反应液用NaOH(2mol/l)溶液萃取3次，合并有机相，再用水萃取至中性，无水硫酸钠干燥。将溶液浓缩蒸干，得粗品经硅胶柱色谱纯化(环己烷∶乙酸乙酯=50∶1～10∶1)得到白色蜡状固体10, 14-环氧莪术醇11.95g，收率95%。

将10，14-环氧莪术醇(10.08g，0.04mol)溶解于乙腈中(600ml)中，室温下加入三水高氯酸锂(6.4g，0.04mol)，二乙胺(20ml)。所得混合物加热回流过夜。反应液浓缩蒸干，用等体积的乙酸乙酯和水萃取3次，合并有机相，无水硫酸钠干燥。将溶液浓缩蒸干，得粗品经硅胶柱色谱纯化(环己烷∶乙酸乙酯=10∶1～4∶1)得白色针状结晶(1S, 4S, 5S, 7S, 8R)-5, 8-环氧-9, 10-烯-8, 14-愈创木二醇3.04g，收率30%。化合物的波谱数据如下：MS(ESI) m/z: 275.2 [M+Na]⁺；¹H-NMR (300 MHz, CDCl₃) δ (ppm)：1.98 (1H, dd, J=9.2, 15.3Hz, H-1)、1.89 (1H, m, H-2a), 1.52 (1H, m, H-2b)、1.89 (1H, m, H-3a)、1.56 (1H, m, H-3b)、1.80 (1H, m, H-4)、2.19 (1H, dd, J=11, 12.6Hz, H-6a)、1.23 (1H, dd, J=7.3, 12.6Hz, H-6B)、1.65 (1H, dd, J=3.2, 10.6Hz, H-7)、5.8 (1H, s, H-9)、1.45 (1H, m, H-11)、0.85 (3H, d, J=6.4Hz, H-12)、0.98 (3H, d, J=6.4Hz, H-13)、4.06 (2H, brs, H-14)、1.00 (3H, d, J=5.3Hz, H-15)；¹³C-NMR (75 MHz, CDCl₃) δ (ppm)：49.8 (C-1)、27.8 (C-2)、31.4 (C-3)、40.4 (C-4)、87.4 (C-5)、36.6 (C-6)、59.6 (C-7)、103.7 (C-8)、123.8 (C-9)、144.1 (C-10)、31.0 (C-11)、22.8 (C-12)、21.6 (C-13)、64.6 (C-14)、11.9 (C-15)。

将(1S,4S,5S,7S,8R)-5, 8-环氧-9, 10-烯-8, 14-愈创木二醇(2.52g, 0.01mol)，三苯基膦(5.24g，0.02mol)依次加入到CCl₄/CH₂Cl₂(1∶1，400ml)。所得混合物加热回流3小时。反应液浓缩蒸干，得粗品经硅胶柱色谱纯化(环己烷∶乙酸乙酯=50∶1～10∶1)得白色油状化合物(1S, 4S, 5S, 7S, 8R)-5, 8-环氧-9, 10-烯-14-氯代愈创木醇2.56g，收率95%。

目标化合物(1)的制备：

将(1S, 4S, 5S, 7S, 8R)-5, 8-环氧-9,10-烯-14-氯代愈创木醇(27mg，0.1mmol)溶解于丙酮(4ml)中，加入对羟基苯甲醛(14.6mg，0.12mmol)，无水碳酸钾(20.7mg，0.15mmol)，碘化钾(5mg，0.03mmol)。所得混合物加热回流3小时。反应液浓缩蒸干，所得粗品经PTLC纯化(环己烷∶乙酸乙酯=2.5∶1，乙酸乙酯洗脱)得无色油状化合物(1S, 4S, 5S, 7S, 8R)-5, 8-环氧-9,10-烯-14-对醛基苯氧基愈创木醇 (1) 28.8mg，收率81%。化合物的波谱数据如下：MS(ESI) m/z: 379.0 [M+Na]⁺；¹H-NMR (300 MHz, CDCl₃) δ (ppm)：2.08 (1H, t, 8.3Hz, H-1)、1.91 (1H, m, H-2a)、1.60 (1H, m, H-2b)、1.91 (1H, m, H-3a)、1.61 (1H, m, H-3b)、1.83 (1H, m, H-4)、2.20 (1H, dd, J=10.9, 12.6Hz, H-6a)、1.20 (1H, dd, J=7.3, 12.7Hz, H-6b)、1.65 (1H, dd, J=3.1, 10.4Hz, H-7)、5.93 (1H, s, H-9)、1.41 (1H, m, H-11)、0.83 (3H, d, J=6.5Hz, H-12)、0.96 (3H, d, J=6.5Hz, H-13)、4.52 (2H, brs, H-14)、1.00 (3H, d, J=6.4Hz, H-15)、6.99 (2H, d, J=8.7Hz, H-2′, H-6′)、7.80 (2H, d, J=8.7Hz, H-3′, H-5′)、9.86(1H, s, -CHO)；¹³C-NMR (75 MHz, CDCl₃) δ (ppm)：49.7 (C-1)、27.6 (C-2)、31.3 (C-3)、40.4 (C-4)、87.3 (C-5)、36.6 (C-6)、59.9 (C-7)、103.5 (C-8)、127.3 (C-9)、139.3 (C-10)、31.0 (C-11)、22.8 (C-12)、21.5 (C-13)、69.9 (C-14)、11.9 (C-15)、163.8 (C-1′)、115.3 (C-2′, C-6′)、132.1 (C-3′, C-5′)、130.3 (C-4′)、191.0 (CHO)。

