CN105924492A

CN105924492A - 靶向线粒体的抗肿瘤五环三萜衍生物及其制备方法与应用

Info

Publication number: CN105924492A
Application number: CN201610280277.3A
Authority: CN
Inventors: 范培红; 叶雅晴; 娄红祥
Original assignee: Shandong University
Current assignee: Shandong University
Priority date: 2016-04-28
Filing date: 2016-04-28
Publication date: 2016-09-07
Anticipated expiration: 2036-04-28
Also published as: CN105924492B

Abstract

本发明公开了一类五环三萜衍生物，其结构式如式(Ⅰ)、式(Ⅱ)、式(Ⅲ)、式(Ⅳ)或式(Ⅴ)所示：其中，R₁为氢、甲酰基、乙酰基或(n＝1‑19)，R₂为(n＝1‑19)，R₃为羟基，甲氧基或乙氧基，R₄为(n＝1‑19)。本发明的化合物具有较好的抗肿瘤活性，通过将天然化合物靶向至线粒体，能更好的应用于抗肿瘤药物的开发。且化合物为盐类，大大提高了药物的水溶性及改善其药代动力学参数。

Description

靶向线粒体的抗肿瘤五环三萜衍生物及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及一类靶向线粒体的抗肿瘤五环三萜衍生物及其制备方法与应用，具体涉及白桦醇、白桦酸、齐墩果酸、熊果酸和乳香酸的TPP衍生物及其制备方法与应用，属于医药技术领域。

背景技术

线粒体作为细胞内十分重要的一类细胞器，不仅承担着为细胞供能的工作，还是控制细胞程序性死亡(又称细胞凋亡)的重要细胞器。研究表明，多数抗肿瘤药的作用机制与引发肿瘤细胞凋亡有关。而线粒体在肿瘤细胞和正常细胞相比，发生了一些形态和生理功能的变化，比如糖酵解变为主要供能方式，mtDNA发生突变，ROS增多及线粒体膜电位增高等(European Journal of Biochemistry，1999，264，687-701.)。肿瘤细胞中线粒体的这一系列变化使得我们将药物特异性地靶向至肿瘤细胞的线粒体中并进一步引发凋亡成为可能。目前为止常见的将抗肿瘤化合物运载至线粒体的方法主要有三类：纳米载体，多肽载体，及电子移位亲脂性阳离子(Delocalized Lipophilic Cation,DLC)等(Molecularnutrition&food research，2009，53，9-28；Environmental and molecular mutagenesis，2010，51，462-75.)。DLC一般由一个亲水的带电中心和一个疏水的核心连接而成，利用肿瘤细胞中线粒体远高于正常细胞的膜电位选择性积聚，从而达到特异性靶向至线粒体的目的(Annual review of pharmacology and toxicology，2007，47，629-656.)。其中最常用的DLC是三苯基膦(TPP)，目前已有多种抗肿瘤化合物与TPP连接后大幅提高其抗肿瘤活性或改善肿瘤的抗药性。如白藜芦醇(Current Pharmaceutical Design，2014，20，172-179)，没食子酸(J.Med.Chem，2014，57，2440–2454)等。

很多五环三萜类化合物如乳香酸、齐墩果酸、白桦酸、白桦醇等本身具有广泛的生理和药理活性，尤其在抗肿瘤方面有突出的表现(Molecule，2015，20，1610-1625；CancerLetters，2012，320，158–170)，以白桦酸、白桦醇为例(Journal of Applied Biomedicine，2012，10，7–12)，白桦醇和白桦酸是大量存在于桦木科植物桦树里的一种五环三萜，其结构式为：

已有研究表明，白桦酸、白桦醇的抗肿瘤机制与线粒体凋亡途径有关，包括连续激活caspases 9,3,和7，清除聚腺苷二磷酸-核糖聚合酶(poly-ADP-ribose polymerase，PARP)，继而引发细胞色素c和Smac蛋白由线粒体内膜上的释放，线粒体膜电位去极化，以及凋亡蛋白Bax和Bak的高表达等(Basic and Clinical Pharmacology and Toxicology，2009，105，425–432；Tumor，2012，32，234–238；Molecular Carcinogenesis，2010，49，630–640；PLoSONE，2009,4，Article ID e5361；Oncogene，2004，23，7611–7620；Brit J Cancer，2010，103，43–51.)。

