CN102574930B - 活性酯化多糖及其制造方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供在溶解于水中时不产生不溶物的品质稳定的活性酯化多糖干燥品、以及能够以商业规模制造上述品质的活性酯化多糖的制造方法。本发明的活性酯化多糖的制造方法使具有羧基的多糖与亲电子性化合物进行酯化反应，使生成的活性酯化多糖与多元羧酸接触，然后使其析出并将其回收。

Description

活性酯化多糖及其制造方法

技术领域

本发明涉及活性酯化多糖及其制造方法。

背景技术

在多件文献中公开了向生物适合性高的多糖的侧链中导入交联性基团而形成的多糖衍生物可作为生物适合材料使用。其中，使向多糖的侧链中导入的羧基与亲电子性基团酯化，通过与含活性氢的基团接触，该酯键解离，由此羧基参与交联，具有上述结构的活性酯化多糖具有自交联性，尤其是可用作防粘连材料、止血材料、医疗用粘合材料等各种生物适合材料(参见专利文献1等)。

上述活性酯基通常为酰亚胺酯，尤其是以琥珀酰亚胺酯为代表。作为多糖的活性酯化，对于在分子内具有羧基的透明质酸，也报道了利用透明质酸四丁铵盐与N-羟基琥珀酰亚胺二苯基磷酸盐的反应的、透明质酸的琥珀酰亚胺活性酯的合成方法等(参见非专利文献1)，但以往通常这样进行：首先，向在分子内不具有羧基的多糖的侧链中导入羧基制成酸型多糖，使该羧基与N-羟基酰亚胺进行脱水缩合而形成酯。使生成的活性酯化多糖在不良溶剂中析出结晶，然后减压干燥形成粉末，在使用时溶解在水中。

专利文献1：国际公开2004/81055号

非专利文献1：Y.Luo等，Bioconjugate Chem.2001，12，1085-1088

发明内容

在使作为生物适合材料有用性高的活性酯化多糖产品化时，存在这样的问题：将干燥产品的活性酯化多糖溶于水时，有时产生团块等不溶物。对于含有不溶成分的产品来说，虽然到目前为止在实验水平的研究上并未报道出现问题，但在谋求商业规模增加的方面首先导致出现品质上的问题，另外在生产效率方面也成为问题。因而期求在溶解于水中时不产生不溶物的品质稳定的活性酯化多糖、以及即使增大制造规模也可稳定地制造上述品质的活性酯化多糖的方法。

本发明人对上述问题进行了多种研究，结果发现，通过使酯反应结束后的反应液与多元羧酸接触，可解决干燥产品溶于水时产生不溶物的课题。另外，也已经确认了也可抑制在最终干燥工序和贮存时目标物质的平均分子量(Mw)经时上升。从而可确保实现规模扩大，从而完成本发明。

需要说明的是，在上述研究过程中，对于由以往的制造方法得到的活性酯化多糖来说，其干燥产品产生水不溶性成分时，在对该活性酯化多糖进行GPC测定时，在高分子侧出现肩峰(shoulder)，或者确认到肩峰变宽，显示生成了高分子量成分。利用IR光谱推测该高分子侧的肩峰级分为活性酯化多糖的氢键合物。上述高分子量成分的生成对平均分子量(Mw)变化的贡献率不一定很大，因此，即使生成不溶成分，也不能说Mw的值显著变大。反之，虽然Mw有一定程度的增加时也不能说一定生成不溶成分，但事实上一般认为由以往的制造方法得到的活性酯化多糖在减压干燥时和贮存时Mw有经时增加的倾向，另外也发现Mw的经时变化率不均。进而发现Mw在减压干燥时的增加比在贮存时的增加显著，以及，如果抑制Mw在减压干燥时的增加则可抑制Mw在贮存时的增加。因此，减压干燥时的Mw评价可视为包括贮存稳定性在内的产品稳定性的评价。

另一方面，对于在上述制造过程中与多元羧酸接触过的活性酯化多糖来说，可抑制最终干燥产品在溶于水时生成不溶物，在进行GPC测定时，未确认在峰上高分子侧出现明显的肩或者宽肩化。另外，也可确认起到抑制Mw在减压干燥时经时增大的效果。本发明的制造过程中使用的多元羧酸几乎不残留在最终干燥产品中，在将该干燥产品溶于水时不产生不溶物的原因以及在减压干燥时高分子量成分的经时生成或Mw经时增大的抑制效果的原因，虽然尚不明确，但事实上通过在制造过程中与多元羧酸接触可得到稳定的干燥产品且重现性良好、能够可靠地保证干燥产品的水溶解性。因此，本发明提供如下发明。