 

实施例2：本发明化合物(2)的制备

中间体的制备：同实施例1中中间体的制备方法。 

目标化合物(2)的制备：

将(1S, 4S, 5S, 7S, 8R)-5, 8-环氧-9, 10-烯-14-氯代愈创木醇(27mg，0.1mmol)溶解于DMF(2ml)中，加入醋酸钠(12.3mg，0.15mmol)。所得混合物70℃反应3.5小时。反应液浓缩蒸干，所得粗品经PTLC纯化(环己烷∶乙酸乙酯=3∶1，乙酸乙酯洗脱)得无色油状化合物(1S, 4S, 5S, 7S, 8R)-5, 8-环氧-9, 10-烯-8-羟基-14-愈创木醇乙酸酯(2) 21.2mg，收率72%。化合物的波谱数据如下：MS(ESI) m/z: 317.0 [M+Na]⁺；¹H-NMR (300 MHz, CDCl₃) δ (ppm)：1.96 (1H, dd, J=8.8, 16.4Hz, H-1)、1.87 (1H, m, H-2a)、1.56 (1H, m, H-2b)、1.87 (1H, m, H-3a)、1.56 (1H, m, H-3b)、1.80 (1H, m, H-4)、2.19 (1H, dd, J=10.7, 12.6Hz, H-6a)、1.22 (1H, dd, J=7.4, 12.6Hz, H-6b)、1.62 (1H, dd, J=3.3, 10.6Hz, H-7)、5.81 (1H, s, H-9)、1.45 (1H, m, H-11)、0.86 (3H, d, J=6.5Hz, H-12)、0.97 (3H, d, J=6.5Hz, H-13)、4.49 (2H, dd, J=13.5, 24.9Hz, H-14)、1.00 (3H, d, J=4.8Hz, H-15)、2.07 (3H,s, -CH₃)；¹³C-NMR (75 MHz, CDCl₃) δ (ppm)：49.9 (C-1)、27.6 (C-2)、31.3 (C-3)、40.4 (C-4)、87.3 (C-5)、36.6 (C-6)、59.9 (C-7)、103.4 (C-8)、126.5 (C-9)、139.2 (C-10)、30.9 (C-11)、22.8 (C-12)、21.6 (C-13)、65.6 (C-14)、11.9 (C-15)、170.9 (C=O)、21.1 (-CH₃)。

 