但由于五环三萜类化合物普遍存在的生物利用度低，水溶性差等原因限制了它们的临床应用。药学家们对它们结构进行了一系列改造以期增强生物利用度及水溶性并增强其抗肿瘤活性，(BioMed Research International，2015，Article ID 584189；MedicinalResearch Reviews，2015，35，1127–1155；European Journal of MedicinalChemistry2015，92，648-655.)。但目前将五环三萜类化合物直接靶向到线粒体从而引发肿瘤细胞凋亡的合成方法复杂，且未做深入的机制研究(Russian Chemical Bulletin,International Edition，2013，62，188—198.)。

发明内容

本发明人经过深入的研究和创造性的劳动，通过两步合成反应将线粒体靶向载体与五环三萜类化合物及其衍生物连接在一起，得到了系列五环三萜类化合物的TPP衍生物。本发明的新化合物对肿瘤细胞的抑制活性强，还具有较好的水溶性，有利于药物的体内吸收和发挥药效。本发明的化合物具有作为抗肿瘤药物的潜力。由此提供了下述发明：

本发明的一个方面涉及一类五环三萜衍生物，其结构式如式Ⅰ、式Ⅱ、式Ⅲ、式Ⅳ或式Ⅴ所示：

其中，R₁为氢、甲酰基、乙酰基或(n＝1-19)，

R₂为(n＝1-19)，R₃为羟基，甲氧基或乙氧基，R₄为(n＝1-19)。

上述化合物的实例如下：

本发明的另一方面涉及上述五环三萜衍生物的制备方法，其反应路线如下所示：

式Ⅰ制备路线：

式Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ制备路线：

式Ⅱ其他化合物制备路线：

式Ⅲ、Ⅳ其他化合物制备方法同式Ⅱ。

式Ⅴ制备路线：

式Ⅴ其他化合物通过酰氯试剂酰化法制备。

所述方法包括：以五环三萜化合物为起始原料，使五环三萜化合物的至少一个羟基进行酯化反应，得中间体化合物，然后将中间体化合物与三苯基膦发生成盐反应，生成式Ⅰ、式Ⅱ、式Ⅲ或式Ⅳ所示的五环三萜衍生物；

或者，将三苯基膦与1,5-二溴戊烷在乙腈中发生成盐反应，然后将成盐反应的产物与乙二胺在四氢呋喃中发生取代反应；将乳香酸与氯化亚砜发生酯化反应后，再与上述取代反应的产物进行酰胺化反应，生成式(Ⅴ)所示的五环三萜衍生物。

上述方法，生成式(Ⅰ)、式(Ⅱ)、式(Ⅲ)或式(Ⅳ)所示的五环三萜衍生物的过程中，所述酯化反应采用的是EDC/DMAP法，以二氯甲烷作为溶剂，室温下反应，五环三萜化合物、EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)、DMAP(4-二甲氨基吡啶)与5-溴戊酸和二氯甲烷加入量的比为：1mol:(2.5-2.6)mol:(0.4-0.5)mol:(4-4.1)mol:2000mL。

上述方法，生成式(Ⅰ)、式(Ⅱ)、式(Ⅲ)或式(Ⅳ)所示的五环三萜衍生物的过程中，所述成盐反应是以乙腈作为溶剂，中间体化合物、三苯基膦和乙腈加入量的比为1mol：(3-3.1)mol：1000mL，70-80℃加热回流。

上述方法，生成式(Ⅴ)所示的五环三萜衍生物的过程中，三苯基膦、1,5-二溴戊烷和乙腈加入量的比为：1mol：(5-5.2)mol：2000mL，70-80℃加热回流12h，得成盐反应的产物。

上述方法，生成式(Ⅴ)所示的五环三萜衍生物的过程中，成盐反应的产物、乙二胺和四氢呋喃加入量的比为：1mol：(5-5.2)mol：1500mL，室温反应3h，得取代反应的产物。

上述方法，生成式(Ⅴ)所示的五环三萜衍生物的过程中，所述酯化反应的反应条件为：11-羰基-β-乙酰乳香酸1mol在1000mL氯化亚砜中80℃加热回流2h，蒸除溶剂。

