CN105379626A - 一种西南凤尾蕨组织培养快速繁殖的方法 - Google Patents

一种西南凤尾蕨组织培养快速繁殖的方法 Download PDF

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Abstract

一种西南凤尾蕨组织培养快速繁殖的方法，包括如下步骤：(1)取西南凤尾蕨的成熟孢子作为外植体进行消毒；(2)将消毒后的外植体置于MS基本培养基中诱导出原叶体；(3)将原叶体置于MS诱导培养基中进行壮苗培养获得分化出苗的孢子体；(4)将所述分化出苗的孢子体置于1/2MS生根培养基中进行培养得到完整的生根苗。(5)取完整的生根苗进行炼苗后移栽至育苗大棚。采用本发明所述方法得到的植株粗壮、成活率高，能够在短期内提供大量优质的、适合栽培的西南凤尾蕨种苗，有效的解决西南凤尾蕨规模化育苗的问题。

Description

一种西南凤尾蕨组织培养快速繁殖的方法
技术领域
本发明涉及一种植物组织培养快速繁殖方法，特别是一种西南凤尾组织培养快速繁殖的方法。
背景技术
西南凤尾蕨，为凤尾蕨科凤尾蕨属西南凤尾蕨(Pteriswallichiana)大型陆生植物，生于海拔800～2000m的林下沟谷或林缘。分布于台湾、广东、广西、贵州、海南等地。味苦、涩，性凉。具有清热止痢，定惊，止血的功能。主治痢疾，小儿惊风，外伤出血等症。
西南凤尾蕨叶形优美、叶色青翠碧绿，具有较高的园林观赏价值和一定的药用价值。药用蕨类植物含有生物碱、黄酮类、酚类等多种活性物质，对许多疾病有明显的治疗作用。随着观赏植物的发展和对蕨类药用植物的利用，人们对蕨类植物的需求量日益增大。
蕨类传统的繁殖方法主要是依靠孢子繁殖和分株繁殖，而孢子繁殖在自然环境中的成苗率很低，分株繁殖则需要时间长并且得到的苗数量少，不能在短期内满足大量种苗的需求。目前，由于繁育技术不过关，主要是通过野外采挖获得，而野外采挖对野生蕨类植物资源造成严重的破坏，人类活动的干扰加之植物本身的原因使蕨类资源受到威胁。
发明内容
本发明的目的是提供一种西南凤尾蕨组织培养快速繁殖方法，能够有效缩短西南凤尾蕨的生产周期，提高种苗质量，减低生产成本，满足西南凤尾蕨生产上的需要。
本发明通过以下技术方案达到上述目的：一种西南凤尾蕨组织培养快速繁殖方法，包括以下步骤：
(1)外植体的选择和消毒：取西南凤尾蕨的成熟孢子作为外植体，将外植体在流水下缓慢冲洗，除去表面的污垢，放入烧杯中，先用2v/v％的洗洁精液浸泡15min后，再用流水冲洗10min，将外植体移至超净工作台上，用75v/v％的酒精表面消毒15s，再用添加了1-2滴吐温-20的100ml浓度为0.1v/v％HgC12消毒8～15min，无菌水浸泡3次，用无菌滤纸吸干外植体表面水分后进行接种，其中无菌水为经高温高压灭菌的蒸馏水；
(2)孢子诱导：将步骤(1)得到的外植体接种到MS孢子诱导培养基中，在培养温度为22～28℃，光照强度20～30μmol·m-2·s-1，光照时间12h·d-1，离体诱导20d，孢子萌发获得原叶体，其中MS孢子诱导培养基中添加0.5～1.0mg/L的6-BA、0.1～2.0mg/L的NAA，30g/L蔗糖，4.5g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8；
(3)增殖壮苗培养：将步骤(2)得到的原叶体接种到增殖壮苗一体化的MS培养基中，在培养温度为22～28℃，光照强度20～30μmol·m-2·s-1，光照时间为12h·d-1的条件下培养，得到分化出苗的孢子体，所述的增殖壮苗一体化的MS培养基中还添加0.5～2.5mg/L的6-BA、0.1～2.0mg/L的NAA，1.0g/L的AC，30g/L蔗糖，4.5g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8；
(4)生根培养：将步骤(3)中得到的孢子体接种到1/2MS生根培养基中，在培养温度为22～28℃，光照强度20～30μmol·m-2·s-1，光照时间为12h·d-1的条件下培养，获得根系发达的生根苗，其中1/2MS生根培养基中添加0～0.5mg/L的6-BA、0～0.5mg/L的NAA，1.0g/L的AC，30g/L蔗糖和4.5g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8；
(5)生根苗的炼苗与移栽：将步骤(4)中得到的生根苗放在的大棚内，将瓶盖打开，炼苗3d，取出生根苗，洗净根部的培养基，于阴天傍晚移栽至平整精耕的育苗床上，育苗要求相对湿度为90～95％，温度为23～30℃，光照为自然光，大棚上部覆盖一层遮阳网，遮光度为15～30％。
所述MS为MS基本培养基，BA为6-苄基腺嘌呤，NAA为萘乙酸，AC为活性炭。
本发明的突出优点在于：
1、通过孢子离体诱导培养出无菌苗，在短时间内培育出大量长势良好的可供移栽的西南凤尾蕨幼苗，提供优质种苗，满足生产上的需要。
2、通过增殖壮苗一体化的培养基，进行西南凤尾蕨的规划育苗，缩短了培养时间，减少培养步骤，降低了培养成本，提高了西南凤尾蕨组培种苗的生产效率。