实施例3：本发明化合物(3)的制备

中间体的制备：同实施例1中中间体(1S, 4S, 5S, 7S, 8R)-5, 8-环氧-9, 10-烯-8, 14-愈创木二醇的制备方法。 

目标化合物(3)的制备：

将(1S, 4S, 5S, 7S, 8R)-5, 8-环氧-9, 10-烯-8, 14-愈创木二醇(25.2mg，0.1mmol)溶解于无水吡啶(4ml)中，加入丁二酸酐(15mg，0.15mmol)，DMAP(2.5mg，0.02mmol)。所得混合物70℃反应2小时。反应液浓缩蒸干，所得粗品经PTLC纯化(环己烷∶乙酸乙酯=2∶1，乙酸乙酯洗脱)得无色油状化合物(1S, 4S, 5S, 7S, 8R)-5, 8-环氧-9, 10-烯-8-羟基-14-愈创木醇琥珀酸酯(3) 24.6mg，收率71%。化合物的波谱数据如下：MS(ESI) m/z: 361.2 [M+Na]⁺；¹H-NMR (300 MHz, CDCl₃) δ (ppm)：1.95 (1H, dd, J=8.8, 16.3Hz, H-1)、1.86 (1H, m, H-2a)、1.52 (1H, m, H-2b)、1.86 (1H, m, H-3a)、1.52 (1H, m, H-3b)、1.80 (1H, m, H-4)、2.18 (1H, dd, J=11.2, 12.3Hz, H-6a)、1.21 (1H, dd, J=7.2, 12.3Hz, H-6b)、1.65 (1H, dd, J=3.1, 10.5Hz, H-7)、5.82 (1H, s, H-9)、1.43 (1H, m, H-11)、0.84 (3H, d, J=6.5Hz, H-12)、0.96 (3H, d, J=6.5Hz, H-13)、4.52 (2H, dd, J=13.4, 26.0Hz, H-14)、0.98 (3H, d, J=4.6Hz, H-15)、2.64 (4H, brs, -CH₂-)；¹³C-NMR (75 MHz, CDCl₃) δ (ppm)：50.0 (C-1)、27.6 (C-2)、31.2 (C-3)、40.4 (C-4)、87.7 (C-5)、36.5 (C-6)、59.3 (C-7)、103.7 (C-8)、127.0 (C-9)、138.8 (C-10)、30.9 (C-11)、22.8 (C-12)、21.5 (C-13)、65.9 (C-14)、11.8 (C-15)、177.3 (C=O)、172.0 (C=O)、29.1 (-CH₂-)。

实施例4：本发明化合物(4)的制备

中间体的制备：同实施例1中中间体(1S, 4S, 5S, 7S, 8R)-5, 8-环氧-9, 10-烯-8, 14-愈创木二醇的制备方法。  

目标化合物(4)的制备：

将(1S, 4S, 5S, 7S, 8R)-5, 8-环氧-9, 10-烯-8, 14-愈创木二醇(25.2mg，0.1mmol)溶解于无水吡啶(4ml)中，加入乙酸酐(30μl)，DMAP(2.5mg，0.02mmol)。所得混合物70℃反应2小时。反应液浓缩蒸干，所得粗品经PTLC纯化(环己烷∶乙酸乙酯=5∶1，乙酸乙酯洗脱)得无色油状化合物(1S, 4S, 5S, 7S, 8R)-5, 8-环氧-9, 10-烯-8, 14-愈创木二醇乙酸酯(4) 28.8mg，收率86%。化合物的波谱数据如下：¹H-NMR (300 MHz, CDCl₃) δ (ppm)：1.95 (1H, dd, J=8.5, 17.2Hz, H-1)、1.85 (1H, m, H-2a)、1.60 (1H, m, H-2b)、1.85 (1H, m, H-3a)、1.61 (1H, m, H-3b)、1.82 (1H, m, H-4)、2.15 (1H, dd, J=10.7, 12.6Hz, H-6a)、1.18 (1H, dd, J=7.4, 12.6Hz, H-6b)、1.62 (1H, dd, J=3.3, 10.6Hz, H-7)、5.85 (1H, s, H-9)、1.48 (1H, m, H-11)、0.86 (3H, d, J=6.6Hz, H-12)、0.90 (3H, d, J=6.6Hz, H-13)、4.49 (2H, dd, J=13.2, 21.3Hz, H-14)、0.98 (3H, d, J=6.1Hz, H-15)、2.04 (3H,s, -CH₃)、2.06 (3H,s, -CH₃)；¹³C-NMR (75 MHz, CDCl₃) δ (ppm)：49.8 (C-1)、27.7 (C-2)、31.2 (C-3)、40.4 (C-4)、88.9 (C-5)、35.2 (C-6)、57.5 (C-7)、105.5 (C-8)、126.1 (C-9)、136.3 (C-10)、30.5 (C-11)、22.7 (C-12)、21.4 (C-13)、65.9 (C-14)、11.8 (C-15)、170.9 (C=O)、168.6 (C=O)、21.2 (-CH₃)、22.3(-CH₃)。

