CN102565204B - 检测尿液中戊二酸含量的方法 - Google Patents

检测尿液中戊二酸含量的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN102565204B
CN102565204B CN 201010581633 CN201010581633A CN102565204B CN 102565204 B CN102565204 B CN 102565204B CN 201010581633 CN201010581633 CN 201010581633 CN 201010581633 A CN201010581633 A CN 201010581633A CN 102565204 B CN102565204 B CN 102565204B
Authority
CN
China
Prior art keywords
solution
urine
glutaric acid
mixtures
mixing
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN 201010581633
Other languages
English (en)
Other versions
CN102565204A (zh
Inventor
崔学峰
倪君君
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Beijing hehe diagnostic medical technology Limited by Share Ltd
Original Assignee
BEIJING GUOLI BOLIN MEDICAL TECHNOLOGY DEVELOPMENT CO LTD
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by BEIJING GUOLI BOLIN MEDICAL TECHNOLOGY DEVELOPMENT CO LTD filed Critical BEIJING GUOLI BOLIN MEDICAL TECHNOLOGY DEVELOPMENT CO LTD
Priority to CN 201010581633 priority Critical patent/CN102565204B/zh
Publication of CN102565204A publication Critical patent/CN102565204A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN102565204B publication Critical patent/CN102565204B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Landscapes

  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Other Investigation Or Analysis Of Materials By Electrical Means (AREA)

Abstract

本发明公开了一种检测尿液中戊二酸含量的方法，包括如下步骤：标品、待测样本分别和同位素内标溶液混匀，加入基质溶液，混匀；加入磷酸酸化的甲基叔丁基醚，混匀并离心，取上清液，吹干，加入饱和盐酸正丁醇溶液，混匀，65℃衍生20min，衍生完成后吹干，加入流动相复溶液，萃取，离心，取上清，进行液相-质谱分析，得到尿液中戊二酸的含量。本发明的检测尿液中戊二酸含量的方法，简便、快速、准确，不仅可以应用于大量样本筛查，而且定量准确。