上述方法，生成式(Ⅴ)所示的五环三萜衍生物的过程中，所述酰胺化反应的反应条件为：将酯化反应的产物用2000mL二氯甲烷溶解后，0℃冰浴下缓慢滴加取代反应的产物和三乙胺各3mol，室温搅拌24h。

当式I的R₁为甲酰基或乙酰基时，所述方法还包括将五环三萜化合物的一个羟基进行酯化反应后，再通过酰氯试剂酰化法制备的步骤。

当式Ⅱ、式Ⅲ或式Ⅳ的R₃为甲氧基或乙氧基时，所述方法还包括将五环三萜化合物的一个羟基进行酯化反应后，再通过卤代烃与羧基的酯化反应制备的步骤。

上述方法中，所述五环三萜化合物选自白桦醇、白桦酸、齐墩果酸、熊果酸和乳香酸。

本发明还提供上述五环三萜衍生物在制备抗肿瘤类药物中的用途。

本发明的再一方面涉及一种药物组合物，其包含本发明中任一项所述的五环三萜衍生物。

优选的，所述药物组合物还包含一种或多种药学上可接受的载体和/或赋形剂。

优选的，所述载体包括如生理盐水、缓冲盐水、葡萄糖、水、甘油、乙醇或它们的组合物；赋形剂可以选自磷酸钙，硬脂酸镁，滑石粉，糊精，淀粉，凝胶纤维素，甲基纤维素，羧甲基纤维素钠盐或聚乙烯吡咯烷酮。

优选的，所述药物组合物为固体口服制剂或肠胃外给药制剂。

进一步优选的，所述药物组合物为片剂、分散片、肠溶片、咀嚼片、口崩片、胶囊、糖衣剂、颗粒剂、干粉剂、口服溶液剂、注射用小水针、注射用冻干粉针、大输液或小输液。

术语“组合物”意指包括包含指定量的各指定成分的产品，以及直接或间接从指定量的各指定成分的组合产生的任何产品。

通常本发明药物组合物含有0.1-90重量％的本发明五环三萜衍生物。药物组合物可根据本领域已知的方法制备。

我们已经发现，根据本发明制备的五环三萜衍生物是可以用于制备预防和/或治疗肿瘤的药剂。

因此，本发明的另一个主题是，一种治疗肿瘤的方法，所述方法包括施用治疗有效量的如上所述的式(Ⅰ)、式(Ⅱ)、式(Ⅲ)或式(Ⅳ)的五环三萜衍生物。

本文使用的术语“治疗有效量”表示，治疗、改善疾病或病症，或者表现出可检测的治疗效果所需的治疗剂的量。

本发明的化合物在相当宽的剂量范围内是有效的。实际服用本发明式(I)所示的化合物的剂量可由医生根据有关的情况来决定。这些情况包括：被治疗者的身体状态、给药途径、年龄、体重、对药物的个体反应，症状的严重程度等。

本发明的有益效果：

本发明的五环三萜及其衍生物的TPP衍生物，其制备方法简单，工艺稳定，可操作性强，原料可从植物中提取，亦可由成熟的化学合成工艺转化得到。

药理活性实验证明该系列结构改造化合物具有较好的抗肿瘤活性，通过将天然化合物靶向至线粒体，能更好的应用于抗肿瘤药物的开发。且化合物为盐类，大大提高了药物的水溶性及改善其药代动力学参数。

附图说明：

图1：化合物Ⅰ-a、化合物Ⅰ-b与白桦醇的IC₅₀(μM)比较结果；

图2：化合物II-a与白桦酸的IC₅₀(μM)比较结果；

图3：化合物Ⅰ-a，Ⅰ-b，II-a，以及白桦醇、白桦酸对A549细胞在5μM浓度下的抑制率；

图4：不同浓度下化合物Ⅰ-a对K562细胞形态的变化；

图5：流式细胞术检测不同浓度化合物Ⅰ-a诱发K562细胞凋亡结果。

具体实施方式

结合实施例对本发明作进一步的说明，应该说明的是，下述说明仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。