实施例5：本发明化合物(5)的制备

中间体的制备：同实施例1中中间体的制备方法。

目标化合物(5)的制备：

将(1S, 4S, 5S, 7S, 8R)-5, 8-环氧-9, 10-烯-14-氯代愈创木醇(27mg，0.1mmol)溶解于DMF(2ml)中，加入四氢吡咯(50μl)。所得混合物70℃反应过夜。反应液浓缩蒸干，所得粗品经PTLC纯化(环己烷∶乙酸乙酯=1∶1，乙酸乙酯洗脱)得白色蜡状固体(1S, 4S, 5S, 7S, 8R)-5, 8-环氧-9, 10-烯-14-四氢吡咯基愈创木醇 (5) 25.9mg，收率85%。化合物的波谱数据如下：MS(ESI) m/z: 306.1 [M+H]⁺；¹H-NMR (300 MHz, CDCl₃) δ (ppm)：2.10 (1H, t, J=8.5Hz, H-1)、1.86 (1H, m, H-2a)、1.50 (1H, m, H-2b)、1.86 (1H, m, H-3a)、1.54 (1H, m, H-3b)、1.79 (1H, m, H-4)、2.18 (1H, dd, J=10.7, 12.5Hz, H-6a)、1.20 (1H, dd, J=7.3, 12.5Hz, H-6b)、1.62 (1H, dd, J=3.2, 10.6Hz, H-7)、5.71 (1H, s, H-9)、1.44 (1H, m, H-11)、0.86 (3H, d, J=6.4Hz, H-12)、0.97 (3H, s, H-13)、3.27 (1H, J=13.2Hz, H-14a)、2.65 (1H, J=13.2Hz, H-14b)、1.00 (3H, s, H-15)、2.44 (4H, brs, N-1)、1.76 (4H, brs, N-2)；¹³C-NMR (75 MHz, CDCl₃) δ (ppm)：50.6 (C-1)、27.8 (C-2)、31.2 (C-3)、40.5 (C-4)、87.0 (C-5)、36.8 (C-6)、59.8 (C-7)、103.5 (C-8)、125.6 (C-9)、143.3 (C-10)、31.2 (C-11)、23.0 (C-12)、21.6 (C-13)、60.7 (C-14)、12.0 (C-15)、54.7 (N-1)、23.7 (N-2)。

实施例6：本发明化合物(6)的制备

中间体的制备：同实施例1中中间体的制备方法。 

目标化合物(6)的制备：

将(1S, 4S, 5S, 7S, 8R)-5, 8-环氧-9, 10-烯-14-氯代愈创木醇(27mg，0.1mmol)溶解于DMF(2ml)中，加入哌啶(50μl)。所得混合物70℃反应过夜。反应液浓缩蒸干，所得粗品经PTLC纯化(环己烷∶乙酸乙酯=1∶1，乙酸乙酯洗脱)得白色蜡状固体(1S, 4S, 5S, 7S, 8R)-5, 8-环氧-9, 10-烯-14-哌啶基愈创木醇(6) 12.7mg，收率63%。化合物的波谱数据如下：MS(ESI) m/z: 320.2 [M+H]⁺；¹H-NMR (300 MHz, CDCl₃) δ (ppm)：2.06 (1H, t, J=8.2Hz, H-1)、1.87 (1H, m, H-2a)、1.51 (1H, m, H-2b)、1.87 (1H, m, H-3a)、1.54 (1H, m, H-3b)、1.80 (1H, m, H-4)、2.18 (1H, dd, J=10.7, 12.6Hz, H-6a)、1.20 (1H, dd, J=7.3, 12.6Hz, H-6b)、1.62 (1H, m, H-7)、5.71 (1H, s, H-9)、1.45 (1H, m, H-11)、0.86 (3H, d, J=6.5Hz, H-12)、0.97 (3H, s, H-13)、2.98 (1H, J=13.5Hz, H-14a)、2.64 (1H, J=13.5Hz, H-14b)、1.00 (3H, s, H-15)、2.30 (4H, brs, N-1)、1.54 (4H, m, N-2)、1.41 (2H, m, N-3)；¹³C-NMR (75 MHz, CDCl₃) δ (ppm)：50.9 (C-1)、27.7 (C-2)、31.3 (C-3)、40.4 (C-4)、87.0 (C-5)、36.8 (C-6)、59.9 (C-7)、103.5 (C-8)、126.0 (C-9)、142.5 (C-10)、31.2 (C-11)、22.9 (C-12)、21.6 (C-13)、63.4 (C-14)、12.0 (C-15)、55.0 (N-1)、26.0 (N-2)、24.5 (N-3)。

