CN102577971A

CN102577971A - 利用孢子半组培法快速繁殖蜈蚣草的方法

Info

Publication number: CN102577971A
Application number: CN2012100611701A
Authority: CN
Inventors: 周密; 杨兵; 廖斌; 李金天; 束文圣
Original assignee: National Sun Yat Sen University
Current assignee: Sun Yat Sen University; National Sun Yat Sen University
Priority date: 2012-03-09
Filing date: 2012-03-09
Publication date: 2012-07-18

Abstract

本发明公开了一种利用孢子半组培法快速繁殖蜈蚣草的方法，将蜈蚣草孢子进行无菌化处理后，在培养基上培养形成配子体，将配子体播种于土壤中培养成为蜈蚣草幼苗；培养形成配子体的过程，是将无菌的蜈蚣草孢子接种于1/2MS培养基上进行培养，培养温度22~28℃，培养过程进行定期光照，光照条件为光强度2000~2500lx，每天光照12~14小时，培养5~8天即孢子萌发形成配子体；将配子体培养成为蜈蚣草幼苗的过程为：将配子体在1/10MS培养基中浸泡0.5-1.5小时，播种于土壤表面，并进行表面覆膜，自然光照条件下培养3~5天。本发明的培养方法可以缩短蜈蚣草繁殖周期和简化了操作步骤，成活率高，并且繁殖系数大幅提高。

Description

利用孢子半组培法快速繁殖蜈蚣草的方法

技术领域

本发明涉及一种植物组织培养方法，更具体地涉及利用蜈蚣草（Pteris vittata L.）孢子，通过半组培法进行快速种苗繁殖的方法。

背景技术

蜈蚣草（pteris vittata L.）是水龙骨目凤尾蕨科凤尾蕨属的多年生草本植物，在中国主要分布在秦岭以南的热带、亚热带地区，生于路旁、石缝或石灰岩山地，是钙质土或石灰岩的指示植物。民间全草药用，能祛风、杀虫、治疳疮；也可盆栽供观赏。自2001年发现蜈蚣草对砷具有先天耐性和超富集能力以来，其用于科学研究和修复水体或土壤重金属污染方面的潜在价值已吸引了科学界、环保界和企业界人士的关注。

蜈蚣草可以通过根茎、孢子和孢子体植株（外植体）多种方式繁殖。蜈蚣草孢子极小，抵御外界环境能力弱，因此自然条件下萌发率低，很难获得大规模的植物材料。陈同斌等通过组织培养的方法繁殖蜈蚣草，具体包括蜈蚣草孢子经过无菌培养获得孢子体，以此作为外殖体，在适当的激素条件下诱导愈伤组织，后续增殖培养、生根培养、移栽等步骤。整个过程大概需要5-6个月，并且大多数步骤涉及到激素的运用和无菌操作，使得短期内通过组织培养方法获得大量的种苗有相当的难度。如果依靠根茎进行繁殖，繁殖系数低，要从野外获得大量的根茎费时费力且难以保证存活率，不能满足实际需求。蜈蚣草孢子小但数量庞大，携带方便且容易保存，但如何突破孢子萌发困难的瓶颈是迅速获得大量蜈蚣草种苗的关键步骤。而目前，利用蜈蚣草孢子繁殖蜈蚣草的方法还很少，申请号为200510086732.8的中国专利公开了一种利用蜈蚣草孢子进行快速组培繁殖的方法，主要是采用特定的培养基来诱导蜈蚣草孢子出芽，发明发现采用不同的培养基时，会在较大程度上影响孢子植株产生率，当采用MS培养基时，其产生率仅<10%，效果不理想。

发明内容

本发明的目的在针对现有技术的不足，提供一种快速繁殖蜈蚣草的方法，具体来说是利用孢子半组培法快速繁殖蜈蚣草的方法。该方法不受自然条件、地区差异或时间的限制，繁殖系数高且速度快，能大规模快速繁殖蜈蚣草种苗用于砷污染土壤的修复和其它观赏性用途。

