CN102531901B - 一种丹酚酸a的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种丹酚酸A转化液的制备方法，进一步通过大孔树脂柱层析、萃取、硅胶柱得到丹酚酸A的制备方法，采用本发明方法得到的丹酚酸A可工业化生产，且该丹酚酸A纯度高，保证了用药的安全性。本发明为制备丹酚酸A提供了一个简便高效的方法。使用本发明提供的方法制备丹酚酸A，工艺稳定、质量可控、转化率高，主要产物丹酚酸A总收率高，成本低；联用分离纯化技术，可大批量工业化制备高纯度丹酚酸A。
Description
技术领域
本发明涉及医药、保健食品领域，具体涉及一种丹酚酸A的制备方法。
背景技术
【丹参水溶性有效成分-丹酚酸研究进展，基础医学与临床，杜冠华2000，20(5)：10～14.】报道丹酚酸是丹参水溶性成分中最重要的活性成分，丹酚酸A是酚酸类化合物，见(【丹酚酸A抗四氯化碳中毒致大鼠肝损伤和肝纤维化的作用，中药药理学报，胡义杨1997，18(5)：478-480.】)，但是其在丹参中的含量较低(百万分之五左右，甚至没有，【中草药现代研究(第二卷)中国医学科学院药物研究所编著2005，P479-496.】)，即使通过一系列的方法将其提取出来，也只能得到微量的丹酚酸A，因此存在生产成本高，无法进行工业化生产的难题，限制了人们更好地开发利用。很多医药工作者希望将丹酚酸A进行工业化生产，进而开发为医药制剂，但鉴于丹酚酸A来源以及其稳定性原因至今还不能解决其实际生产问题。
现有技术公开了多种丹酚酸A提取纯化的工艺方法，如表1所示方法，这些方法都是从药材进行提取，但是丹酚酸A在药材中的含量很低，加上工艺步骤复杂，成分损失大，无法满足工业化生产丹酚酸A的需求。
表1.现有技术中丹酚酸A的制备方法比较
近几年来的专利或申请(CN1830947A、CN101230003、CN100999470A等)涉及到经过高温高压热解反应，进而再通过常规的分离纯化技术制备丹酚酸A，但是由于起始原料均是丹参水或醇提取物，成分复杂，采用热降解法所得反应液更加复杂，造成后续产物分离极其困难，使得丹酚酸A收率极低，无法满足工业化需求。
本发明人经过大量的实验研究，提供了一种以丹参多酚酸盐(国药准字Z20050246)为原料制备丹酚酸的方法，该方法收率高，能够满足工业化生产。
发明内容
本发明提供了一种丹酚酸A转化液的制备方法，其特征为：以丹参多酚酸盐为原料，加水溶解，调pH值至4.0-6.0，在120-130℃，0.12-0.20MPa下反应4-5小时，溶液冷却后，加酸调PH值至2-3。优选方法为用柠檬酸三钠调节pH至4.0-6.0，调pH值至2-3的酸选自醋酸、盐酸或磷酸。
本发明提供的丹酚酸A转化液的更优选制备方法为：将丹参多酚酸盐加水稀释至浓度为1％，以丹参乙酸镁计，用柠檬酸三钠调pH至6.0，于125℃、0.15MPa条件下转化4小时，冷却至室温后盐酸调pH至2.0～3.0。
本发明提供的丹酚酸A转化液的更优选方法为加入保护剂，保护剂选自乙酸乙酯、乙酸丙酯或乙酸丁酯中的一种或几种。
本发明提供的丹酚酸A转化液的进一步优选方法为：将丹参多酚酸盐加水稀释至浓度为1％，以丹参乙酸镁计，用柠檬酸三钠调pH至6.0，加入乙酸乙酯，于125℃、0.15MPa条件下转化4小时，冷却至室温后盐酸调pH至2.0～3.0。
本发明提供了一种丹酚酸A的制备方法，其特征在于将上述任一所述方法得到的丹酚酸A转化液依次进行非极性或弱极性大孔树脂柱层析、萃取和硅胶层析。其中非极性或弱极性大孔树脂选自HPD-100、HPD-826、ADS-8或CG161中的一种或几种，萃取中的有机溶剂选自乙酸乙酯、乙酸丁酯、甲基叔丁基醚或乙醚中的一种或几种。大孔树脂的洗脱液为水和乙醇溶液，其中乙醇溶液的浓度范围为20-40％，硅胶柱的洗脱液为正己烷-乙酸乙酯。