 

实施例7：本发明化合物(7)的制备

中间体的制备：同实施例1中中间体的制备方法。 

目标化合物(7)的制备：

将(1S, 4S, 5S, 7S, 8R)-5, 8-环氧-9, 10-烯-14-氯代愈创木醇(27mg，0.1mmol)溶解于DMF(2ml)中，加入N-甲基哌嗪(50μl)。所得混合物70℃反应过夜。反应液浓缩蒸干，所得粗品经PTLC纯化(环己烷∶乙酸乙酯=1∶1，乙酸乙酯洗脱)得白色蜡状固体(1S, 4S, 5S, 7S, 8R)-5, 8-环氧-9, 10-烯-14-N-甲基哌嗪基愈创木醇(7) 23.7mg，收率71%。化合物的波谱数据如下：MS(ESI) m/z: 335.1 [M+H]⁺；¹H-NMR (300 MHz, CDCl₃) δ (ppm)：2.03 (1H, t, J=8.9Hz, H-1)、1.86 (1H, m, H-2a)、1.47 (1H, m, H-2b)、1.86 (1H, m, H-3a)、1.50 (1H, m, H-3b)、1.80 (1H, m, H-4)、2.18 (1H, dd, J=10.8, 12.5Hz, H-6a)、1.16 (1H, dd, J=7.3, 12.5Hz, H-6b)、1.62 (1H, dd, J=3.1, 10.5Hz, H-7)、5.71 (1H, s, H-9)、1.40 (1H, m, H-11)、0.85 (3H, d, J=6.5Hz, H-12)、0.97 (3H, s, H-13)、3.00 (1H, J=13.5Hz, H-14a)、2.68 (1H, J=13.5Hz, H-14b)、0.99 (3H, s, H-15)、2.42 (4H, brs, N-1)、2.42 (4H, brs, N-2)、2.26 (3H, s, N-3)；¹³C-NMR (75 MHz, CDCl₃) δ (ppm)：50.9 (C-1)、27.6 (C-2)、31.4 (C-3)、40.5 (C-4)、86.9 (C-15)、36.9 (C-6)、59.8 (C-7)、103.4 (C-8)、126.7 (C-9)、141.8 (C-10)、31.2 (C-11)、23.0 (C-12)、21.6 (C-13)、62.5 (C-14)、12.1 (C-15)、55.3 (N-1)、55.3 (N-2)、46.2 (N-3)。

实施例8：本发明化合物(8)的制备

中间体的制备：同实施例1中中间体的制备方法。 

目标化合物(8)的制备：

将(1S, 4S, 5S, 7S, 8R)-5, 8-环氧-9, 10-烯-14-氯代愈创木醇(27mg，0.1mmol)溶解于DMF(2ml)中，加入吗啉(50μl)。所得混合物70℃反应过夜。反应液浓缩蒸干，所得粗品经PTLC纯化(环己烷∶乙酸乙酯=1∶1，乙酸乙酯洗脱)得白色蜡状固体(1S, 4S, 5S, 7S, 8R)-5, 8-环氧-9, 10-烯-14-吗啉基愈创木醇(8) 28.6mg，收率89%。化合物的波谱数据如下：MS(ESI) m/z: 322.2 [M+H]⁺；¹H-NMR (300 MHz, CDCl₃) δ (ppm)：2.05 (1H, t, J=8.7Hz, H-1)、1.89 (1H, m, H-2 a)、1.50 (1H, m, H-2b)、1.89 (1H, m, H-3a)、1.52 (1H, m, H-3b)、1.80 (1H, m, H-4)、2.18 (1H, dd, J=10.7, 12.6Hz, H-6a)、1.18 (1H, dd, J=7.4, 12.6Hz, H-6b)、1.62 (1H, dd, J=3.2, 10.6Hz, H-7)、5.73 (1H, s, H-9)、1.39 (1H, m, H-11)、0.86 (3H, d, J=6.5Hz, H-12)、0.97 (3H, s, H-13)、3.00 (1H, J=13.5Hz, H-14a)、2.68 (1H, J=13.5Hz, H-14b)、0.99 (3H, s, H-15)、2.37 (4H, brs, N-1)、3.68 (4H, brs, N-2)；¹³C-NMR (75 MHz, CDCl₃) δ (ppm)：50.9 (C-1)、27.7 (C-2)、31.4 (C-3)、40.5 (C-4)、87.0 (C-5)、36.9 (C-6)、59.9 (C-7)、103.5 (C-8)、126.8 (C-9)、141.4 (C-10)、31.2 (C-11)、22.9 (C-12)、21.6 (C-13)、63.0 (C-14)、12.0 (C-15)、54.0 (N-1)、67.2 (N-2)。