实施例1：化合物Ⅰ-a制备

将白桦醇(1.0g,2.26mmol)与EDC(1.09g,9.04mmol)、DMAP(112mg,0.90mmol)、5-溴戊酸(1.68g,9.04mmol)混合置于100ml圆底烧瓶中，加入40ml二氯甲烷，常温反应约11h，TLC检测反应达平衡，加入三蒸水洗三次后有机相用无水硫酸钠干燥7h后抽滤除去硫酸钠，减压浓缩，硅胶柱层析得化合物1的白色粉末250mg,将此白色粉末溶于10ml乙腈中，加入325mg(1.24mmol)TPP，油浴升温至75-80℃，磁力搅拌24h后TLC检测反应基本完全，减压蒸干溶剂后，硅胶柱层析得产物白色晶体Ⅰ-a 30mg。Data forⅠ-a：Mp：87-99℃[α]_D ²⁰＝+3.6°(c 0.1，CH₃OH)，¹H NMR(CDCl₃,600MHz):7.89–7.85(m,6H),7.79(ddd,J＝7.4,1.6,0.9Hz,3H),7.72–7.68(m,6H),4.67(d,J＝1.7Hz,1H),4.58(s,1H),4.20–4.15(m,1H),4.00–3.92(m,2H),3.77(d,J＝11.0Hz,1H),3.18(dd,J＝11.5,4.7Hz,1H),2.42(t,J＝6.8Hz,2H),2.41–2.36(m,1H),2.06–2.00(m,2H),1.66,1.00,0.97,0.95,0.82,0.76(s,3H)(6-CH3).¹³CNMR(CDCl₃,150MHz)150.14,134.95,133.78,130.45,118.68,118.11,109.86,78.92,77.25,77.04,76.83,62.55,55.26,53.45,50.33,48.73,47.69,46.35,42.67,40.85,38.86,38.68,37.56,37.13,34.51,34.16,33.47,29.69,29.55,27.99,27.38,27.00,25.48,25.15,22.78,22.45,22.04,20.76,19.09,18.27,16.06,15.38,14.74；HR-ESI-MS(m/z):787.5231[M-Br]⁺。

合成路线如下：

实施例2：化合物Ⅰ-b制备

操作同化合物Ⅰ-a，得白色固体。Data forⅠ-b：Mp：145-154℃[α]_D ²⁰＝+23.2°(c0.1，CH₃OH)，¹H NMR(CD₃OD 400MHz,)7.94-7.88(m,6H)7.87-7.76(m,24H)4.73(s,1H),4.61(s,2H),4.44(d,J＝5.1Hz,1H),4.39(d,J＝10.4Hz,1H),3.83(d,J＝11.0Hz,1H),3.55–3.44(m,5H),2.49–2.38(m,5H),1.97–1.84(m,5H).1.72 1.071.03 0.89 0.83 0.81(s,3H)(6-CH3).¹³C NMR(CD₃OD,100MHz):173.59,173.10,149.98,134.95,133.45,130.20,118.90,118.04,109.26,81.04,63.89,62.20,55.31,50.22,48.54,48.18,47.86,47.60,47.22,47.20,47.10,47.00,46.36,42.45,41.85,40.71,38.09,37.54,36.84(s),34.18,33.91,33.17,32.77,29.90,29.34,28.90,27.19,26.80,25.54,25.08,23.35,23.06,22.78,21.71,21.39,20.87,20.54,17.94,15.71,15.28,13.87,13.10,10.08；HR-ESI-MS(m/z):[(M-2Br)/2]⁺。

合成路线如下：

实施例3：化合物Ⅰ-c制备

将白桦醇(5.0g,11.3mmol)与EDC(5.45g,45.2mmol)、DMAP(560mg,4.5mmol)、5-溴戊酸(8.4g,45.2mmol)混合置于500ml圆底烧瓶中，加入200ml二氯甲烷，常温反应约11h，TLC检测反应达平衡，加入三蒸水洗三次后有机相用无水硫酸钠干燥7h后抽滤除去硫酸钠，减压浓缩，硅胶柱层析得化合物1的白色粉末3g,取上述化合物1 1.19g溶于20mL甲酸中，油浴升温至85℃回流搅拌2h后TLC检测反应基本完全，三蒸水洗掉溶剂，用二氯甲烷萃取三次后机相用无水硫酸钠干燥7h后抽滤除去硫酸钠，减压浓缩，硅胶柱层析得化合物3 700mg，取上述化合物3 200mg溶于10ml乙腈中，加入325mg(1.24mmol)TPP，油浴升温至75-80℃，磁力搅拌24h后TLC检测反应基本完全，减压蒸干溶剂后，厚制备版制备得黄色化合物Ⅰ-c100mg。