本发明是一种活性酯化多糖的制造方法，其中，使酸型多糖的羧基与亲电子性基团导入剂进行酯化反应而生成活性酯化多糖，使生成的活性酯化多糖与多元羧酸接触，然后使其析出并将其回收。

通常，对回收上述沉淀后得到的活性酯化多糖进行减压干燥。

另外，本发明提供由上述方法得到的活性酯化多糖。

根据本发明，起到对最终干燥工序中的目标化合物的分子量经时上升的抑制效果。即使以商业规模也可稳定地制造不产生不溶物的活性酯化多糖(干燥品)，可提供品质稳定的活性酯化多糖。

具体实施方式

以下，参照制造方法具体地说明本发明。

本说明书中，将具有羧基的多糖称为“酸型多糖”。

本发明中，使酸型多糖的羧基、与亲电子性基团导入剂进行酯化反应，生成活性酯化多糖，使生成的活性酯化多糖与多元羧酸接触，然后使活性酯化多糖析出并将其回收。

<酸型多糖>

成为酸型多糖主链的多糖，只要是在主骨架上具有2单位以上的单糖结构的多糖即可，没有特别限制。可以举出例如阿拉伯糖、核糖、木糖、葡糖糖、甘露糖、半乳糖、果糖、山梨糖、鼠李糖、岩藻糖、脱氧核糖等单糖类；海藻糖、蔗糖、麦芽糖、纤维素二糖、龙胆二糖、乳糖、蜜二糖等二糖类；蜜三糖、龙胆三糖、松三糖、木苏糖等三糖以上的多糖类通过共价键形成的多糖、以及进一步向其导入官能团而形成的多糖。上述多糖可以是天然存在的也可以是人工合成的。

对于多糖的分子量没有特别限制。优选与上述单糖类、二糖类或三糖以上的多糖类以数十个～数千个键合形成的多糖相当的、平均分子量(Mw)为5～2500kDa的多糖。其原因在于，为上述多糖时，容易调节活性酯化多糖交联后的凝胶硬度，容易在1分子链内导入多个参与交联的活性酯基和含活性氢的基团。优选Mw为10～1000kDa的多糖。

酸型多糖中的“羧基”通常为羧酸基(-COOH)及羧基烷基(-RCOOH)。作为-RCOOH，可以举出羧基甲基、羧基乙基、羧基丙基、羧基异丙基、羧基丁基等。

酸型多糖只要是在活性酯化多糖的前体阶段为酸型即可，可以是自身具有羧基的天然酸型多糖，也可以是具有导入的羧基的酸型多糖。导入羧基的多糖可以是天然酸型多糖也可以是自身不具有羧基的多糖。

作为上述自身具有羧基的天然酸型多糖，没有特别限制，可以举出含有半乳糖醛酸的果胶和透明质酸等。

作为不具有羧基的多糖，没有特别限制，可以举出葡聚糖、支链淀粉、糊精等。

葡聚糖作为血浆代用品使用，能够以商品名为“Dextran Tfractions”(Amersham Biosciences公司)的产品得到。

支链淀粉作为包括口服药的药品添加剂使用，内毒素等的生物学污染少的物质较理想。支链淀粉能够以商品名为“Pullulan PI-20”(林原公司)的产品得到。

糊精是淀粉的水解物，是分子链长度不同的葡萄糖聚合物的混合物。糊精中的葡萄糖单位主要为α-1，4键，通常含有一定比例的α-1，6键。本发明中，糊精原料的淀粉种类没有特别限制，因此对α-1，6键的存在比例也没有特别限制。