Description

检测尿液中戊二酸含量的方法
技术领域
本发明涉及一种检测尿液中戊二酸含量的方法。
背景技术
戊二酸尿症是Goodman等(1975)发现，有人将它列入赖氨酸代谢缺陷病，为常染色体隐性遗传病。本病的代谢缺陷已知有两型，经典型的I型已被证明是由于戊二酰辅酶A的活性缺失，使戊二烯辅酶A转化为戊烯辅酶A的环节受阻。从患儿的末梢血白细胞培养中可以证明。由于戊二酸、戊烯二酸等在神经元膜上有竞争谷氨酸脱羧基酶(GAD)的作用，患儿出现的锥体外系症状，可能与GAD活性受抑制有关。新近发现了II型戊二酸尿症，其症状与第1型相似，但是其代谢缺陷则是由于电子传递的黄蛋白或黄蛋白一泛醌氧化还原酶活性缺乏。患儿早期发育多正常，从婴儿中期逐渐发生智能发育迟滞，运动功能退化，伴有肢体强直痉挛、手足紧握、下肢剪式交叉或角弓反张，有时并出现扭转痉挛、手足徐动等锥体外系症状。实验室检测除血清LDH和CPK酶活性增高、脑脊液中蛋白量稍多，尿中有大量戊二酸(赖氨酸的代谢物)排出。因此检测尿液中戊二酸的含量为研究II型戊二酸尿症提供可靠的实验依据。
发明内容
本发明的目的是提供一种简单、高效、灵敏的定量检测尿液中戊二酸含量的方法。
本发明所提供的检测尿液中戊二酸含量的方法，包括如下步骤：
标品、待测样本分别和同位素内标溶液混匀，加入基质溶液，混匀；加入磷酸酸化的甲基叔丁基醚，混匀并离心，取上清液，吹干，加入饱和盐酸正丁醇溶液，混匀，65℃衍生20min，衍生完成后吹干，加入流动相复溶液，萃取，离心，取上清，进行液相-质谱分析，得到尿液中戊二酸的含量。
本发明的检测尿液中戊二酸含量的方法，其中：所述基质溶液为质量百分比浓度4％牛血清蛋白或空白血清。
本发明的检测尿液中戊二酸含量的方法，其中：所述流动相复溶液和流动相为含1‰甲酸铵或乙酸铵的甲醇水溶液或乙腈水溶液。
本发明的检测尿液中戊二酸含量的方法，其中：所述流动相复溶液中甲醇或乙腈的体积百分比含量为10-80％。
本发明的检测尿液中戊二酸含量的方法采用磷酸酸化甲基叔丁基醚为萃取试剂进行液液萃取戊二酸，萃取效率高，以同位素为内标，使得目标化合物的识别更为准确，同时更好的消除了系统误差，定量结果更为准确。以BSA为基质，模拟尿液中的蛋白质环境，消除基质效应，提高戊二酸的回收率。本发明的检测尿液中戊二酸含量的方法，简便、快速、准确，不仅可以应用于大量样本筛查，而且定量准确。
附图说明
图1为盐酸正丁醇衍生色谱图。
图2为盐酸甲醇衍生色谱图。
图3为戊二酸标准品色谱图。
图4为同位素内标色谱图。
图5为尿样中戊二酸色谱图。
图6为尿样中同位素内标色谱图。
图7为标准品戊二酸质谱图。
图8为内标标品质谱图。
具体实施方式
一.检测方法
步骤1：用移液器移取标品和内标溶液，涡旋仪混匀；同时平行移取待测样本和内标溶液涡旋混匀。
步骤2：向上述溶液加入基质溶液(4％的牛血清蛋白溶液或空白血清溶液)，涡旋混匀；
步骤3：加入磷酸酸化的甲基叔丁基醚(MTBE)或乙醚或乙酸乙酯，充分混匀并高速离心。
步骤4：取部分上清液，于氮吹仪上氮气吹干；
步骤5：加入衍生试剂(饱和盐酸正丁醇溶液)，涡旋混匀，密封，加热衍生，
步骤6：衍生完成后再次加热吹干溶剂。
步骤7：加入流动相复溶液(含1‰甲酸铵或乙酸铵的甲醇水溶液或乙腈水溶液)，充分混匀；
步骤8：经超声萃取一段时间后，充分混匀并高速离心；
步骤9：取适量上清溶液，由液相自动进样器进样，经液相色谱柱的色谱分离，经质谱分析，最终定量分析尿液中戊二酸(GA)的含量.
液相色谱条件：
样品经液相的自动进样器进样，液相泵以85％甲醇溶液进行等度洗脱分离，流速200μL/min，进样量5μL，进样前清洗取样针。
色谱柱：Discovery C18(SUPELC0，HPLC，5cm*2.1mm，5μm)
串联质谱条件：
ESI离子源，正离子扫描；MRM模式，扫描时间3min，喷雾电压4500V，鞘气(氮气)30psi，辅助气(氮气)10psi，毛细管温度300℃，碰撞气(氩气)1.5mTorr；m/z 245/171、m/z 245/115为GA的特征定性离子对，m/z 249/175、m/z 249/119作为内标D3-MMA的特征定性离子对，m/z 245/171用于GA定量，CE为15eV，扫描时间0.5s，扫描宽度1u。
MTBE、乙醚、乙酸乙酯萃取对检测结果的影响见表1，MTBE萃取试剂的回收产率最高，检测结果最准确。
表1.不同萃取试剂比较结果
Figure BDA0000037143840000031
不同衍生试剂对检测结果的影响如图1、2所示：盐酸甲醇衍生后仪器相应极低，未见明显出峰。
衍生温度和时间对测定值的影响见表2，其它条件不变的情况下，衍生反应在65℃，20min条件下，衍生产率最大化，检测结果才能最准确。
表2.衍生温度与衍生时间优化结果
Figure BDA0000037143840000032
二.检测尿液中戊二酸含量。
步骤1：用移液器移取5μl标品溶液(10-320mg/l)和内标溶液(D4-戊二酸，25mg/l)，涡旋仪混匀；同时平行移取90ul24h尿液和5μl内标溶液(D4-戊二酸，25mg/l))涡旋混匀。
步骤2：向上述标品溶液和内标的混合液中加入基质溶液(4％的牛血清蛋白溶液)90ul，涡旋混匀；
步骤3：加入磷酸酸化的甲基叔丁基醚1ml，充分混匀并高速离心。
步骤4：取部分上清液，于氮吹仪上氮气吹干；
步骤5：加入饱和盐酸正丁醇溶液200μl，涡旋混匀，密封，65℃衍生20min，
步骤6：衍生完成后再次加热吹干溶剂。
步骤7：加入流动相复溶液(含1‰甲酸铵的甲醇水溶液，甲醇和水的体积比为1∶1)，充分混匀；
步骤8：经超声萃取一段时间后，充分混匀并高速离心；
步骤9：取上清溶液，由液相自动进样器进样，经液相色谱柱的色谱分离，经质谱分析，最终定量分析尿液中戊二酸(GA)的含量.
液相色谱条件：
样品经液相的自动进样器进样，液相泵以85％甲醇溶液进行等度洗脱分离，流速200μL/min，进样量5μL，进样前清洗取样针。
色谱柱：Discovery C18(SUPELCO，HPLC，5cm*2.1mm，5μm)
串联质谱条件：
ESI离子源，正离子扫描；MRM模式，扫描时间3min，喷雾电压4500V，鞘气(氮气)30psi，辅助气(氮气)10psi，毛细管温度300℃，碰撞气(氩气)1.5mTorr；m/z 245/171、m/z 245/115为GA的特征定性离子对，m/z 249/175、m/z 249/119作为内标D3-MMA的特征定性离子对，m/z 245/171用于GA定量，CE为15eV，扫描时间0.5s，扫描宽度1u。
标准品(戊二酸)及其内标(D3-戊二酸)的色谱图如图3和4；
24h尿样本中戊二酸及其内标D3-戊二酸的色谱图如图5和6；24h尿样本中戊二酸及其内标D3-戊二酸的质谱图如图7和8所示，表明该方法的特异性强、准确度和灵敏度高。
以上的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通工程技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明的权利要求书确定的保护范围内。