合成路线如下：

实施例4：化合物II-a制备

将白桦酸(0.5g,1.09mmol)与EDC(0.527g,2.73mmol)、DMAP(54mg,0.44mmol)、5-溴戊酸(0.817g,4.36mmol)混合置于100ml圆底烧瓶中，加入20ml二氯甲烷，常温反应约11h，TLC检测反应达平衡，加入三蒸水洗三次后有机相用无水硫酸钠干燥7h后抽滤除去硫酸钠，减压浓缩，硅胶柱层析得化合物4的白色粉末250mg,将此白色粉末溶于10ml乙腈中，加入292mg(1.11mmol)TPP，油浴升温至75-80℃，磁力搅拌24h后TLC检测反应基本完全，减压蒸干溶剂后，硅胶柱层析，得白色固体II-a。Data for II-a：Mp：135-143℃[α]_D ²⁰＝+15.2°(c 0.1，CH₃OH)，¹H NMR(CDCl₃，400MHz)7.85(dd,J＝12.6,7.5Hz,6H),7.79(dd,J＝8.0,6.1Hz,3H),7.69(td,J＝7.6,3.4Hz,6H),4.73(s,1H),4.61(s,1H),4.37(dd,J＝10.6,5.8Hz,1H),3.91(t,J＝14.1Hz,2H),3.01(td,J＝10.5,4.5Hz,1H),2.38(t,J＝6.8Hz,2H),2.28(d,J＝12.8Hz,1H),2.18(td,J＝12.6,3.4Hz,1H),2.04(dd,J＝14.6,7.1Hz,2H),1.96(dd,J＝16.4,7.1Hz,2H),1.69,0.96,0.81 0.75,0.72(s,3H)(6-CH3).¹³C NMR(CDCl₃,100MHz),172.94,150.47,134.98,133.75,130.48,118.77,117.92,109.68,80.86,77.36,77.05,76.73,65.31,56.33,55.38,50.37,49.29,46.94,42.41,41.96,40.67,38.36,37.78,37.10,34.20,33.89,32.17,30.58,30.13,29.70,29.12,28.02,25.44,23.71,23.35,23.10,22.85,21.98,20.87,19.37,18.13,16.56,16.13,14.65,14.10,11.11；HR-ESI-MS(m/z):801.5020[M-Br]^-。

合成路线如下：

实施例5：化合物Ⅱ-b制备

将白桦酸(1.0g,2.19mmol)与EDC(1.05g,5.47mmol)、DMAP(108mg,0.88mmol)、5-溴戊酸(1.63g,8.76mmol)混合置于200ml圆底烧瓶中，加入40ml二氯甲烷，常温反应约11h，TLC检测反应达平衡，加入三蒸水洗三次后有机相用无水硫酸钠干燥7h后抽滤除去硫酸钠，减压浓缩，硅胶柱层析得化合物4的白色粉末600mg，将此白色粉末300mg(0.48mmol)与CH₃I(127.5μL,L2.04mmol)、K₂CO₃(284.5mg,2.04mmol)溶于20mL DMF中常温反应24h后TLC检测反应结束，加入三蒸水洗掉DMF和K₂CO₃，有机相用二氯甲烷萃取，萃取三次后弃掉水层，有机层用无水硫酸钠干燥7h后抽滤除去硫酸钠，减压浓缩，硅胶柱层析得化合物5的白色固体200mg，将此白色固体溶于10ml乙腈中，加入376mg(1.243mmol)TPP，油浴升温至75-80℃，磁力搅拌24h后TLC检测反应基本完全，减压蒸干溶剂后，硅胶柱层析得产物乳黄色固体Ⅱ-b。Data forⅡ-b：¹H NMR(MeOD 600MHz)δ7.91–7.88(m,3H),7.83–7.79(m,6H),7.76(ddd,J＝8.2,5.5,2.8Hz,6H),4.72(d,J＝1.8Hz,1H),4.60(d,J＝1.4Hz,1H),4.40(dd,J＝11.6,4.9Hz,1H),3.66(s,3H),3.51–3.44(m,2H),3.00(td,J＝10.9,5.1Hz,1H),2.40(t,J＝7.1Hz,2H),1.69(d,J＝7.6Hz,3H),1.01(s,3H),0.94(s,3H),0.86(s,3H),0.80(s,3H),0.77(s,3H).¹³C NMR(MeOD 150MHz)δ176.23,173.06,150.44,134.95,134.93,133.46,133.39,130.23,130.14,118.74,118.16,108.91,81.06,59.64,56.34,55.38,50.43,49.16,42.17,40.57,38.24,38.11,37.46,36.88,36.55,34.02,33.11,31.73,30.26,29.36,27.16,25.64,25.52,25.42,23.34,21.68,21.66,21.27,20.92,20.71,18.16,17.85,15.66,15.37,15.21,13.76,13.30；HR-ESI-MS(m/z):815.5176[M-Br]+.