实施例9：本发明化合物(9)的制备

中间体的制备：同实施例1中中间体的制备方法。 

目标化合物(9)的制备：

将(1S, 4S, 5S, 7S, 8R)-5, 8-环氧-9, 10-烯-14-氯代愈创木醇(27mg，0.1mmol)溶解于DMF(2ml)中，加入硫代吗啉(50μl)。所得混合物70℃反应过夜。反应液浓缩蒸干，所得粗品经PTLC纯化(环己烷∶乙酸乙酯=1∶1，乙酸乙酯洗脱)得白色蜡状固体(1S, 4S, 5S, 7S, 8R)-5, 8-环氧-9, 10-烯-14-硫代吗啉基愈创木醇(9) 29.3mg，收率87%。化合物的波谱数据如下：MS(ESI) m/z: 338.2 [M+H]⁺；¹H-NMR (300 MHz, CDCl₃) δ (ppm)：2.00 (1H, brs, H-1)、1.86 (1H, m, H-2a)、1.50 (1H, m, H-2b)、1.86 (1H, m, H-3a)、1.52 (1H, m, H-3b)、1.79 (1H, m, H-4)、2.18 (1H, t, J=11.4Hz, H-6a)、1.13 (1H, dd, J=7.5, 12.7Hz, H-6b)、1.60 (1H, d, J=7.6, H-7)、5.71 (1H, s, H-9)、1.39 (1H, m, H-11)、0.86 (3H, d, J=6.5Hz, H-12)、0.97 (3H, s, H-13)、2.95 (1H, J=13.3Hz, H-14a)、2.75 (1H, J=13.3Hz, H-14b)、0.99 (3H, s, H-15)、2.64 (4H, brs, N-1)、2.61 (4H, brs, N-2)；¹³C-NMR (75 MHz, CDCl₃) δ (ppm)：51.0 (C-1)、27.6 (C-2)、31.4 (C-3)、40.4 (C-4)、87.0 (C-5)、36.9 (C-6)、59.8 (C-17)、103.5 (C-8)、126.7 (C-9)、141.8 (C-10)、31.2 (C-11)、22.9 (C-12)、21.6 (C-13)、63.2 (C-14)、12.0 (C-15)、55.3 (N-1)、28.1 (N-2)。

 

实施例10：本发明化合物(10)的制备

中间体的制备：同实施例1中中间体的制备方法。 

目标化合物(10)的制备：

将(1S, 4S, 5S, 7S, 8R)-5, 8-环氧-9,10-烯-14-氯代愈创木醇(27mg，0.1mmol)溶解于DMF(2ml)中，加入对甲氧基苄胺(100μl)。所得混合物70℃反应过夜。反应液浓缩蒸干，所得粗品经PTLC纯化(环己烷∶乙酸乙酯=2∶1，乙酸乙酯洗脱)得无色油状化合物(1S, 4S, 5S, 7S, 8R)-5, 8-环氧-9,10-烯-14-对甲氧基苄氨基愈创木醇(10) 25.5mg，收率69%。化合物的波谱数据如下：MS(ESI) m/z: 372.1 [M+H]⁺¹；H-NMR (300 MHz, CDCl₃) δ (ppm)：2.07 (1H, t, J=9Hz, H-1)、1.90 (1H, m, H-2a)、1.55 (1H, m, H-2b)、1.90 (1H, m, H-3a)、1.55 (1H, m, H-3b)、1.84 (1H, m, H-4)、2.22 (1H, dd, J=10.7, 12.9Hz, H-6a)、1.25 (1H, dd, J=7.1, 12.9Hz, H-6b)、1.65 (1H, dd, J=3.3, 10.6Hz, H-7)、5.78 (1H, s, H-9)、1.50 (1H, m, H-11)、0.90 (3H, d, J=6.4Hz, H-12)、1.02 (3H, brs, H-13)、3.20 (2H, brs, H-14)、1.04 (3H, brs, H-15)、3.72 (2H, dd, J=13.0, 22.7Hz, H-16)、6.89 (1H, d, J=8.6 Hz, H-2′, H-6′)、7.28 (1H, d, J=8.6 Hz, H-3′, H-5′)、3.82 (3H, s, -OCH₃)；¹³C-NMR (75 MHz, CDCl₃) δ (ppm)：50.7 (C-1)、27.8 (C-2)、31.3 (C-3)、40.5 (C-4)、87.0 (C-5)、36.8 (C-6)、59.6 (C-7)、103.6 (C-8)、124.7 (C-9)、143.0 (C-10)、31.3 (C-11)、22.9 (C-12)、21.6 (C-13)、52.1 (C-14)、12.0 (C-15)、52.7 (C-16)、132.4 (C-1′)、129.5 (C-2′, C-6′)、114.0 (C-3′, C-5′)、158.8 (C-4′)、55.5 (-OCH₃)。