3、在增殖壮苗一体化的培养基上培养获得分化出苗的孢子体健康粗壮、颜色翠绿、无玻璃化现象，接种到生根培养基上生根情况良好，生根率达到90％以上。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的技术方案进一步说明。
实施例1
本发明所述的西南凤尾蕨组织培养快速繁殖方法的一个实例，包括如下步骤：
(1)外植体的选择和消毒：取西南凤尾蕨的成熟孢子作为外植体，将外植体在流水下缓慢冲洗，除去表面的污垢，放入烧杯中，先用2v/v％的洗洁精液浸泡15min后，再用流水冲洗10min，将外植体移至超净工作台上，用75v/v％的酒精表面消毒15s，再用添加了1-2滴吐温-20的100ml浓度为0.1v/v％HgC12消毒8～15min，无菌水浸泡3次，用无菌滤纸吸干外植体表面水分后进行接种，其中无菌水为经高温高压灭菌的蒸馏水；
(2)孢子诱导：将步骤(1)得到的外植体接种到MS诱导培养基中，在培养温度为22～28℃，光照强度20～30μmol·m-2·s-1，光照时间12h·d-1，离体诱导20d，孢子萌发获得原叶体。所述的孢子MS诱导培养基中添加0.5mg/L的6-BA、1.0mg/L的NAA，30g/L蔗糖，4.5g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8，诱导率为45％；
(3)增殖壮苗培养：将步骤(2)得到的原叶体接种到增殖壮苗一体化的MS培养基中，在培养温度为22～28℃，光照强度20～30μmol·m-2·s-1，光照时间为12h·d-1的条件下培养，得到分化出苗的孢子体，所述的增殖壮苗一体化的MS培养基中还添加1.0mg/L的6-BA、0.1mg/L的NAA，1.0g/L的AC，30g/L蔗糖，4.5g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8，增殖倍数为5.53；
(4)生根培养：将步骤(3)中得到的孢子体接种到1/2MS生根培养基中，培养温度为22～28℃，光照强度20～30μmol·m-2·s-1，光照时间为12h·d-1的条件下培养，获得根系发达的生根苗，其中1/2MS生根培养基中添加0.5mg/L的6-BA、0.1mg/L的NAA，1.0g/L的AC，30g/L蔗糖和4.5g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8；
(5)生根苗的炼苗与移栽：将步骤(4)中得到的生根苗取出20瓶，每瓶10株，共200株，在大棚内打开瓶盖，向瓶中加入适量的水，炼苗3d。洗净根部残留培养基后统计生根植株为181株，生根率为90.5％，于阴天傍晚将181株生根苗移栽至育苗大棚，大棚内湿度为90～95％，温度为23～30℃，光照为自然光，大棚上部覆盖一层遮阳网，遮光度为15～30％。
实施例2
本发明所述的西南凤尾蕨组织培养快速繁殖方法的一个实例，包括如下步骤：
(1)外植体的选择和消毒：取西南凤尾蕨的成熟孢子作为外植体，将外植体在流水下缓慢冲洗，除去表面的污垢，放入烧杯中，先用2v/v％的洗洁精液浸泡15min后，再用流水冲洗10min，将外植体移至超净工作台上，用75v/v％的酒精表面消毒15s，再用添加了1-2滴吐温-20的100ml浓度为0.1v/v％HgC12消毒8～15min，无菌水浸泡3次，用无菌滤纸吸干外植体表面水分后进行接种，其中无菌水为经高温高压灭菌的蒸馏水；
(2)孢子诱导：将步骤(1)得到的外植体接种到MS诱导培养基中，在培养温度为22～28℃，光照强度20～30μmol·m-2·s-1，光照时间12h·d-1，离体诱导20d，孢子萌发获原叶体。所述的孢子MS诱导培养基中添加1.0mg/L的6-BA、0.5mg/L的NAA，30g/L蔗糖，4.5g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8，诱导率为60％；
(3)增殖壮苗培养：将步骤(2)得到的原叶体接种到增殖壮苗一体化的MS培养基中，在培养温度为22～28℃，光照强度20～30μmol·m-2·s-1，光照时间为12h·d-1的条件下培养，得到分化出苗的孢子体，所述的增殖壮苗一体化的MS培养基中还添加1.0mg/L的6-BA、0.5mg/L的NAA，1.0g/L的AC，30g/L蔗糖，4.5g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8，增殖倍数为6.85；
(4)生根培养：将步骤(3)中得到的孢子体接种到1/2MS生根培养基中，培养温度为22～28℃，光照强度20～30μmol·m-2·s-1，光照时间为12h·d-1的条件下培养，获得根系发达的生根苗，其中1/2MS生根培养基中添加0.5mg/L的NAA，1.0g/L的AC，30g/L蔗糖和4.5g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8；
(5)生根苗的炼苗与移栽：将步骤(4)中得到的生根苗取出20瓶，每瓶10株，共200株，在大棚内打开瓶盖，向瓶中加入适量的水，炼苗3d。洗净根部残留培养基后统计生根植株为180株，生根率为90.0％，于阴天傍晚将180株生根苗移栽至育苗大棚，大棚内湿度为90～95％，温度为23～30℃，光照为自然光，大棚上部覆盖一层遮阳网，遮光度为15～30％。