发明将蜈蚣草孢子消毒后，接种于MS基本培养基上，在合适的条件下进行培养，发现其可以形成极大量的配子体；配子体与适当介质混匀直接散播于土壤表面，在合适的培养条件下迅速形成大量的蜈蚣草种苗。

发明首先将蜈蚣草孢子进行无菌化处理后，在培养基上培养形成配子体，将配子体播种于土壤中培养成为蜈蚣草幼苗，其中培养形成配子体的过程，是将无菌的蜈蚣草孢子接种于MS培养基上进行培养，培养温度22~28℃，培养过程进行定期光照，光照条件为光强度2000~2500 lx，每天光照12~14小时，培养5~8天即形成配子体。

其中将配子体培养成为蜈蚣草幼苗的过程为：将配子体在MS培养基中浸泡0.5~1.5小时，播种于土壤表面，并进行表面覆膜，自然光照条件下培养3~5天。在该培养过程中每天喷水1-5次；培养温度为22~25 ℃，空气湿度60~80%。

发明优选采用以下方案进行：

1）孢子无菌化处理：

选择成熟的蜈蚣草孢子，以0.1% HgCl₂为消毒剂，消毒4~8分钟；或以5% NaClO为消毒剂，消毒8~12分钟，而后均以无菌水冲洗4-8次，获得无菌的的孢子悬浊液。

2）蜈蚣草孢子的萌发（配子体（原叶体）的形成）

无菌的孢子悬浊液接种于MS基本培养基上（优选1/2 MS），培养温度22~28℃，光强度2000~2500 lx，光照时间12~14小时/天。孢子萌发而后形成原叶体。若要获得更大量的配子体，可将已形成的配子体转接到新的MS培养基上。

3）孢子体的形成

配子体在1/10 MS中分散0.5~1.5小时后，散播于土壤中，表面覆膜，并且每天喷水1-5次（一般持续7天）。自然光照条件下培养，温度22~25 ℃，空气湿度60~80%。约一周后在原叶体上会有孢子体幼苗产生。

与现有技术相比，本发明具有以下突出效果：

1）缩短蜈蚣草繁殖周期和简化了操作步骤，成活率高。

本发明的半组培方法既突破了蜈蚣草繁殖时孢子萌发慢及萌发率低的问题，又简化了使用植株作为外植体进行组织培养时激素诱导、移栽、炼苗等繁琐工序，仅孢子形成配子体这一步需要在一般无菌室内操作，其余步骤均在正常条件下进行，因此可简便、快速、大量繁殖As超富集植物蜈蚣草。利用优化方案仅1~2个月就能繁育出大量种苗，移栽时由于其生活条件改变不大，成活率大于90%。

2）繁殖系数大幅提高。

利用优化的组培条件，孢子在一周内即可在培养基上萌发，并且萌发率达70%以上。3-4周就可形成配子体，如需要进一步扩大配子体，仅需将少量配子体转接到新的培养基上，即可在1-2周形成大量的配子体，增殖系数超过100。配子体散播到土壤中后，在适当的光照和水份条件下，1-2周内即有超过50%的配子体会形成孢子体幼苗（孢子体植株）。

具体实施方式

以下通过具体的实施例进一步说明本发明的技术方案。

实施例1 蜈蚣草孢子无菌化处理

取成熟的蜈蚣草孢子，以0.1% HgCl₂为消毒剂，消毒1、2、4、6、8分钟；和以5% NaClO为消毒剂，消毒3、6、8、10、12分钟，而后均以无菌水冲洗4-8次，获得无菌的的孢子悬浊液。将上述处理下的无菌孢子悬浊液接种于MS基本培养基上，培养温度20~25 ℃，光强度1500~3000 lx，光照时间12~14小时/天，14天后观察每个处理的染菌情况。实验结果表明，以0.1% HgCl₂消毒4-8分钟或以5% NaClO消毒8-12分钟，染菌率均低于20%。当以0.1% HgCl₂消毒6分钟或以5% NaClO消毒10分钟，染菌比例最低，低于10%。