实施例11：本发明化合物抗甲型H1N1流感病毒活性实验

一、实验材料       

1、药物：莪术醇衍生物样品化合物1~10

2、稀释液0.1% DMSO-PBS

3、细胞：MDCK细胞

4、病毒：A/Hubei /9/2009/( H1N1)

5、主要试剂： DMEM（GiBCO）、小牛血清、胎牛血清（Sigma）、胰蛋白酶等

二、实验方法

1、细胞培养：用细胞接种于96孔培养板内，待细胞长成单层；

2、病毒增殖：A/Hubei /9/2009/( H1N1)（RNA病毒）；

3、病毒滴度的测定 

      1）96孔培养板内接种细胞，培养至单层进行实验；

      2）将原细胞培养板中的含有10%血清的培养液移出，病毒按照10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、

10^-5、10^-6、10^-7和10^-8的稀释度加入细胞板中，35℃吸附30min后，加细胞维持液，同时设立正常细胞对照，35℃培养；

      3）每天观察细胞的病变情况，记录结果。

      4）计算TCID₅₀。

4、样品细胞毒性测定

1）选用病毒易感细胞MDCK，加入不同浓度样品（ug/ml），培养7天，每天观察细胞毒性，利用R-M公式计算半数中毒浓度（TD₅₀）和最大无毒浓度（TD₀），重复试验2次，确定数值。

2）样品溶解方法：用DMSO试剂溶解药品配成浓度为10mg/ml的母液，使用时取1ul用DMEM培养基配制成最大浓度为100ug/ml的实验浓度，倍比稀释，依次为100ug/ml，50ug/m1，25ug/ml，12.5ug/ml，6.25ug/ml，3.125ug/ml。

3）设正常细胞对照。

4）实验结果见表1。

5、样品抗病毒实验方法

1）病毒感染剂量：A/Hubei /9/2009/( H1N1) TCID₅₀10^-3.86 /孔；

2）样品设置三个浓度，以2^-1TD₅₀为最大浓度，分别为2^-1TD₅₀ ，2^-2TD₅₀，2^-3TD₅₀。

3）96孔板培养细胞，待细胞长成单层，分别加入100ul病毒液/孔，吸附半小时后，分别加入不同浓度样品，35℃培养24h-96h，观察CPE。

4）对照组：①病毒+细胞；②正常细胞；③磷酸奥司他韦（达菲）对照组。

6、样品抗病毒实验结果   

1）表1 莪术醇衍生物对病毒致细胞病变作用的影响

2）表2 莪术醇衍生物对MDCK细胞毒性及体外抗H1N1流感病毒作用

7、小结

本发明的化合物4和8抗H1N1流感病毒的效果强于磷酸奥司他韦；1~3、5~7、9~10有治疗效果，但低于磷酸奥司他韦（达菲）。

表1莪术醇衍生物对病毒致细胞病变作用的影响

感染量(TCID50)

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

磷酸奥司他韦

细胞对照

病毒对照

100

+

±

+

－

+

+

±

－

±

±

－

－

++++

注：-示无细胞病变（很好的抑制病毒作用）；±示有延缓细胞病变作用（较好的抑制病毒作用）；+示1/4以下的细胞病变（中等程度的抑制病毒作用）；++示1/4～1/2的细胞有病变（较弱的抑制病毒作用）；+++示1/2～3/4的细胞有病变（弱的抑制病毒作用）；++++示3/4以上的细胞有病变（无抑制病毒作用）。