本发明提供了一种优选的丹酚酸A的制备方法，其特征在于将上述任一所述方法得到的丹酚酸A转化液过HPD100树脂柱，依次用水、25％乙醇溶液洗脱杂质，弃去，再用40％乙醇溶液洗脱收集丹酚酸A洗脱液1，减压浓缩至丹酚酸A浓度约25mg/ml；浓缩液过CG161树脂柱，依次用20％乙醇溶液洗脱杂质，弃去，再用35％乙醇溶液洗脱收集丹酚酸A洗脱液2，减压浓缩至丹酚酸A浓度约50mg/ml；盐酸调pH至2～3，以等体积乙酸乙酯萃取三次，合并萃取液，减压浓缩，加2.5倍量硅胶(80～120目)拌匀，干燥，湿法上硅胶柱200～300目，2.5倍量，以正己烷-乙酸乙酯6∶4和5∶5洗脱，收集正己烷-乙酸乙酯5∶5洗脱液，减压浓缩至干，加水适量分散，再减压浓缩，干燥，得丹酚酸A。其中丹酚酸A的纯度大于95.0％。
采用本发明方法得到的丹酚酸A的转化率比已有中国专利(200710001055.4)公开的转化方法提高了近3倍，然后再通过大孔树脂柱层析、萃取、硅胶柱，得到了可工业化生产的丹酚酸A，且该丹酚酸A纯度高，保证了用药的安全性。
本发明为制备丹酚酸A提供了一个简便高效的方法。使用本发明提供的方法制备丹酚酸A，工艺稳定、质量可控、转化率高，主要产物丹酚酸A总收率高，成本低；联用分离纯化技术，可大批量工业化制备高纯度丹酚酸A。
本发明提供的丹酚酸A的制备方法，生产工艺简单易控，批间产物变化较小，为制备丹酚酸A提供了切实可行的技术路线。与现有的技术相比，本发明具有以下突出优点：(1)采用纯度较高的丹参多酚酸盐，降解产物和降解工艺方便控制；(2)优选采用保护剂，大大提高丹酚酸A的摩尔转化率，可达70％；(3)纯化工艺利用反相与正相相结合的方式能有效提高丹酚酸A的纯度，保证用药的安全性。
附图说明
图1：实施例1的HPLC图
图2：实施例6的HPLC图
图3：试验例3的PH稳定图
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明作进一步的说明。
实施例1.制备丹酚酸A转化液
取丹参多酚酸盐(以丹参乙酸镁计含量大于80％)12g，加水1L，柠檬酸三钠调节pH值至6.0、置于高压灭菌锅中，125℃温度，0.15MPa，加热4小时，溶液冷却后，加盐酸调pH值至2～3，得到丹酚酸A转化液；转化液的HPLC分析表明，丹酚酸A的摩尔转化率45％(图1)。
实施例2.制备丹酚酸A
取实施例1的转化液丹酚酸A转化液过HPD100树脂柱，依次用水洗脱10个柱体积，25％乙醇溶液洗脱8个柱体积，弃去，再用40％乙醇溶液洗脱10个柱体积，收集洗脱液1，将洗脱液1减压浓缩至丹酚酸A浓度25mg/ml，浓缩液过CG161树脂柱，用20％乙醇溶液洗脱10个柱体积，弃去，再用35％乙醇溶液洗脱12个柱体积，收集洗脱液2，减压浓缩至丹酚酸A浓度50mg/ml；盐酸调pH至2～3，以等体积乙酸乙酯萃取三次，合并萃取液，减压浓缩，加2.5倍量80～120目硅胶拌匀，干燥，湿法上200～300目硅胶柱，2.5倍量，以正己烷-乙酸乙酯6∶4洗脱30个柱体积，弃去，再用正己烷-乙酸乙酯5∶5洗脱25个柱体积，收集洗脱液3，将洗脱液3减压浓缩至干，加水适量分散，再减压浓缩，干燥，得丹酚酸A。
实施例3.制备丹酚酸A转化液
取丹参乙酸镁10g，加水1L，加乙酸乙酯10ml，调节溶液PH值至6、置于高压灭菌锅中，125℃温度，0.15MPa，加热4小时，溶液冷却后，加盐酸调pH值至2～3，得到丹酚酸A转化液，转化液的HPLC分析表明，丹酚酸A的摩尔转化率72％。
实施例4.制备丹酚酸A转化液