对于本发明中使用的糊精来说，从获得容易性、使用时的物性、处理容易性、覆膜形成性等方面考虑，典型地为Mw10～200kDa左右的糊精。

在本发明中所有多糖均可使用通常商业流通的多糖。本发明中，从安全性方面考虑，可合适地使用在上述医疗用途中有实际效果的多糖。

其中，对于糊精来说，未报道有过敏性休克，在腹膜透析方面也有实际应用，且未报道有生物适应方面的缺陷，从上述方面考虑，是一种特别优选的多糖。

另外，酸型多糖优选为具有羧基甲基的羧基甲基化多糖。

需要说明的是，本发明中，酸型多糖中的羧基优选为未配位有盐的“非盐型”，优选最终得到的活性酯化多糖不是盐形态。此处，“盐”包括碱金属、碱土金属等无机盐、四丁铵(TBA)等季胺、碘化氯甲基吡啶鎓等卤盐等。“非盐型”是指未配位有上述“盐”，“不是盐形态”是指不含上述盐。

多糖的羧基化反应可利用公知的氧化反应进行，没有特别的限制。当将多糖的羟基氧化形成羧酸时，对于反应种类没有特别限制，可以举出例如四氧化二氮氧化、发烟硫酸氧化、磷酸氧化、硝酸氧化、过氧化氢氧化，分别可使用试剂选择通常已知的反应进行氧化。各反应条件可根据羧基的导入量适当设定。例如，使作为原料的多糖悬浮于氯仿或四氯化碳中，加入四氧化二氮，由此将多糖的羟基氧化，来调制具有羧酸的酸型多糖。

多糖的羧基烷基化反应可利用公知的方法，没有特别限制，具体而言，当为羧基甲基化反应时，可选择在将多糖烷基化后、使用一氯乙酸的反应。其反应条件可根据羧基甲基的导入量适当设定。此处的多糖通常以水溶液形式供于反应。

对于导入有羧基的酸型多糖来说，通常使用不良溶剂(通常为醇)使其析出并将其减压干燥。

本发明中，作为向多糖中导入羧基的方法，可利用上述羧酸化或羧基烷基化中的任一方法，没有特别限制，但从羧基导入反应引起的多糖分子量降低小、羧基的导入量相对容易控制的方面考虑，优选羧基烷基化、尤其是羧基甲基化。上述羧基甲基以下也记为“CM-”。

对于活性酯化中使用的酸型多糖来说，每1g干燥质量中的羧基(将该基团视为1分子)量通常为0.1～5mmol/g，优选0.4～3mmol/g，较优选0.5～2mmol/g。该羧基量的比例少于0.1mmol/g时，由该基团衍生、成为交联点的活性酯基数目通常不足。另一方面，羧基量的比例多于5mmol/g时，活性酯化多糖(未交联)难以溶于含有水的溶剂中。需要说明的是，酸型多糖的羧基量可通过以酚酞为指示剂的酸碱反滴定来定量。

本发明中，最终的活性酯化多糖中也可以残留未活性酯化的羧基。因此，上述羧基量是最终的活性酯化多糖中的活性酯基和未活性酯化的羧基的总量。

<活性酯化>

使上述酸型多糖与亲电子性基团导入剂反应，形成活性酯基。此时使用的酸型多糖可以是一种也可以同时使用两种以上。

活性酯基是强于通常的醇的亲电子性基团键合于羧基的羰基碳上而形成的基团，酯键在有碱共存时的水的存在下解离。作为上述形成活性酯基的亲电子性基团导入剂，典型地，可使用可比较便宜地得到的N-羟基胺类化合物。具体而言，作为代表例可以举出N-羟基琥珀酰亚胺、N-羟基降冰片烯-2，3-二甲酰亚胺、2-羟基亚氨基-2-氰基乙酸乙酯、2-羟基亚氨基-2-氰基乙酰胺、N-羟基哌啶、N-羟基邻苯二甲酰亚胺、N-羟基咪唑、N-羟基马来酰亚胺等。上述化合物也可以使用两种以上。

其中，N-羟基酰亚胺、尤其是N-羟基琥珀酰亚胺(以下也记为NHS)在肽合成领域有实际应用，容易在商业上得到，因而是理想的。

酸型多糖通常以非质子性极性溶剂的溶液的形式供于上述酯化反应。非质子性极性溶剂是指不具有质子(该质子可与具有电阳性官能团的亲核试剂形成氢键)的极性溶剂，没有特别限制，例如可以举出二甲基亚砜(DMSO)、N，N-二甲基甲酰胺、N-甲基-2-吡咯烷酮、N，N-二甲基乙酰胺、1，3-二甲基-2-咪唑啉酮等。从多糖相对于溶剂的溶解性良好方面考虑，可合适地利用DMSO。

