CN101543491B

CN101543491B - 间氯苯甲酰基取代脱氢水飞蓟宾制备抗病毒药物的用途

Info

Publication number: CN101543491B
Application number: CN200910097710XA
Authority: CN
Inventors: 李校堃; 汪峰; 黄可新; 李海波; 龚景旭; 巫秀美; 曾苏; 赵昱; 瞿佳
Original assignee: Wenzhou Medical College
Current assignee: Wenzhou Medical College
Priority date: 2009-04-20
Filing date: 2009-04-20
Publication date: 2011-11-23
Anticipated expiration: 2029-04-20
Also published as: CN101543491A

Abstract

本发明涉及间氯苯甲酰基取代脱氢水飞蓟宾制备抗病毒药物的用途。具体而言，本发明涉及一个23位间氯苯甲酰基取代的2，3-脱氢水飞蓟宾酯类衍生物，即化合物间氯苯甲酸[3-(4-羟基-3-甲氧基苯基)-6-(3，5，7-三羟基-4-氧代-苯并吡喃-2)-2，3-二氢-1，4-苯并二氧六环-2]-甲基酯或其可药用盐在制备防治由单纯疱疹病毒HSV-1引发的病毒感染和/或口腔溃疡药物的药物用途。该化合物由化学方法半合成制备而得，经药理实验证明，该化合物对单纯疱疹病毒HSV-1有确切的抑制作用，其半数抑制浓度IC₅₀值为44.78微克/毫升。

Description

间氯苯甲酰基取代脱氢水飞蓟宾制备抗病毒药物的用途

技术领域

本发明涉及医药技术领域，具体而言，本发明涉及一个23位间氯苯甲酰基取代的2，3-脱氢水飞蓟宾酯类衍生物即化合物间氯苯甲酸[3-(4-羟基-3-甲氧基苯基)-6-(3，5，7-三羟基-4-氧代-苯并吡喃-2)-2，3-二氢-1，4-苯并二氧六环-2]-甲基酯的医药用途。该化合物被发现具有抑制单纯疱疹病毒HSV-1的功效，可以预期用于制备治疗单纯疱疹病毒引发的病毒感染和/或口腔溃疡疾病的药物用途。

背景技术

单纯疱疹病毒在全球广泛流行，人类是其唯一宿主。其直径约为120～150微米，含有DNA的核位于中间，向外依次由包膜、体被、衣壳三种同心结构组成，衣壳表面为162个壳微粒组成的3∶3∶2轴对称的20面体，在低温下可生存数月，湿热50℃及干燥90℃30分钟灭活。单纯疱疹病毒可分为I型和II型二种，I型疱疹病毒(HSV-1)主要感染腰以上部位的皮肤粘膜和器官，HSV-1主要通过呼吸道、皮肤和粘膜密切接触传播，99％的口唇粘膜、鼻前庭、眼结膜、咽喉部的炎症及疱疹，口和口周围发生的疱疹都是由I型疱疹病毒感染引起的。在发达国家如美国其感染率分别为儿童期：20～40％、成年期：50～70％。

单纯疱疹病毒感染及其导致的口腔溃疡易反复发作，目前尚无特效治疗方法，临床上主要的治疗措施包括局部治疗和全身治疗，西医治疗以局部用碘甘油及维生素B1、B2和维生素C口服，一般疗效不甚明显。严重、顽固的口腔溃疡则需内服激素类药品、抗菌素类药品等，使用此类药物又存在较大的毒副作用和易使病人产生耐药性和菌群失调的不足之处。如目前临床常用的单纯疱疹病毒感染治疗药物无环鸟苷即阿昔络韦，主要适用于病毒复制的原发性感染和复发性感染，对潜伏感染难以发挥作用。

中药对抗单纯疱疹病毒感染所用之外用药包括锡类散、冰硼散等外用制剂，但治疗效果不十分理想；内服药包括牛黄解毒丸、牛黄上清丸等，又对本病症无显著的针对性。近期出现的不少新的口腔含片类药物制剂如西瓜霜含片、华素片和溶菌酶含片等分别在口感、杀菌、抗炎方面有所进步。但是有些又不适于哺乳期妇女、甲状腺功能亢进患者和碘过敏者。

因此，应用现代病毒药理学技术，开发出新的抗HSV-1感染以及治疗口腔溃疡天然药物是十分必要的。避开核苷类抗病毒药物的副作用，寻找创新性的先导化合物骨架，以期开发出新型抗单纯疱疹病毒感染药物或与已上市之抗HSV-1感染药物联用，是本发明的目的。