与实施例1方法相同，原料为丹参乙酸镁12g，加水1L，加乙酸丁酯10ml，调节溶液PH值至6、置于高压灭菌锅中，125℃温度，0.15MPa，加热4小时，溶液冷却后，加盐酸调pH值至2～3，得到丹酚酸A转化液。
实施例5.制备丹酚酸A
取实施例3转化液，其它方法同实施例2。
实施例6.制备丹酚酸A转化液
取丹参多酚酸盐(YBZ07562005，以丹参乙酸镁计含量大于80％)12g，加水1L，加乙酸乙酯10ml，柠檬酸三钠调节pH值至6.0、置于高压灭菌锅中，130℃温度，0.20MPa，加热4.0小时，溶液冷却后，加盐酸调pH值至2～3，得到丹酚酸A转化液；转化液的HPLC分析表明，丹酚酸A的摩尔转化率62.3％(图2)，此外产物中还含有丹参素、原儿茶醛、紫草酸。
实施例7.制备丹酚酸A转化液
取丹参多酚酸盐12g，加水1L，加乙酸丁酯10ml，柠檬酸三钠调节pH值至6.0、置于高压灭菌锅中，120℃温度，0.12MPa，加热5.0小时，溶液冷却后，加盐酸调pH值至2～3，得到丹酚酸A转化液；转化液的HPLC分析表明，丹酚酸A的摩尔转化率66.7％，此外产物中还含有丹参素、原儿茶醛、紫草酸等。
试验例1：不同工艺方法丹酚酸A转化液的的摩尔转化率
实验方法：一份按照传统工艺方法(专利C N101130498，实施例一)得到丹酚酸A，一份按照工艺方法(专利CN1830947A，实施例一)得到丹酚酸A，一份按照工艺方法(专利CN101230003A，实施例3中的方法3)得到丹酚酸A，一份按照工艺方法(专利CN100999470A，实施例一)得到丹酚酸A，一份按照本申请工艺方法(本申请专利的实施例6)得到丹酚酸A，按照内标法计算样品中的丹酚酸A，计算丹酚酸A收率以评价不同工艺方法的优劣，实验结果见表2。表2不同工艺方法丹酚酸A收率
| 组别 | 原料 | 丹酚酸A收率(％) | 纯度(％) |
| CN101130498 | 丹参药材 | 0.4 | 82.3 |
| CN1830947A | 丹参颗粒 | 0.45 | 80.3 |
| CN101230003A | 丹参饮片 | 1.6 | 81.0 |
| CN100999470A | 56.68％丹酚酸B | 30.5 | 90.1 |
| 本申请实施例6 | 84.80％丹参乙酸镁 | 62.3 | 97.1 |
实验结论：通过上述实验表明，本申请工艺方法得到丹酚酸A的收率比现有技术中丹酚酸A的收率大大提高，产物纯度也相应大大提高。
试验例2加入丹酚酸A保护剂的重要性
方法：取丹参多酚酸盐分成等份，一份按照本申请工艺方法(实施例7)制备，一份按照本工艺方法(实施例7但不加乙酸丁酯保护剂)制备，样品同时置于同一高压灭菌锅内转化，按照内标法计算丹酚酸A转化液中丹酚酸A重量，根据丹酚酸A摩尔转化率计算不同工艺方法的优劣，实验结果见表3：
表3加保护剂和不加保护剂对丹酚酸A的摩尔转化率的影响
| 组别 | 丹参乙酸镁含量 | 转化后丹酚酸A重量 | 丹酚酸A摩尔转化率％ |
| 实施例7 | 84.08％ | 4.5g | 66.7％ |
| 实施例7(不加乙酸丁酯) | 84.08％ | 3.8g | 56％ |
结论：上述实验表明，加丹酚酸A保护剂能够显著提高丹酚酸A的摩尔转化率。
试验例3.转化液调节pH值的重要性
方法：取丹酚酸A转化液溶液1ml稀释到5ml(pH5.0)，以盐酸(0.5mol/L)和碳酸钠(0.1mol/L)分别调节溶液的pH值至1、2、3、4、5、6，再分别用高效液相色谱仪在285nm波长处分析丹酚酸A在1、2、4、8小时的稳定性情况，结果见表4，以时间为横坐标，峰面积为纵坐标绘制时间-峰面积曲线，结果见图3。
表4丹酚酸A溶液在不同pH值的稳定性情况
注：变化率＝(0h峰面积-最后测定的峰面积)×100％/0h峰面积