Claims (4)

1.一种检测尿液中戊二酸含量的方法，包括如下步骤：
标品、待测样本分别和同位素内标溶液混匀，加入基质溶液，混匀；加入磷酸酸化的甲基叔丁基醚，混匀并离心，取上清液，吹干，加入饱和盐酸正丁醇溶液，混匀，65℃衍生20min，衍生完成后吹干，加入流动相复溶液，萃取，离心，取上清，进行液相-质谱分析，得到尿液中戊二酸的含量。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述基质为质量百分比浓度4%牛血清蛋白或空白血清。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述流动相复溶液和流动相均为甲醇水溶液或乙腈水溶液，且所述甲醇水溶液或乙腈水溶液均含1‰甲酸铵或1‰乙酸铵。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述流动相复溶液中甲醇或乙腈的体积百分比含量为10-80%。
CN 201010581633 2010-12-09 2010-12-09 检测尿液中戊二酸含量的方法 Active CN102565204B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN 201010581633 CN102565204B (zh) 2010-12-09 2010-12-09 检测尿液中戊二酸含量的方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN 201010581633 CN102565204B (zh) 2010-12-09 2010-12-09 检测尿液中戊二酸含量的方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN102565204A CN102565204A (zh) 2012-07-11
CN102565204B true CN102565204B (zh) 2013-08-28

Family

ID=46411166

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN 201010581633 Active CN102565204B (zh) 2010-12-09 2010-12-09 检测尿液中戊二酸含量的方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN102565204B (zh)

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1532544A (zh) * 2003-03-20 2004-09-29 华中科技大学同济医学院附属同济医院 滤纸片气相色谱-质谱分析检测尿有机酸/氨基酸代谢产物的方法
CN101371142A (zh) * 2006-01-19 2009-02-18 安特瑞斯公司 诊断方法和治疗方法

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5686311A (en) * 1995-06-23 1997-11-11 The Children's Mercy Hospital Diagnosis of autism and treatment therefor
JP3998934B2 (ja) * 2001-09-04 2007-10-31 独立行政法人科学技術振興機構 電子伝達フラビン蛋白脱水素酵素遺伝子とそれを利用するグルタル酸尿症ｉｉ型の診断方法
JP2005073626A (ja) * 2003-09-02 2005-03-24 Japan Science & Technology Agency 電子伝達フラビン蛋白脱水素酵素遺伝子の変異とそれを利用するグルタル酸尿症ｉｉ型の診断

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1532544A (zh) * 2003-03-20 2004-09-29 华中科技大学同济医学院附属同济医院 滤纸片气相色谱-质谱分析检测尿有机酸/氨基酸代谢产物的方法
CN101371142A (zh) * 2006-01-19 2009-02-18 安特瑞斯公司 诊断方法和治疗方法