随着世界范围内对传统植物药或动物药等天然医药资源研究开发的重视，学者们对天然产物这一毒副作用小的资源越发青睐，并从中筛选出多种抗单纯疱疹病毒感染的活性化合物。如已见报道的原花色素类化合物proanthocyanidindimer对HSV-1的半数抑制浓度IC₅₀为250微克/毫升(A.M.Balde et al，Phytotherapy Research，4，182)；生物碱类天然产物中也发现了对单纯疱疹病毒HSV-1具强效抑制作用的化合物，如N-甲基-crotsparine对HSV-1的半数抑制浓度IC₅₀为8.3微克/毫升(A.Nawani et al，Biol.Pharm.Bull.1999，22，268～274)；近期，我国学者冯孝章等发现栀子苷具有抗单纯疱疹病毒感染的活性，其对HSV-1的半数抑制浓度IC₅₀为1120微克/毫升(崔晓兰，刘发，冯孝章，ZL 200410034038.7)；又有云南学者发现鼠尾草多糖及其酯类对单纯疱疹病毒有着较强的抑制活性，其对HSV-1的半数抑制浓度IC₅₀为85.6微克/毫升，治疗指数110(赵声兰，陈朝根，李立，CN 200710065989.4)。以上均说明天然产物及其衍生物作为抗单纯疱疹病毒HSV-1活性成分的可能性。

水飞蓟宾是黄酮木脂素化合物，存在于菊科植物水飞蓟的种子中。水飞蓟已在临床上广泛应用，在中国商品名为利肝隆。三十多年的临床实验证明该药具有确切的疗效和低毒性(参阅K.Flora等人，Am.J.Gastroenterol，1998，93，139-143；R.Saller等人，Drugs，2001，61，2035-2063)。水飞蓟宾具有抗自由基活性，增强肝细胞膜对于多种损害因素的抵抗力，促进肝细胞的修复和再生，它还是一个抗菌耐药抑制剂(Maitrejean等，Bioorganic MedinicalChemitry Letters，2000，10，157-160；Guz等，Journal of Medinical Chemitry，2001，44，261-268)。因此，以水飞蓟宾为代表的黄酮木脂素类化合物引起了越来越多的关注，如杨雷香，赵昱等人的论文指出其制备出的一系列水飞蓟宾类衍生物也具有强效的抗氧化活性(Journal of Enzyme Inhibition andMedicinal Chemistry，2006，21，399-404.)。水飞蓟宾类化合物具有以上所述之确切的多种疗效，然而其于抗病毒方面尤其是抑制单纯疱疹病毒的新用途方面尚未得到有效开发，故此我们设计并制备了23位间氯苯甲酰基取代的2，3-脱氢水飞蓟宾酯类衍生物，并测试了其抑制I型单纯疱疹病毒HSV-1的药理活性。试验结果发现：化合物间氯苯甲酸[3-(4-羟基-3-甲氧基苯基)-6-(3，5，7-三羟基-4-氧代-苯并吡喃-2)-2，3-二氢-1，4-苯并二氧六环-2]-甲基酯对HSV-1病毒具有较强的抑制活性，且治疗指数较高，可以作为抗HSV-1病毒先导化合物继续开发，从而完成本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供一种具有抑制单纯疱疹病毒感染、防治口腔溃疡的活性化合物。具体而言，本发明提供了一种下式所示的23位间氯苯甲酰基取代的2，3-脱氢水飞蓟宾酯类衍生物及其可药用盐用于制备抑制单纯疱疹病毒和/或治疗口腔溃疡药物的用途：

式(I)

其中，式(I)化合物的名称为：间氯苯甲酸[3-(4-羟基-3-甲氧基苯基)-6-(3，5，7-三羟基-4-氧代-苯并吡喃-2)-2，3-二氢-1，4-苯并二氧六环-2]-甲基酯。

本发明的再一个目的是提供了一种用于防治由单纯疱疹病毒HSV-1引发的病毒感染和/或口腔溃疡的药物或药物组合物，其含有治疗有效量的作为活性成分的式(I)化合物或其可药用盐和可药用辅料。根据本发明，该药物组合物中可加入各种药学上可接受的药用赋形剂，添加剂及载体。