实施例3
本发明所述的西南凤尾蕨组织培养快速繁殖方法的一个实例，包括如下步骤：
(1)外植体的选择和消毒：取西南凤尾蕨的成熟孢子作为外植体，将外植体在流水下缓慢冲洗，除去表面的污垢，放入烧杯中，先用2v/v％的洗洁精液浸泡15min后，再用流水冲洗10min，将外植体移至超净工作台上，用75v/v％的酒精表面消毒15s，再用添加了1-2滴吐温-20的100ml浓度为0.1v/v％HgC12消毒8～15min，无菌水浸泡3次，用无菌滤纸吸干外植体表面水分后进行接种，其中无菌水为经高温高压灭菌的蒸馏水；
(2)孢子诱导：将步骤(1)得到的外植体接种到MS诱导培养基中，在培养温度为22～28℃，光照强度20～30μmol·m-2·s-1，光照时间12h·d-1，离体诱导20d，孢子萌发获原叶体。所述的孢子MS诱导培养基中添加1.0mg/L的6-BA、1.0mg/L的NAA，30g/L蔗糖，4.5g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8，诱导率为70％；
(3)增殖壮苗培养：将步骤(2)得到的原叶体接种到增殖壮苗一体化的MS培养基中，在培养温度为22～28℃，光照强度20～30μmol·m-2·s-1，光照时间为12h·d-1的条件下培养，得到分化出苗的孢子体，所述的增殖壮苗一体化的MS培养基中还添加1.0mg/L的6-BA、1.0mg/L的NAA，1.0g/L的AC，30g/L蔗糖，4.5g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8，增殖倍数为7.05；
(4)生根培养：将步骤(3)中得到的孢子体接种到1/2MS生根培养基中，培养温度为22～28℃，光照强度20～30μmol·m-2·s-1，光照时间为12h·d-1的条件下培养，获得根系发达的生根苗，其中1/2MS生根培养基中添加0.2mg/L6-BA、0.2mg/L的NAA，1.0g/L的AC，30g/L蔗糖和4.5g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8；
(5)生根苗的炼苗与移栽：将步骤(4)中得到的生根苗取出20瓶，每瓶10株，共200株，在大棚内打开瓶盖，向瓶中加入适量的水，炼苗3d。洗净根部残留培养基后统计生根植株为188株，生根率为94％，于阴天傍晚将188株生根苗移栽至育苗大棚，大棚内湿度为90～95％，温度为23～30℃，光照为自然光，大棚上部覆盖一层遮阳网，遮光度为15～30％。
实施例4
本发明所述的西南凤尾蕨组织培养快速繁殖方法的一个实例，包括如下步骤：
(1)外植体的选择和消毒：取西南凤尾蕨的成熟孢子作为外植体，将外植体在流水下缓慢冲洗，除去表面的污垢，放入烧杯中，先用2v/v％的洗洁精液浸泡15min后，再用流水冲洗10min，将外植体移至超净工作台上，用75v/v％的酒精表面消毒15s，再用添加了1-2滴吐温-20的100ml浓度为0.1v/v％HgC12消毒8～15min，无菌水浸泡3次，用无菌滤纸吸干外植体表面水分后进行接种，其中无菌水为经高温高压灭菌的蒸馏水；
(2)孢子诱导：将步骤(1)得到的外植体接种到MS诱导培养基中，在培养温度为22～28℃，光照强度20～30μmol·m-2·s-1，光照时间12h·d-1，离体诱导20d，孢子萌发获原叶体。所述的孢子MS诱导培养基中添加1.0mg/L的6-BA、2.0mg/L的NAA，30g/L蔗糖，4.5g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8，诱导率为80％；
(3)增殖壮苗培养：将步骤(2)得到的原叶体接种到增殖壮苗一体化的MS培养基中，在培养温度为22～28℃，光照强度20～30μmol·m-2·s-1，光照时间为12h·d-1的条件下培养，得到分化出苗的孢子体，所述的增殖壮苗一体化的MS培养基中还添加1.0mg/L的6-BA、1.5mg/L的NAA，1.0g/L的AC，30g/L蔗糖，4.5g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8，增殖倍数为6.90；
(4)生根培养：将步骤(3)中得到的孢子体接种到1/2MS生根培养基中，培养温度为22～28℃，光照强度20～30μmol·m-2·s-1，光照时间为12h·d-1的条件下培养，获得根系发达的生根苗，其中1/2MS生根培养基中添加0.5mg/L的6-BA、0.5mg/L的NAA，1.0g/L的AC，30g/L蔗糖和4.5g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8；
(5)生根苗的炼苗与移栽：将步骤(4)中得到的生根苗取出20瓶，每瓶10株，共200株，在大棚内打开瓶盖，向瓶中加入适量的水，炼苗3d。洗净根部残留培养基后统计生根植株为191株，生根率为95.5％，于阴天傍晚将191株生根苗移栽至育苗大棚，大棚内湿度为90～95％，温度为23～30℃，光照为自然光，大棚上部覆盖一层遮阳网，遮光度为15～30％。