实施例2 蜈蚣草孢子的萌发

将以上述最优条件灭菌过的蜈蚣草孢子，接种到不同比例的MS培养基（MS、1/2 MS、1/5 MS、1/10 MS、无MS），在不同的光强度（1000、1500、2000、2500、3000 lx）和不同光照时间（8、10、12、14、16、18小时/天）下，14天后观察每个处理的染菌情况和孢子萌发的情况。结果表明，这些培养基上3~5天均出现肉眼可见的绿色小点，表明孢子已经萌发，不同培养条件下萌发率均达到90%以上（随机在培养基上接种孢子30处，以5天内培养基上出现绿点占总接种数的比例计），但光强度2000~2500 lx，光照时间12~14小时/天下萌发率较其它条件略高（表1）。在以上培养基上，两周内均出现配子体（原叶体）。无MS的所有光照培养条件下，配子体的增殖情况都很差。在1/2 MS培养基上，以及在光强度2000~2500 lx，光照时间12~14小时/天下，配子体的生长状况最好和增殖速度最快，增殖系数平均值达到105。在不同的实验条件下接种同样数量的配子体在培养基上，2周后通过接种前后重量的比较确定增殖系数，如表2所示：

Figure 2012100611701100002DEST_PATH_IMAGE002

实施例2 蜈蚣草孢子体（幼苗）的形成

取大致相等的配子体在水、MS液体培养基、1/2 MS、1/5 MS、1/10 MS中分散，然后散播于土壤表面，分为表面覆膜和不覆膜两个处理，同时分为每天表面喷水1、3、5次三个水平，自然光照条件下，温度22~25 ℃，空气湿度60~80%，观察孢子体出现的时间和数目。

结果表明，尽管增加喷水次数可增加孢子体的数目，但不同的喷水次数对于孢子体出现的时间几乎无影响。表面覆膜处理和不覆膜相比，孢子体出现的时间提前并且数目增加。在以上这些介质中，孢子体出现的时间和数目并无明显的差异，但是1/10 MS中孢子体的生长状态最好。

综合以上结果可得出配子体在1/10 MS中分散后散播于土壤中，表面覆膜，并且每天喷水3次，经过3天的培养即有孢子体植株形成，2周内可获得生长状况良好的大量蜈蚣草幼苗。该实施例培育的蜈蚣草，可直接用于相应科学试验，以及移栽后应用于修复重金属污染土壤或水体。

Claims

1.利用孢子半组培法快速繁殖蜈蚣草的方法，将蜈蚣草孢子进行无菌化处理后，在培养基上培养形成配子体，将配子体播种于土壤中培养成为蜈蚣草幼苗，其特征在于所述的培养形成配子体的过程，是将无菌的蜈蚣草孢子接种于1/2 MS培养基上进行培养，培养温度22~28℃，培养过程进行定期光照，光照条件为光强度2000~2500 lx，每天光照12~14小时，培养5~8天即孢子萌发形成配子体。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述的MS培养基为1/2MS培养基。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述的培养成为蜈蚣草幼苗的过程为：将配子体在1/10 MS培养基中浸泡0.5~1.5小时，播种于土壤表面，并进行表面覆膜，自然光照条件下培养3~5天。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于所述的MS培养基为1/10 MS培养基。

5.如权利要求3所述的方法，其特征在于所述培养过程中每天喷水1-5次。

6.如权利要求3所述的方法，其特征在于所述的培养温度为22~25℃，空气湿度60~80%。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述的无菌化处理是以0.1% HgCl₂为消毒剂，消毒4~8分钟。

8.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述的无菌化处理以5% NaClO为消毒剂，消毒8~12分钟。