本发明的有益之处在于：合成方法制备了23位间氯苯甲酰基取代的2，3-脱氢水飞蓟宾酯，并首次发现了其在开发防治HSV-1病毒感染药物领域中的潜力，对于开发抑制单纯疱疹病毒或治疗口腔溃疡创新型药物提供了新的物质基础。本发明再一特点为：该化合物来源于天然药物的半合成改造，原料来源方便易得，制备步骤简便，成本低，污染小，利于节能减排条件下的大规模开发，具有潜在的社会效益和经济效益。

具体实施方案

为了更好地理解本发明的实质，下面通过实施例进一步说明本发明。实施例给出了间氯苯甲酸[3-(4-羟基-3-甲氧基苯基)-6-(3，5，7-三羟基-4-氧代-苯并吡喃-2)-2，3-二氢-1，4-苯并二氧六环-2]-甲基酯的制备和纯化方法及其相关结构鉴定的数据。必须说明，实施例中所述的制备方法以及分离纯化方法是用于对本发明的说明而不是对本发明的限制。除非另有说明，本发明中的百分数是重量百分数。

实施例1：式(I)化合物间氯苯甲酸[3-(4-羟基-3-甲氧基苯基)-6-(3，5，7-三羟基-4-氧代-苯并吡喃-2)-2，3-二氢-1，4-苯并二氧六环-2]-甲基酯的制备

1.1 2，3-脱氢水飞蓟宾的制备：

在干燥的反应瓶中加入1.02克水飞蓟宾，10克醋酸钾，再加入50毫升冰醋酸，冰浴下再加入溶有1克碘的冰醋酸50毫升。加热回流5小时。降温后加入50毫升冰水，醋酸乙酯提取(20毫升×4次)，提取液有机层合并，水洗，无水硫酸钠干燥。过滤，滤液浓缩，得红棕色固体，加入含有6毫升盐酸的乙醇溶液50毫升。加热回流3小时。降温，析出黄色固体，用醋酸乙酯重结晶得粗品2，3-脱氢水飞蓟宾黄色粉末0.95克，直接用于下一步反应。

1.2式(I)化合物的制备：

在干燥的反应瓶中加入0.95克上述2，3-脱氢水飞蓟宾粗品，0.616克间氯苯甲酸，1.571克三苯基磷，用20毫升无水四氢呋喃溶解后加入1.04克(0.8毫升)偶氮二羧酸乙酯DEAD，室温搅拌6小时。减压蒸除溶剂，加入少量氯仿，滤去不溶物，母液浓缩后用6克200～300目硅胶拌样，用40克200～300目硅胶柱层析，石油醚/醋酸乙酯＝2∶1洗脱，薄层TLC检测合并，纯化得到式(I)化合物1.082克。

R_f(石油醚/醋酸乙酯＝1∶1)：0.31；核磁共振氢谱¹H NMR(400MHz，氘代丙酮)δ：4.63(多重峰，1H)，4.85(多重峰，2H)，5.02(多重峰，1H)，6.28(双峰，J＝2.0Hz，1H)，6.47～6.58(多重峰，3H，芳香环Ar-H)，6.62(双峰，J＝2.0Hz，1H)，6.81(双峰，J＝8.4Hz，1H)，7.28～7.89(多重峰，4H，芳香环Ar-H)，7.96(双峰，J＝2.0Hz，1H)，8.01(双双峰，J＝8.4，2.0Hz，1H)，11.15(单峰，1H，5-OH)；电喷雾质谱ESI-MS：617(M-1)⁺。

本发明的又一特点是，经药理实验证明：全合成得到的23位间氯苯甲酰基取代的2，3-脱氢水飞蓟宾新的酯类衍生物即式(I)化合物对单纯疱疹病毒HSV-1有强效抑制作用，其IC₅₀值为44.78微克/毫升。说明该化合物有望开发成为抑制由单纯疱疹病毒HSV-1引发的病毒感染和/或治疗口腔溃疡药物。

本发明中制备得到的水飞蓟宾类新的23-酯类衍生物即式(I)化合物或其可药用盐用制药领域中的常规方法，结合中、西药制药中常规的可药用辅料，可以制成各种药物组合物，如注射剂、片剂、胶囊剂、气雾剂、栓剂、膜剂、滴丸剂、外用搽剂，或控释或缓释剂型或纳米制剂。这些药物组合物可以用于预防或/和治疗由单纯疱疹病毒HSV-1引发的病毒感染和/或口腔溃疡。