表2莪术醇衍生物对MDCK细胞毒性及体外抗H1N1流感病毒作用

药物	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	磷酸奥司他韦
												TC50	299.73	690.4	578.33	966.01	347.24	475.32	286.34	827.28	224.13	667.81	1700.86
IC50	10.25	8.56	12.34	3.11	15.27	13.44	7.36	3.05	8.98	9.23	6.87

P<0.001，药物浓度（Log10）与病毒抑制率成线性关系，存活率为三次测定后的平均值

实施例12：本发明化合物4片剂的制备

1．处方：

        化合物4                                 100g

        微晶纤维素                               50g

        预胶化淀粉                               60g

        硬脂酸镁                                 1.5g

        羧甲淀粉钠                               5g            

        共制备                                   500片

2．制备工艺：将原料、辅料分别过100目筛，备用；按照处方量称取原料和辅料；将化合物4、微晶纤维素、预胶化淀粉，混合均匀，加水适量，搅拌均匀，制成适宜软材；过20目筛制颗粒；颗粒在60 °C条件下烘干；干燥好的颗粒加入硬脂酸镁和羧甲淀粉钠，过18目筛整粒，混合均匀；压片。

实施例13：本发明化合物4水针剂的制备

1．处方：

    化合物4                                 2.0g

    吐温-80                                  20ml

            注射用水                                 加至1000ml      

共制备                                   200支

2．制备工艺：将化合物4、吐温-80、注射用水溶解配液，经活性炭吸附处理后过滤、定容、精滤、灌封、灭菌、检漏、灯检，后制成水针剂成品。

Claims (6)

1.具有通式（I）的抗甲型H1N1流感病毒的莪术醇衍生物：

   

（Ⅰ）

其中，R₁代表芳香氧基、酰氧基、C_1-6环状脂肪氨基（包括含O、S等原子的杂环）、苄氨基；R₂代表OH或OAc。

2.根据权利要求1所述的莪术醇衍生物，其特征在于，所述的化合物优选：

(1S, 4S, 5S, 7S, 8R)-5, 8-环氧-9,10-烯-14-对醛基苯氧基愈创木醇 (1)

(1S, 4S, 5S, 7S, 8R)-5, 8-环氧-9, 10-烯-8-羟基-14-愈创木醇乙酸酯 (2)

       

(1S, 4S, 5S, 7S, 8R)-5, 8-环氧-9, 10-烯-8-羟基-14-愈创木醇琥珀酸酯 (3)

(1S, 4S, 5S, 7S, 8R)-5, 8-环氧-9, 10-烯-8, 14-愈创木二醇乙酸酯(4)

       

 (1S, 4S, 5S, 7S, 8R)-5, 8-环氧-9, 10-烯-14-四氢吡咯基愈创木醇 (5)

(1S, 4S, 5S, 7S, 8R)-5, 8-环氧-9, 10-烯-14-哌啶基愈创木醇 (6)

(1S, 4S, 5S, 7S, 8R)-5, 8-环氧-9, 10-烯-14-N-甲基哌嗪基愈创木醇 (7)

(1S, 4S, 5S, 7S, 8R)-5, 8-环氧-9, 10-烯-14-吗啉基愈创木醇 (8)

(1S, 4S, 5S, 7S, 8R)-5, 8-环氧-9, 10-烯-14-硫代吗啉基愈创木醇 (9)

(1S, 4S, 5S, 7S, 8R)-5, 8-环氧-9,10-烯-14-对甲氧基苄氨基愈创木醇 (10)

   

                          。

3.一种如权利要求1所述化合物的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）莪术醇在m-CPBA的作用下，得到了14位双键环氧化的化合物；

（2）在碱性条件下，通过开环脱水，形成了关键的中间体(1S, 4S, 5S, 7S, 8R)-5, 8-环氧-9, 10-烯-8, 14-愈创木二醇；

（3） 在此中间体的基础上，直接合成或将醇羟基转化为反应活性比较高的卤代烃(1S, 4S, 5S, 7S, 8R)- 5, 8-环氧-9, 10-烯-14-氯代愈创木醇，得到目标化合物。

4.权利要求1或2所述的化合物在制备治疗甲型H1N1流感病毒感染性疾病药物中的应用。

5.一种药物组合物，包含权利要求1或2所述的化合物和药学上可接受的赋型剂。

6.根据权利要求1-2任何一项所述的化合物或权利要求5所述的组合物，其特征在于，所述的化合物或组合物与药学上接受的载体混合制备临床上接受的制剂。