合成路线如下：

实施例6：化合物Ⅴ制备：

将TPP(2g,6.84mmol)与1,5-二溴戊烷(4.7mL,34.2mmol)溶于20mL乙腈中，油浴升温至75-80℃，磁力搅拌12h后TLC检测反应基本完全，减压蒸干溶剂后，硅胶柱层析得化合物6的黄色油状液体2.8g。将该油状液体(2.8g,5.69mmol)与乙二胺(1.9ml,28.44mmol)溶于30mL四氢呋喃中室温搅拌3h后TLC检测反应基本完全，减压蒸干溶剂后，使用SphadexLH-20凝胶柱分离得化合物7的黄色油状液体2g。取11-羰基-β-乙酰乳香酸(AKBA，80mg,0.156mmol)溶于2mL氯化亚砜中，油浴升温至75-80℃，磁力搅拌2h后TLC检测反应完全，将氯化亚砜减压蒸干后，将产物溶于10mL二氯甲烷中，加入三乙胺(64.8μL，0.468mmol)，冰浴下缓慢滴加上述化合物7 221.2mg，30min后升至室温搅拌12h后TLC检测反应基本完全，减压抽滤后，用2M HCl萃取三次，有机相用无水硫酸钠干燥7h后抽滤除去硫酸钠，厚制备版制备得黄色化合物Ⅴ50mg。Data forⅤ：Mp：148-157℃[α]_D ²⁰＝+37.8°(c 0.1，CH₃OH)，1H NMR(CDCl₃ 600MHz)δ7.80(dt,J＝6.9,3.4Hz,3H),7.77–7.73(m,6H),7.70(td,J＝7.8,3.6Hz,6H),7.44(d,J＝4.7Hz,1H),5.50(s,1H),4.10(q,J＝7.2Hz,1H),3.81–3.75(m,1H),3.61–3.54(m,3H),3.53–3.46(m,2H),3.21–3.16(m,1H),3.01(dd,J＝10.8,7.0Hz,1H),2.96–2.86(m,3H),2.04(s,3H),1.31(s,3H),1.23(s,3H),1.14(s,3H),1.02(s,3H),0.92(s,3H),0.79(s,3H),0.77(d,J＝6.4Hz,3H).¹³C NMR(CDCl₃ 150MHz)δ199.46,176.50,170.30,164.90,135.20,135.18,133.57,133.51,130.62,130.53,130.45,118.27,117.70,73.96,60.51,60.38,59.01,50.41,48.45,47.94,46.65,45.03,43.75,40.89,39.26,37.31,36.57,34.86,33.96,32.93,30.88,29.66,28.87,27.48,27.11,26.68,26.57,24.56,24.04,23.95,22.05,21.71,21.55,21.52,21.43,21.11,21.04,20.45,19.35,18.32,17.40,14.17,13.09.HR-ESI-MS(m/z):885.5721[M-Br]^-。

合成路线如下：

实施例7：白桦醇，白桦酸结构改造化合物与白桦醇，白桦酸抗肿瘤活性对照研究

1.实验材料

对照药物：白桦醇，白桦酸；

实验药物：本发明实施例制备的化合物Ⅰ-a，化合物Ⅰ-b，化合物II-a。

细胞培养：K562细胞株：中科院上海细胞库，A549细胞株：山东大学药学院；RPMI-1640培养液,胎牛血清：以色列Bioind；胰蛋白酶：美国Amresco公司；MTT(四甲基偶氮唑)，DMSO(二甲基亚砜)：美国Sigma公司；青霉素-链霉素溶液(100×，过滤除菌)：中国赛尔斯公司；PBS(磷酸盐缓冲液)：索莱宝生物有限公司。