本发明所涉及的的式(I)化合物或其可药用盐还可以与现已上市的治疗单纯疱疹病毒感染、口腔溃疡的常用药物联合或交叉使用，制备得到具有治疗单纯疱疹病毒感染、口腔溃疡的组合物或复方制剂。可组合的药剂例子包括阿昔络韦(ACV)、万乃洛韦(VCV)、泛昔络韦(FCV)、喷昔洛韦(PCV)、阿糖腺苷(ara-T)、溴乙烯去氧鸟苷(BVDU)、膦甲酸(PFA)、更昔络韦(GCV)等。此外，其还可以与神经痛镇痛药物以及解热镇痛药物合并用药。

下面本发明通过药理相关实施例的方式说明式(I)化合物对单纯疱疹病毒抑制作用的药理实验结果。实验结果说明式(I)化合物在抗单纯疱疹病毒、抑制口腔溃疡的药物研究领域中的用途；本发明人还测试了其对Vero细胞的半数细胞毒活性数据(TD₅₀)，用以说明该化合物的毒性，从而评价其治疗指数(TI)。

实施例2：采用MTT法测定式(I)化合物对Vero细胞的细胞毒性，以及用微量细胞病变抑制(CPE)法研究式(I)化合物对HSV-1的抑制作用试验

2.1.实验材料与样品

2.1.1病毒：单纯疱疹病毒-I型(Herpes simplex virus-1，HSV-1)，浙江大学中药与天然药物研究室提供。

2.1.2细胞：Vero细胞购自中国科学院上海细胞库。细胞用含10％小牛血清得RPMI1640培养基培养，维持液为含1.0％小牛血清的RPMI1640培养基。

2.1.3试剂：

2.1.3.1 RPMI1640培养基购自Gibco公司；

2.1.3.2MTT：Amresco公司产品，上海生工生物工程技术服务公司分装；

2.1.3.3小牛血清：杭州四季青生物工程有限公司；

2.1.3.4青霉素：石家庄制药集团有限公司；

2.1.3.5链霉素：石家庄制药集团有限公司；

2.1.3.6细胞消化液：含0.25％胰蛋白酶，0.02％EDTA-Na₂，用Hank’s液配制；

2.1.3.7阿昔络韦：湖北科益药业股份有限公司，0.25g/支；

2.1.4仪器：

2.1.4.1二氧化碳(CO₂)培养箱：2306-2型，Shellab公司；

2.1.4.2倒置显微镜：XD-2型，重庆光电仪器有限公司；

2.1.4.3生物安全柜：A/B3型，Labconco公司；

2.1.4.4酶标仪：Synergy-HT型，BIO-TEK公司；

2.1.4.5立式自动电热压力蒸汽灭菌器：LDZX-40BI型，上海申安医疗器材厂；

2.1.4.6紫外分光光度计：UV-1201型，北京瑞利分析仪器公司；

2.1.4.7除菌过滤器：Sterifil500型，Millipore公司；

2.1.4.8超纯水系统：UPWS-I-60D型，杭州永洁达净化科技有限公司。

2.2.细胞培养和病毒传代：

将Vero细胞培养于含10％灭活小牛血清，100U/毫升青霉素和100微克/毫升的RPMI1640培养基中，置37℃，5％二氧化碳，100％相对湿度的培养箱中培养。将HSV-1加入长有单层Vero细胞的细胞瓶中，置37℃，5％二氧化碳，100％相对湿度的培养箱中培养，收集培养上清，置低温下保存。

2.3.实验方法：

2.3.1采用MTT[3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐]法测定间氯苯甲酸[3-(4-羟基-3-甲氧基苯基)-6-(3，5，7-三羟基-4-氧代-苯并吡喃-2)-2，3-二氢-1，4-苯并二氧六环-2]-甲基酯对Vero细胞生长的抑制作用：

(1)测试药物：实施例1制备得到的间氯苯甲酸[3-(4-羟基-3-甲氧基苯基)-6-(3，5，7-三羟基-4-氧代-苯并吡喃-2)-2，3-二氢-1，4-苯并二氧六环-2]-甲基酯；阿昔洛韦(ACV)为阳性对照药物。

(2)取对数生长期的Vero细胞，用培养基将细胞稀释成1×10⁵/毫升，接种于96孔细胞培养板，每孔100微升，在37℃，5％二氧化碳，100％相对湿度的培养箱中培养24小时后加入用培养基稀释的间氯苯甲酸[3-(4-羟基-3-甲氧基苯基)-6-(3，5，7-三羟基-4-氧代-苯并吡喃-2)-2，3-二氢-1，4-苯并二氧六环-2]-甲基酯，浓度分别为400微克/毫升，200微克/毫升，40微克/毫升和8微克/毫升，置于培养箱中培养，培养72小时后，每孔加入MTT试剂10微升，继续培养4小时，弃去培养基，每孔加入二甲亚砜200微升，用振荡器振荡20分钟，在570nm波长下用酶标仪测定OD值。以只加培养基的培养孔为对照孔。实验重复三次。根据不同浓度下对细胞生长的抑制率，计算对细胞生长的半数抑制浓度(TD₅₀)。