表3及图3表明丹酚酸A在pH2.1最为稳定。在pH2.0～5.0时较为稳定。结果显示丹酚酸A不稳定性，溶液状态下受H+和OH-催化作用而转化成其他成分，因此为了保证分离纯化过程中丹酚酸A的稳定性，转化结束后立即将溶液的pH值调节到2.0～3.0。
试验例4.实施例方法所得到的丹酚酸A样品的含量测定
表5实施例方法所得到的丹酚酸A样品的含量结果
| 组别 | 原料含量 | 丹酚酸A收率％ | 纯度％ |
| 制备实施例2 | 84.08％ | 45 | 98.8 |
| 制备实施例5 | 98.5％ | 72 | 97.1 |
测定方法如下：
照高效液相色谱法(《中国药典》2005年版一部附录V)测定。
色谱柱：Discovery C18柱(250mm×4.6mm；5μm)。
色谱条件与系统适应性实验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流速：1.0ml·min-1；柱温：30℃；检测波长：285nm。理论板数按丹酚酸A计不低于5000；以乙腈-0.02％磷酸水溶液为流动相，按下述梯度洗脱条件进行梯度洗脱，运行40分钟。0-8分钟，乙腈的比例由8％升至18％，0.02％磷酸水溶液的比例由92％降至82％；8-15分钟，乙腈的比例由18％升至21％，0.02％磷酸水溶液的比例由82％降至79％；15-40分钟，乙腈的比例由21％升至34％，0.02％磷酸水溶液的比例由79％降至66％；后运行时间10分钟。
对照品溶液的配制：精密称取丹酚酸A对照品(自制)到容量瓶中，加pH2的水溶解摇匀并稀释至刻度；
样品溶液的配制：取样品，加入pH2的水溶解摇匀并稀释至刻度；
测定法：精密吸取对照品溶液，注入液相色谱仪，记录色谱图；精密吸取样品溶液，注入液相色谱仪，计算峰面积比。
Claims (10)
1.一种丹酚酸A转化液的的制备方法，以丹参多酚酸盐为原料，加水溶解，用柠檬酸三钠调pH值至4.0～6.0，在120～130℃，0.12～0.20MPa下反应4～5小时，溶液冷却后，加醋酸、盐酸或磷酸调pH值至2～3，其特征在于加入保护剂，保护剂选自乙酸乙酯、乙酸丙酯或乙酸丁酯中的一种或几种。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于丹参多酚酸盐加水稀释至浓度以丹参乙酸镁计为1％，用柠檬酸三钠调pH至6.0，于125℃、0.15MPa条件下转化4小时，冷却至室温后盐酸调pH至2.0～3.0。
3.一种丹酚酸A的制备方法，其特征在于通过权利要求1或2所述方法得到丹酚酸A转化液，然后依次进行非极性或弱极性大孔树脂柱层析、萃取和硅胶层析。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于非极性或弱极性大孔树脂选自HPD-100、HPD-826、ADS-8或CG161中的一种或几种，萃取中的有机溶剂选自乙酸乙酯、乙酸丁酯、甲基叔丁基醚或乙醚中的一种或几种。
5.根据权利要求3所述的制备方法，其中大孔树脂的洗脱液为水和乙醇溶液，其中乙醇溶液的浓度范围为20～40％，硅胶柱的洗脱液为正己烷-乙酸乙酯。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于丹酚酸A转化液过HPD100树脂柱，依次用水洗脱10个柱体积，25％乙醇溶液洗脱8个柱体积，弃去，再用40％乙醇溶液洗脱10个柱体积，收集洗脱液1，将洗脱液1减压浓缩至丹酚酸A浓度25mg/ml，浓缩液过CG161树脂柱，用20％乙醇溶液洗脱10个柱体积，弃去，再用35％乙醇溶液洗脱12个柱体积，收集洗脱液2，减压浓缩至丹酚酸A浓度50mg/ml；盐酸调pH至2～3，以等体积乙酸乙酯萃取三次，合并萃取液，减压浓缩，加2.5倍量80～120目硅胶拌匀，干燥，湿法上200～300目硅胶柱，2.5倍量，以正己烷-乙酸乙酯6:4洗脱30个柱体积，弃去，再用正己烷-乙酸乙酯5:5洗脱25个柱体积，收集洗脱液3，将洗脱液3减压浓缩至干，加水适量分散，再减压浓缩，干燥，得丹酚酸A。