如果为上述优选的“非盐型”的酸型多糖，则通常可通过在上述溶剂中加热至20℃～120℃左右来进行溶解。

酸型多糖与亲电子性基团导入剂的酯化反应通常在脱水缩合剂的存在下进行。

脱水缩合剂是这样的物质：除去1分子由羧基与亲电子性基团导入剂的缩合而生成的水分子，即，进行脱水，使两者形成酯键。作为脱水缩合剂，没有特别限制，可以举出例如1-乙基-3-二甲基氨基丙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)、1-环己基-(2-吗啉基-4-乙基)-碳二亚胺·内消旋对甲苯磺酸盐等。其中，1-乙基-3-二甲基氨基丙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)由于在肽合成领域有实际应用，容易在商业上获得，因而较理想。

通过调节上述亲电子性基团导入剂与脱水缩合剂的加入量，可以控制最终活性酯化多糖中的活性酯基量。

具体而言，优选为下述添加条件，即，脱水缩合剂的摩尔数(Zmmol)与酸型多糖的总羧基的摩尔数(Xmmol)之比(Z/X)在上述反应温度下满足0.1＜Z/X＜50。其原因在于，当Z/X小于0.1时，由于脱水缩合剂的添加量少，所以反应效率低，难以实现所期望的活性酯基导入率，当Z/X大于50时，虽然由于脱水缩合剂的添加量多使得活性酯基的导入率变高，但是得到的活性酯化多糖变得难溶于水。

另外，对于相对于酸型多糖的总羧基的摩尔数(Xmmol)的亲电子性基团导入剂的摩尔数(Ymmol)来说，只要添加与活性酯基的导入率相应的反应量以上即可，没有特别限制，优选为满足0.1＜Y/X＜100的添加条件。相对于酸型多糖的总羧基1摩尔，亲电子性基团导入剂通常以2～30摩尔的过剩量使用。

对于酯化反应工序的反应温度没有特别限制，优选为0℃～70℃，较优选20℃～40℃。反应时间根据反应温度不同而不同，通常为1～48小时，优选为12小时～24小时。

<酸处理>

以往，使通过上述酯化反应生成的活性酯化多糖析出结晶来将其回收，但在本发明中，在上述析出前，使活性酯化多糖与多元羧酸接触。

多元羧酸只要是二羧酸以上即可，通常从容易获得的二羧酸和三羧酸中选择。尤其是，作为以往实际用作药品添加物的二羧酸，优选琥珀酸和苹果酸，三羧酸优选柠檬酸。可以同时使用两种以上上述多元羧酸。

通常情况下，对于多元羧酸的使用量来说，以相对于亲电子性基团导入剂添加量1摩尔的酸当量计，通常为1当量以上，通常为1～10当量。如果在上述范围内，则最终可得到不产生水不溶物的活性酯化多糖干燥品。优选为1.5当量以上。若过多则在干燥时平均分子量Mw经时变化率有变高的倾向，优选为9当量以下，较优选7.5当量以下。典型地为3当量。

对于活性酯化多糖与多元羧酸的接触来说，具体而言，向酯化反应后的反应液中加入多元羧酸并将其混合即可。混合时间没有特别限制，通常为1～60分钟。

<后处理>

在上述接触后，按照与以往相同的方法使活性酯化多糖析出并将其回收。通常，将反应液注入到过剩量的醇、丙酮等不良溶剂中使其析出，通过倾析、离心、过滤等适当的方法进行回收。优选用不良溶剂反复洗涤析出物，至少进行1次，由此进行纯化。通过上述析出·纯化工序中的过滤和/或洗涤等方法，与未反应的亲电子性基团导入剂、脱水缩合剂、副反应产物一同，将供于反应体系的多元羧酸也一并除去，最终活性酯化多糖中实质上没有多元羧酸残留。