Claims (1)

1.一种西南凤尾蕨组织培养快速繁殖的方法，其特征在于：该方法包括以下步骤：
(1)外植体的选择和消毒：取西南凤尾蕨的成熟孢子作为外植体，将外植体在流水下缓慢冲洗，除去表面的污垢，放入烧杯中，先用2v/v％的洗洁精液浸泡15min后，再用流水冲洗10min，将外植体移至超净工作台上，用75v/v％的酒精表面消毒15s，再用添加了1-2滴吐温-20的100ml浓度为0.1v/v％HgC12消毒8～15min，无菌水浸泡3次，用无菌滤纸吸干外植体表面水分后进行接种，其中无菌水为经高温高压灭菌的蒸馏水；
(2)孢子诱导：将步骤(1)得到的外植体接种到MS孢子诱导培养基中，在培养温度为22～28℃，光照强度20～30μmol·m-2·s-1，光照时间12h·d-1，离体诱导20d，孢子萌发获得原叶体，其中MS孢子诱导培养基中添加0.5～1.0mg/L的6-BA、0.1～2.0mg/L的NAA，30g/L蔗糖，4.5g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8；
(3)增殖壮苗培养：将步骤(2)得到的原叶体接种到增殖壮苗一体化的MS培养基中，在培养温度为22～28℃，光照强度20～30μmol·m-2·s-1，光照时间为12h·d-1的条件下培养，得到分化出苗的孢子体，所述的增殖壮苗一体化的MS培养基中还添加0.5～2.5mg/L的6-BA、0.1～2.0mg/L的NAA，1.0g/L的AC，30g/L蔗糖，4.5g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8；
(4)生根培养：将步骤(3)中得到的孢子体接种到1/2MS生根培养基中，在培养温度为22～28℃，光照强度20～30μmol·m-2·s-1，光照时间为12h·d-1的条件下培养，获得根系发达的生根苗，其中1/2MS生根培养基中添加0～0.5mg/L的6-BA、0～0.5mg/L的NAA，1.0g/L的AC，30g/L蔗糖和4.5g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8；
(5)生根苗的炼苗与移栽：将步骤(4)中得到的生根苗放在的大棚内，将瓶盖打开，炼苗3d，取出生根苗，洗净根部的培养基，于阴天傍晚移栽至平整精耕的育苗床上，育苗要求相对湿度为90～95％，温度为23～30℃，光照为自然光，大棚上部覆盖一层遮阳网，遮光度为15～30％。
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