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于丹参多酚酸盐加水稀释至浓度以丹参乙酸镁计为1％，加入乙酸乙酯，用柠檬酸三钠调pH至6.0，于125℃、0.15MPa条件下转化4小时，冷却至室温后盐酸调pH至2.0～3.0，得丹酚酸A转化液，丹酚酸A转化液过HPD100树脂柱，依次用水洗脱10个柱体积，25％乙醇溶液洗脱8个柱体积，弃去，再用40％乙醇溶液洗脱10个柱体积，收集洗脱液1，将洗脱液1减压浓缩至丹酚酸A浓度25mg/ml，浓缩液过CG161树脂柱，用20％乙醇溶液洗脱10个柱体积，弃去，再用35％乙醇溶液洗脱12个柱体积，收集洗脱液2，减压浓缩至丹酚酸A浓度50mg/ml；盐酸调pH至2～3，以等体积乙酸乙酯萃取三次，合并萃取液，减压浓缩，加2.5倍量80～120目硅胶拌匀，干燥，湿法上200～300目硅胶柱，2.5倍量，以正己烷-乙酸乙酯6:4洗脱30个柱体积，弃去，再用正己烷-乙酸乙酯5:5洗脱25个柱体积，收集洗脱液3，将洗脱液3减压浓缩至干，加水适量分散，再减压浓缩，干燥，得丹酚酸A。
8.根据权利要求4所述的制备方法，其中大孔树脂的洗脱液为水和乙醇溶液，其中乙醇溶液的浓度范围为20～40％，硅胶柱的洗脱液为正己烷-乙酸乙酯。
9.根据权利要求8述的方法，其特征在于丹酚酸A转化液过HPD100树脂柱，依次用水洗脱10个柱体积，25％乙醇溶液洗脱8个柱体积，弃去，再用40％乙醇溶液洗脱10个柱体积，收集洗脱液1，将洗脱液1减压浓缩至丹酚酸A浓度25mg/ml，浓缩液过CG161树脂柱，用20％乙醇溶液洗脱10个柱体积，弃去，再用35％乙醇溶液洗脱12个柱体积，收集洗脱液2，减压浓缩至丹酚酸A浓度50mg/ml；盐酸调pH至2～3，以等体积乙酸乙酯萃取三次，合并萃取液，减压浓缩，加2.5倍量80～120目硅胶拌匀，干燥，湿法上200～300目硅胶柱，2.5倍量，以正己烷-乙酸乙酯6:4洗脱30个柱体积，弃去，再用正己烷-乙酸乙酯5:5洗脱25个柱体积，收集洗脱液3，将洗脱液3减压浓缩至干，加水适量分散，再减压浓缩，干燥，得丹酚酸A。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于丹参多酚酸盐加水稀释至浓度以丹参乙酸镁计为1％，加入乙酸乙酯，用柠檬酸三钠调pH至6.0，于125℃、0.15MPa条件下转化4小时，冷却至室温后盐酸调pH至2.0～3.0，得丹酚酸A转化液，丹酚酸A转化液过HPD100树脂柱，依次用水洗脱10个柱体积，25％乙醇溶液洗脱8个柱体积，弃去，再用40％乙醇溶液洗脱10个柱体积，收集洗脱液1，将洗脱液1减压浓缩至丹酚酸A浓度25mg/ml，浓缩液过CG161树脂柱，用20％乙醇溶液洗脱10个柱体积，弃去，再用35％乙醇溶液洗脱12个柱体积，收集洗脱液2，减压浓缩至丹酚酸A浓度50mg/ml；盐酸调pH至2～3，以等体积乙酸乙酯萃取三次，合并萃取液，减压浓缩，加2.5倍量80～120目硅胶拌匀，干燥，湿法上200～300目硅胶柱，2.5倍量，以正己烷-乙酸乙酯6:4洗脱30个柱体积，弃去，再用正己烷-乙酸乙酯5:5洗脱25个柱体积，收集洗脱液3，将洗脱液3减压浓缩至干，加水适量分散，再减压浓缩，干燥，得丹酚酸A。
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