本发明中，上述工序后的活性酯化多糖(初始的)的平均分子量Mw与酯化前的酸型多糖大致相同。

<干燥>

活性酯化多糖对水不稳定，通常对析出·纯化工序后的活性酯化多糖进行减压干燥。减压干燥在45℃以下的温度下通常进行至少1小时优选4小时，较理想。

对于由本发明的制造工序得到的活性酯化多糖来说，在上述减压干燥时的分子量经时增大得到抑制。当求出减压干燥时的平均分子量(Mw)经时的变化率时，作为一个方案，本发明制造的NHS糊精的减压干燥时的平均分子量(Mw)经时的变化率优选小于1.8，较优选为1.4以下。需要说明的是，对于由以往的方法得到的活性酯化多糖来说，在减压干燥时可观测到平均分子量Mw经时增大，通常变化率为1.8％以上。

可根据需要将经干燥的活性酯化多糖分解或粉碎而形成粉末。如有必要，也可通过筛分等来进行粒径调整而调整为任意的粒度分布。虽然没有特别限制，但通常优选为平均粒径为数十nm～数百μm的粉末。

<活性酯化多糖>

由如上所述的本发明的方法得到的活性酯化多糖(干燥品)，作为交联性材料通常将其溶于水来使用，这时，不产生团块等不溶成分。

对于本发明涉及的活性酯化多糖来说，在分子内具有至少一个上述活性酯基，为了形成交联母体(crosslinked matrix)，通常在1分子中具有2个以上。由于来自天然原料的多糖多为分子量不同的分子的混合物，所以，活性酯基含有率用每1g干燥质量的活性酯基量表示是合适的。虽然根据使用目的不同而不同，但活性酯化多糖的每1g干燥质量的活性酯基量通常为0.1～5mmol/g，优选为0.1～2mmol/g。

活性酯基的导入率(％)可用所得到的活性酯化多糖中的活性酯基含量的摩尔量(AE)与酸型多糖具有的总羧基(TC)之比(AE/TC)乘以100来表示，例如，可通过Biochemistry Vol.14，No.7(1975)，p1535-1541所记载的方法确定。活性酯基的导入率小于100％时，表示活性酯化多糖除了具有活性酯基之外还具有未酯化的羧基。

作为本发明的活性酯化多糖的优选实例，可以举出NHS糊精。特别优选举出将糊精的Mw为10～200kDa、CM基的导入量为0.5～0.9mmol/g的CM糊精进行活性酯化而成的NHS基导入量为0.5～0.7mmol/g的物质。

需要说明的是，活性酯化多糖在导入活性酯基后也通常在多糖骨架分子内具有羟基，从而在分子内具有含活性氢的基团，但分子内的含活性氢的基团并不限于此，根据需要，也可进一步具有向分子内导入的含活性氢的基团。这时，活性酯化多糖具有的含活性氢的基团可以是一种也可以是两种以上。含活性氢的基团例如为羟基、伯或仲氨基、巯基等。

另外，活性酯化多糖中，除了上述活性酯基和含活性氢的基团之外，只要在不妨碍本发明的特性的范围内，还可以含有公知的元素、原子团等官能团。作为上述官能团，具体而言，可列举氟、氯、溴、碘等卤素；羧基；羧基甲基、羧基乙基、羧基丙基、羧基异丙基等羧基烷基；甲硅烷基、亚烷基甲硅烷基、烷氧基甲硅烷基、磷酸基等。上述官能团可以单独导入一种也可以导入两种以上。

对于本发明的活性酯化多糖来说，由于实质上在多糖分子内具有羟基即含活性氢的基团，所以即使不加入交联剂，在碱存在下，分子链内或分子链间也可形成交联结构，是自交联性的。所谓在碱存在下，是指存在pH超过7的水分的条件。

另外，若将活性酯化多糖应用于生物表面，则通过与生物表面的含活性氢的基团反应而显示相对于生物表面的粘合性。在作为医疗用处置材料的用途中，交联反应时的温度通常为生物体温度，热对交联反应的影响实际不大，但本发明的活性酯化多糖在该温度下的碱存在下，可形成交联母体。

以下，基于实施例进一步具体地说明本发明，但这些实施例仅为示例性的，本发明不受它们的任何限制。

实施例

(实施例1)NHS糊精的制备

1.酸型多糖CM糊精的制备

在500mL烧瓶中，将糊精(名糖产业株式会社制Sandek SD#100，Mw15kDa)10g溶解于纯水62.5g中直至团块或浑浊消失，然后，添加36wt％NaOH水溶液62.5g，在室温下搅拌90分钟。向其中添加向氯乙酸10.31g(109.1mmol)中加入蒸馏水而制成的75g氯乙酸水溶液，在60℃下反应6小时。冷却至室温后，添加20％HCl水溶液80mL，得到含有CM糊精的反应液。