抑制率(％)＝(对照孔OD值-实验组OD值)/对照孔OD值×100％。

2.3.2用微量细胞病变抑制法测定样品对病毒生长抑制作用：

取对数生长期的Vero细胞，用培养基将细胞稀释成1×10⁵个/毫升，接种于96孔细胞培养板，37℃，5％二氧化碳，100％相对湿度培养24小时，加入100 TCID₅₀的病毒100微升，倾出病毒，分别加入不同浓度的间氯苯甲酸[3-(4-羟基-3-甲氧基苯基)-6-(3，5，7-三羟基-4-氧代-苯并吡喃-2)-2，3-二氢-1，4-苯并二氧六环-2]-甲基酯，同时设正常细胞对照和病毒感染对照，37℃，5％二氧化碳，100％相对湿度培养48小时后在倒置显微镜下观察细胞病变。以五级标准作为判断细胞病变的标准：-：细胞无变化，分值为8分；+：25％以下细胞出现病变，分值为6分；++：25％～50％细胞出现病变，分值为4分；+++：50％～75％细胞出现病变，分值为2分；++++：75％以上细胞出现病变，分值为0分。计算半数抑制浓度(IC₅₀)。同时用阿昔洛韦作为阳性对照药。

计算样品治疗指数：TI＝半数中毒浓度(TD₅₀)/半数抑制浓度(IC₅₀)。

2.4.实验结果：

结果如表一显示，间氯苯甲酸[3-(4-羟基-3-甲氧基苯基)-6-(3，5，7-三羟基-4-氧代-苯并吡喃-2)-2，3-二氢-1，4-苯并二氧六环-2]-甲基酯能显著抑制HSV-1的复制，其对HSV-1的半数抑制浓度和治疗指数如表所示。

表一.式(I)化合物对HSV-1的抑制作用

样品	TD₅₀	IC₅₀	TI(治疗指数)
				式(I)化合物	＞400	44.78	＞8.9
阳性对照药(阿昔洛韦)	＞400	0.14	＞2857

注：TD₅₀指样品对细胞生长的半数抑制浓度(微克/毫升)；IC₅₀为样品对病毒复制的半数抑制浓度(微克/毫升)；TI(治疗指数)＝TD₅₀/IC₅₀。

2.5.结论：

上述试验结果说明，间氯苯甲酸[3-(4-羟基-3-甲氧基苯基)-6-(3，5，7-三羟基-4-氧代-苯并吡喃-2)-2，3-二氢-1，4-苯并二氧六环-2]-甲基酯对I型单纯疱疹病毒有着较为强效的抑制作用，其抑制强度虽然低于阳性对照药(阿昔洛韦)及文献报道中的N-甲基-crotsparine(IC₅₀为8.3微克/毫升)，但是其抑制强度大大强于文献报道中的原花色素类化合物proanthocyanidin dimer(IC₅₀为250微克/毫升)、栀子苷(IC₅₀为1120微克/毫升)、鼠尾草多糖及其酯类(IC₅₀为85.6微克/毫升)等，从而可以预期进一步开发成为抑制HSV-1感染疾病如口腔病毒性疱疹和口腔溃疡的药物。

在上述说明书阐述本发明时，同时提供了实施例的目的是举例说明本发明的实际操作过程和本发明的意义。在进入本发明权利要求和其等同物范围内时，本发明的实际应用包括所有一般变化、配合，或改进。

Claims

1.一种如式(I)所示的间氯苯甲酸[3-(4-羟基-3-甲氧基苯基)-6-(3，5，7-三羟基-4-氧代-苯并吡喃-2)-2，3-二氢-1，4-苯并二氧六环-2]-甲基酯或其可药用盐用于制备抑制单纯疱疹病毒的药物的用途；

2.一种用于防治由单纯疱疹病毒HSV-1引发的病毒感染和/或口腔溃疡的药物组合物，其含有治疗有效量的作为活性成分的根据权利要求1的式(I)化合物或其可药用盐和可药用辅料。

3.根据权利要求2所述的药物组合物，其剂型是注射剂、片剂、胶囊剂、气雾剂、栓剂、膜剂、滴丸剂或外用搽剂。