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Analysis of organic acid markers relevant to inherited metabolic diseases by ultra-performance liquid chromatography/tandem mass spectrometry as benzofurazan derivatives;Osama Y. Al-Dirbashi 等;《RAPID COMMUNICATIONS IN MASS SPECTROMETRY》;20070715;第21卷(第13期);第1984-1990页 *
Osama Y. Al-Dirbashi 等.Analysis of organic acid markers relevant to inherited metabolic diseases by ultra-performance liquid chromatography/tandem mass spectrometry as benzofurazan derivatives.《RAPID COMMUNICATIONS IN MASS SPECTROMETRY》.2007,第21卷(第13期),第1984-1990页.
串联质谱技术在有机酸血症筛查中的应用研究;韩连书 等;《新生儿疾病筛查》;20050531;第43卷(第5期);325-330 *
串联质谱法测定血清中20种游离氨基酸含量;张轶雯 等;《检验医学与临床》;20101031;第7卷(第19期);第2051-2053页 *
张轶雯 等.串联质谱法测定血清中20种游离氨基酸含量.《检验医学与临床》.2010,第7卷(第19期),第2051-2053页.
韩连书 等.串联质谱技术在有机酸血症筛查中的应用研究.《新生儿疾病筛查》.2005,第43卷(第5期),325-330.

Also Published As

Publication number Publication date
CN102565204A (zh) 2012-07-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Stokes et al. Development of a liquid chromatography–mass spectrometry method for the high-accuracy determination of creatinine in serum
CN106546671B (zh) 基于三柱二维液质联用法测定肉制品中残留磺胺类药物的方法
Abdel-Rehim et al. Microextraction in packed syringe/liquid chromatography/electrospray tandem mass spectrometry for quantification of olomoucine in human plasma samples
CN105651901A (zh) 干血片样品中25羟基维生素d的液相色谱串联质谱检测方法及试剂盒
CN102539595B (zh) 检测血液或尿液中甲基丙二酸含量的方法
CN109001329A (zh) 干血片中25-羟基维生素d的高效液相色谱串联质谱检测方法
CN111307993B (zh) 检测血液中胆汁酸含量的方法
CN105548407B (zh) 尿液中修饰核苷的检测方法
Liu et al. Development of a UHPLC–MS/MS method for the determination of plasma histamine in various mammalian species
CN107462650A (zh) 人体尿液中环境激素的检测方法
CN102147397A (zh) 一种采用高效液相色谱检测功能啤酒中牛磺酸的方法
CN112684030A (zh) 一种富集净化-液相色谱串联质谱法检测水产品中全氟烷酸化合物的方法与应用
CN102565251B (zh) 检测血清或血纸片中酰基肉碱含量的方法
CN102735764A (zh) 一种血浆中利巴韦林含量的测定方法
CN106645518B (zh) 一种蜂胶原胶中氯霉素残留量的测定方法
CN102062768A (zh) 食品中4-甲基咪唑的快速检测方法
CN102539592A (zh) 检测体液中极长链脂肪酸含量的方法
CN102565252B (zh) 检测血液或尿液中同型半胱氨酸含量的方法
CN102565204B (zh) 检测尿液中戊二酸含量的方法
CN111487329A (zh) 一种同时测定血液和玻璃体液中乙醇非氧化代谢物的方法
CN103926368B (zh) 从玉米浆中提取生物素的方法及其薄层层析扫描检测方法
CN109061009B (zh) 一种发酵液中衣康酸含量的测定方法
CN111220748B (zh) 一种银杏提取物及其制剂中黄酮和内酯同时测定的方法
CN109324140A (zh) 一种烟叶中玉米素核苷固相萃取-液相色谱-串联质谱的测定方法
CN105699575A (zh) 高效液相色谱串联质谱技术检测唾液中皮质醇的方法及试剂盒

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
ASS Succession or assignment of patent right

Owner name: BEIJING HEHE MEDICAL DETECTION INSTITUTE CO., LTD.

Free format text: FORMER OWNER: BEIJING GUOLI BOLIN MEDICAL TECHNOLOGY DEVELOPMENT CO., LTD.

Effective date: 20150724

C41 Transfer of patent application or patent right or utility model
TR01 Transfer of patent right

Effective date of registration: 20150724

Address after: 100011 Beijing city 3 Chaoyang District Huangsi Street No. 4 No. 3, 4, 5

Patentee after: Beijing hehe medical laboratory Co., Ltd.

Address before: 100011 Beijing City, Chaoyang District Street No. 3 (Golden Phoenix Business Center 3)

Patentee before: Beijing Guoli Bolin Medical Technology Development Co.,Ltd.

C41 Transfer of patent application or patent right or utility model
TR01 Transfer of patent right

Effective date of registration: 20151021

Address after: 101111 Beijing Yizhuang economic and Technological Development Zone by sea six road No. 5 Building No. 14 East Garden E

Patentee after: Beijing hehe diagnostic medical technology Limited by Share Ltd

Address before: 100011 Beijing city 3 Chaoyang District Huangsi Street No. 4 No. 3, 4, 5

Patentee before: Beijing hehe medical laboratory Co., Ltd.