接下来，在搅拌下，将上述得到的反应液全部注入到含有乙醇4450mL和水180mL的5L烧杯中。过滤收集析出物，最初用90％乙醇水溶液2L洗涤，接着用乙醇2L洗涤，然后，在室温下进行24小时减压干燥，得到CM糊精。

按照如下方式求出的CM糊精的CM基量为0.8mmol/g。

酸型多糖的羧基量的定量：量取酸型多糖(CM糊精)0.2g(Ag)，添加至0.1mol/L氢氧化钠水溶液20mL和80vol％甲醇水溶液10mL的混合溶液中，在25℃下搅拌3小时，得到溶液，向上述溶液中滴加1.0％酚酞/90vol％乙醇水溶液，使用0.05mol/L硫酸进行酸碱反滴定，测定0.05mol/L硫酸的使用量(V₁mL)。测定在未添加酸型多糖的空白中的0.05mol/L硫酸的使用量(V₀mL)，按照下式(1)，计算酸型多糖的羧基量(Bmmol/g)。需要说明的是，使用的0.1mol/L氢氧化钠水溶液、0.05mol/L硫酸的滴定度均为1.00。

B＝(V₀-V₁)×0.1÷A      …(1)

A：酸型多糖的质量(g)

B：羧基量(mmol/g)

2.CM糊精的活性酯化(NHS导入率75％)

在1L烧瓶内，装入上述得到的CM糊精10g(酸基量为8mmol)、DMSO300g，在室温进行搅拌使其完全溶解，添加N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)(和光纯药工业公司制)12g(104mmol)，在室温下进行搅拌使其完全溶解。接下来，添加1-乙基-3-二甲基氨基丙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)(和光纯药工业公司制)20.1g(104mmol)，在室温下进行搅拌使其完全溶解，然后，在23℃下搅拌16小时得到反应液1。

3.酸处理

将上述反应液1与表1所示的量的柠檬酸混合20分钟，得到反应液2。

4.回收

在搅拌下，将反应液2全部添加到含有甲醇/丙酮＝1∶4(v/v)2L的3L烧杯中。静置后，进行倾析除去上清，添加甲醇/丙酮＝1∶4(v/v)800mL。使用φ95mm桐山漏斗、No.5A滤纸进行抽滤，过滤收集析出物。用甲醇/丙酮＝1∶4(v/v)1600mL洗涤漏斗上的滤渣。

5.干燥

在40℃下对滤渣进行24小时减压干燥。利用GPC测定4小时、8小时、24小时的干燥品NHS糊精的平均分子量Mw，求出相对于时间的变化率。变化率(％)是将时间-Mw的散点图视为直线时的斜率。另外，进行各干燥时间的干燥品的溶解性试验。将其结果示于表1。

确认了得到的干燥品NHS糊精在凝胶化试验时发生凝胶化。

<平均分子量Mw的测定条件>

试剂：RO水，硝酸钠

洗脱液的制备：量取硝酸钠8.49g，用RO水稀释为2L，形成50mM硝酸钠水溶液。

试料溶液的制备：量取试料10mg，用洗脱液10mL稀释。倒转10次来混合溶液，静置2小时。使得到的溶液通过薄膜滤器，装入测定小瓶(vial)中。

HPLC测定条件：

测定装置：Tosoh制ECOSEC HPLC-8320GPC

柱：Shodex φ8.0×300mm 2根

洗脱液：50mM硝酸钠水溶液

流速：1.0mL/min

柱温：40℃

检测器：RI

进样量：100μL

<溶解性试验>

量取试料0.27g于玻璃试管(15mL)中，加入RO水0.54mL，激烈搅拌3分钟。然后，观察外观，确认有无不溶物。

<凝胶化试验>

量取试料0.27g于玻璃试管(15mL)中，加入RO水0.54mL，激烈搅拌3分钟。然后，加入0.5M碳酸钠/碳酸氢钠水溶液0.18mL，激烈搅拌10秒，然后反转试管。若未确认混合物流动，则判断为凝胶形成。

[表1]

由上述内容可知，尤其是在1.5～7.5当量时，Mw变化率低，不均小。

(实施例2)