仪器：酶联免疫检测仪：美国Bio-Rad；移液器：法国Gilson；生物安全柜1300series A2，二氧化碳培养箱：美国Thermo公司；灭菌锅：日本松下。

2.实验方法

将人慢性髓原白血病细胞K562和人肺腺癌细胞A549在含10％胎牛血清，100U/ml青霉素和100mg/ml链霉素的RPMI-1640培养液中，培养在5％CO2，饱和湿度的37℃培养箱中。

对于K562细胞：收集对数生长期细胞，用含10％胎牛血清的RPMI-1640培养液配成浓度为2×104/mL细胞悬液，接种在96孔培养板,每孔500μL，随后每孔加入用含10％胎牛血清的RPMI-1640培养液稀释的500μL不同浓度的化合物，每个浓度设3个对照。培养48h后，每孔加入10μLMTT溶液(0.5mg/ml，1％MTT)。4h后终止培养，使用平板离心机将96孔板2500rpm离心10min后小心洗掉上清液。每孔加入100μl二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD570nm处测量各孔的吸光值(630nm校准)。

对于A549细胞：收集对数生长期细胞，用含10％胎牛血清的RPMI-1640培养液配成浓度为2×104/mL细胞悬液，接种在96孔培养板,每孔0.1mL，生长16-24h待细胞完全贴壁后每孔加入0.1ml不同浓度的化合物，每个浓度设3个对照。培养48h后，每孔加入10μLMTT溶液(0.5mg/ml，1％MTT),继续培养4h。终止培养，轻轻吸掉孔内上清液。每孔加入100μl二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD570nm处测量各孔的吸光值(630nm校准)。

所有结果按公式：lgIC50＝Xm-I*(sigP-(3-Pm-Pn)/4)，计算出IC50，其中Xm:药物最高浓度的对数值；sigP:所有抑制率的总和；I:lg(药物最高浓度/与最高浓度相邻的药物浓度)；Pm:最大杀伤率；Pn:最小杀伤率。

3.实验结果

活性对照实验结果见表1-表2，图1-图2。

表1，化合物Ⅰ-a、化合物Ⅰ-b与白桦醇的IC₅₀(μM)比较

表2，化合物II-a与白桦酸的IC₅₀(μM)比较

由表1、表2，图1，图2可以看出：本发明制备的白桦醇，白桦酸的TPP衍生物与母药相比对K562细胞株和A549细胞株表现出了明显的增值抑制作用的提高，最低提高了12.4倍，最高提高了31.3倍。为开发应用新一代抗肿瘤药物开拓了新途径。

同样药物浓度(5μM)下，本发明制备的化合物Ⅰ-a，Ⅰ-b，II-a，以及白桦醇、白桦酸对A549细胞的抑制率结果见图3。

由图3可以看出，同等药物浓度下，本发明制备的化合物Ⅰ-a，Ⅰ-b，II-a的药理活性与白桦醇，白桦酸相比，对A549细胞的增殖抑制作用有了明显提高。

实施例8：化合物Ⅰ-a在不同浓度下对K562细胞作用的形态变化

1.实验材料

实验药物：本发明实施例制备的化合物Ⅰ-a。

细胞培养：K562细胞株：中科院上海细胞库；RPMI-1640培养液,胎牛血清：以色列Bioind；胰蛋白酶：美国Amresco公司；青霉素-链霉素溶液(100×，过滤除菌)：中国赛尔斯公司

仪器：移液器：法国Gilson；生物安全柜1300series A2，二氧化碳培养箱：美国Thermo公司；灭菌锅：日本松下。

2.实验方法

将人慢性髓原白血病细胞K562在含10％胎牛血清，100U/ml青霉素和100mg/ml链霉素的RPMI-1640培养液中，培养在5％CO₂，饱和湿度的37℃培养箱中。

收集对数生长期细胞，用含10％胎牛血清的RPMI-1640培养液配成浓度为10⁵/mL细胞悬液，接种在6孔培养板，每孔2mL，分别设置0μM,0.5μM,1,5μM,5μM，10μM五个浓度梯度加入化合物Ⅰ-a，在培养箱中培养24h后，于倒置荧光显微镜下拍摄细胞形态。实验结果见图4。