除了使用琥珀酸3当量来代替实施例1的3.酸处理中的柠檬酸之外，按照与实施例1相同的方法，制备NHS糊精。按照与实施例1相同的方法进行试验，结果示于表2。在凝胶化试验时，确认到凝胶化。

(实施例3)

除了使用苹果酸3当量来代替实施例1的3.酸处理中的柠檬酸之外，按照与实施例1相同的方法制备NHS糊精。按照与实施例1相同的方法进行试验，结果示于表2。在凝胶化试验时，确认到凝胶化。

(参考例1)

除了使用表2所示的3种单羧酸3当量来代替实施例1的3.酸处理中的柠檬酸之外，按照与实施例1相同的方法制备NHS糊精。按照与实施例1相同的方法进行试验，结果示于表2。

(参考例2)

不使用实施例1的3.酸处理中的柠檬酸，而使用盐酸3当量，除此之外，按照与实施例1相同的方法制备NHS糊精。按照与实施例相同的方法进行试验，结果示于表2。

(比较例1)

除了省略实施例1的3.酸处理之外，按照与实施例1相同的方法制备NHS糊精，作为对照例，共给出4例。按照与实施例1相同的方法进行试验，结果示于表2。

[表2]

表2中也同时记载了实施例1的柠檬酸3当量的例子。

比较例1(对照)中，溶解性无重现性，Mw倾向于必然增加，Mw变化率不均，不能稳定地得到均匀物质。另外，单羧酸或盐酸的使用中，Mw变化率大、或产生不溶物，不稳定。

Claims (18)

1.一种活性酯化多糖的制造方法，其中，使酸型多糖的羧基与亲电子性化合物进行酯化反应而生成活性酯化多糖，使生成的活性酯化多糖与多元羧酸接触，然后使其析出并将其回收，所述多糖为糊精，并且，相对于所述亲电子性化合物，所述多元羧酸的量为1.5～7.5当量。

2.如权利要求1所述的方法，其中，对所述沉淀回收后的活性酯化多糖进行减压干燥。

3.权利要求1或2所述的方法，其中，所述多元羧酸为选自二羧酸和三羧酸中的至少一种。

4.如权利要求1或2所述的方法，其中，所述多元羧酸为选自琥珀酸、苹果酸及柠檬酸中的至少一种。

5.如权利要求3所述的方法，其中，所述多元羧酸为选自琥珀酸、苹果酸及柠檬酸中的至少一种。

6.如权利要求1或2所述的方法，其中，所述亲电子性化合物为N-羟基酰亚胺。

7.如权利要求3所述的方法，其中，所述亲电子性化合物为N-羟基酰亚胺。

8.如权利要求4所述的方法，其中，所述亲电子性化合物为N-羟基酰亚胺。

9.如权利要求5所述的方法，其中，所述亲电子性化合物为N-羟基酰亚胺。

10.如权利要求1或2所述的方法，其中，所述酸型多糖为导入有羧基的糊精，所述亲电子性化合物为N-羟基琥珀酰亚胺。

11.如权利要求3所述的方法，其中，所述酸型多糖为导入有羧基的糊精，所述亲电子性化合物为N-羟基琥珀酰亚胺。

12.如权利要求4所述的方法，其中，所述酸型多糖为导入有羧基的糊精，所述亲电子性化合物为N-羟基琥珀酰亚胺。

13.如权利要求5所述的方法，其中，所述酸型多糖为导入有羧基的糊精，所述亲电子性化合物为N-羟基琥珀酰亚胺。

14.如权利要求6所述的方法，其中，所述酸型多糖为导入有羧基的糊精，所述亲电子性化合物为N-羟基琥珀酰亚胺。

15.如权利要求7所述的方法，其中，所述酸型多糖为导入有羧基的糊精，所述亲电子性化合物为N-羟基琥珀酰亚胺。

16.如权利要求8所述的方法，其中，所述酸型多糖为导入有羧基的糊精，所述亲电子性化合物为N-羟基琥珀酰亚胺。

17.如权利要求9所述的方法，其中，所述酸型多糖为导入有羧基的糊精，所述亲电子性化合物为N-羟基琥珀酰亚胺。

18.一种活性酯化多糖，由权利要求1～17中任一项所述的方法得到。