由图4可以看出，低浓度下作用24h后细胞形态尚可维持，随浓度的增大，破裂的细胞逐渐增多，10μM浓度作用24h后细胞已全部死亡。由此得出结论，化合物Ⅰ-a对K562的增值抑制作用具有浓度依赖性。

实施例9：流式细胞术检测化合物Ⅰ-a诱发K562细胞凋亡

1.实验材料

实验药物：本发明实施例制备的化合物Ⅰ-a。

细胞培养：同实施例8

仪器：移液器：法国Gilson；生物安全柜1300series A2，二氧化碳培养箱：美国Thermo公司；灭菌锅：日本松下。流式细胞仪：美国BD。

2.实验方法

收集对数生长期细胞，用含10％胎牛血清的RPMI-1640培养液配成浓度为10⁵/mL细胞悬液，接种在6孔培养板，每孔2mL，分别设置0μM，0.4μM，0.6μM，0.8μM，1.0μM，1.2μM六个浓度梯度加入化合物Ⅰ-a，在培养箱中培养48h后，将细胞收集至15mL离心管中，1700rpm离心7min，弃掉上清液，用冰PBS洗一遍，弃上清。用碧云天AnnexinⅤ-FITC/PI细胞凋亡试剂盒对细胞染色：每管中加入500μL buffer重悬细胞，分别加入AnnexinⅤ5μL，PI 5μL，避光放置染色15min。1h之内上机检测。实验结果见图5。

由图5可以看出，化合物Ⅰ-a在0.4μM浓度下对K562细胞有了明显的凋亡作用。随着浓度的升高，发生凋亡的细胞比例逐渐增多，1.2μM浓度下，有约51.8％的细胞发生了凋亡。

上述虽然结合附图对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。

Claims

1.一类五环三萜衍生物，其结构式如式Ⅰ、式Ⅱ、式Ⅲ、式Ⅳ或式Ⅴ所示：

其中，R₁为氢、甲酰基、乙酰基或(n＝1-19)，

2.如权利要求1所述的五环三萜衍生物，其特征在于，其是选自下列结构的化合物：

3.权利要求1或2所述的五环三萜衍生物在制备抗肿瘤药物中的用途。

4.一种权利要求1或2所述的五环三萜衍生物的制备方法，所述方法包括：以五环三萜化合物为起始原料，使五环三萜化合物的至少一个羟基进行酯化反应，得中间体化合物，然后将中间体化合物与三苯基膦发生成盐反应，生成式Ⅰ、式Ⅱ、式Ⅲ或式Ⅳ所示的五环三萜衍生物；

或者，将三苯基膦与1,5-二溴戊烷在乙腈中发生成盐反应，然后将成盐反应的产物与乙二胺在四氢呋喃中发生取代反应；将乳香酸与氯化亚砜发生酯化反应后，再与上述取代反应的产物进行酰胺化反应，生成式Ⅴ所示的五环三萜衍生物。

5.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，生成式Ⅰ、式Ⅱ、式Ⅲ或式Ⅳ所示的五环三萜衍生物的过程中，所述酯化反应采用的是EDC/DMAP法，以二氯甲烷作为溶剂，室温下反应，五环三萜化合物、EDC、DMAP与5-溴戊酸和二氯甲烷加入量的比为：1mol:(2.5-2.6)mol:(0.4-0.5)mol:(4-4.1)mol:2000mL。

6.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，生成式Ⅰ、式Ⅱ、式Ⅲ或式Ⅳ所示的五环三萜衍生物的过程中，所述成盐反应是以乙腈作为溶剂，中间体化合物、三苯基膦和乙腈加入量的比为1mol：(3-3.1)mol：1000mL，70-80℃加热回流。

7.一种药物组合物，其包含权利要求1或2所述的五环三萜衍生物。

8.如权利要求7所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物还包含一种或多种药学上可接受的载体和/或赋形剂。

9.如权利要求5或6所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物为固体口服制剂或肠胃外给药制剂。

10.根据权利要求9所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物为片剂、分散片、肠溶片、咀嚼片、口崩片、胶囊、糖衣剂、颗粒剂、干粉剂、口服溶液剂、注射用小水针、注射用冻干粉针、大输液或小输液。