CN102507760B - 果胶含量的测定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种果胶含量的测定方法,包括以下步骤:1)获得待测样品;2)在步骤1)的待测样品中加入浓度为0.5~5mol/L的三氟乙酸溶液进行水解,得待测样品水解物;3)将待测样品水解物用N2吹干的方式进行干燥处理,然后调节pH值至中性,并用水定容;4)称取作为标准品的半乳糖醛酸配成浓度为0.001mol/L~0.01mol/L的梯度标准溶液;5)将步骤3)的所得物和步骤4)所得的梯度标准溶液分别进行PMP衍生;6)采用HPLC测定衍生样品;7)以标准半乳糖醛酸浓度为横坐标,峰面积为纵坐标制作标准曲线;根据峰面积查待测样品在标准曲线上对应的浓度,从而计算待测物中的果胶含量。
Description
技术领域
本发明涉及一种基于PMP-HPLC柱前衍生法测定植物材料及相应产品中果胶含量的方法。
背景技术
果胶是存在于高等植物细胞壁和细胞间的富含半乳糖醛酸苷的复杂多糖,是植物细胞壁的重要成分之一,在中胞层中起到对植物细胞的粘接作用,对于植物的抗病性、植物产品的质量起到十分重要的作用。果胶其主链主要有α-1,4半乳糖醛酸组成,结构区域主要包括均半乳糖醛苷(HG)、鼠李半乳糖醛苷I(RGI)和鼠李半乳糖醛苷II(RGH)。果胶对于带果粒的饮料及果肉饮料的稳定起到重要作用,对于澄清的果汁的稳定性亦至关重要(食品科学,1992,9:25-27)。因此,对植物组织及相应产品特别是果汁制品中果胶含量进行测定具有重要意义。
目前测定植物组织及相应产品中果胶含量的方法主要是咔唑比色法,该测定方法的步骤主要是将植物组织及相应产品中的果胶通过提取分离,制备果胶提取液,再采用咔唑比色法测定果胶含量;这种方法需要对果胶进行提取分离,操作费时、繁琐。此外,咔唑比色法操作过程中利用浓硫酸对样品进行煮沸,操作费时、耗能,同时存在显色不稳定等缺点,且前期在果胶的提取过程中会造成损失导致测定结果不精确。
PMP-HPLC柱前衍生法已被广泛应用于多糖单糖组成及含量的测定。Xin等利用PMP-HPLC柱前衍生法确定了番茄中螯合性果胶在贮藏过程中单糖组成的变化(FoodChemistry,2010,121:372-380)。林勤保等利用PMP-HPLC柱前衍生法测定了大枣多糖的单糖组成(郑州粮食学院学报,1998,19(3):57-60,82)。韩晶等利用PMP-HPLC柱前衍生法分析了白土茯苓多糖中的单糖组成(中药材,2009,32(6):893-895)。
PMP-HPLC柱前衍生法是近些年发展起来的多糖的单糖组成测定方法,研究主要集中在多糖中性糖组成及含量的测定上,用于酸性多糖果胶的研究报道较少,且未见有关于测定果胶含量的方法的报道。
发明内容
本发明要解决的技术问题是:针对植物组织及相应产品中果胶含量测定的现行方法的繁琐、费时和不精确等问题,将PMP-HPLC柱前衍生法用于植物组织及相应产品中果胶含量的测定,提供了一种简单、快速、准确、稳定,无需对植物组织及相应产品中的果胶进行提取而直接测定其中果胶含量的一种方法,避免了植物组织及相应产品在果胶提取过程中所造成的损失。
为了解决上述技术问题,本发明提供一种果胶含量的测定方法,包括以下步骤:
1)、获得待测样品:
待测物为植物组织、果汁或果粒饮料;分别选用对应的以下方法:
将植物组织切碎或匀浆,然后加入体积浓度为50~80%的乙醇煮沸10~30分钟,过滤,丙酮冲洗滤渣,干燥,所得细胞壁材料为待测样品;植物组织与所述乙醇的料液比为10g/150~250mL;
果汁直接作为待测样品;
将果粒饮料进行过滤,分别得果汁糖浆和果渣;将果汁糖浆作为待测样品;或者在果渣中加入质量浓度为50~80%的乙醇煮沸10~30分钟,过滤,丙酮冲洗滤渣,干燥,所得细胞壁材料为待测样品;果渣与所述乙醇的料液比为10g/150~250mL;
2)、在步骤1)的待测样品中加入浓度为0.5~5mol/L的三氟乙酸(TFA)溶液进行水解,水解时间为2~14h,水解温度为100~120℃;得待测样品水解物;
当待测样品为细胞壁材料时,料液比为:1g待测样品/0.8~1.2ml的三氟乙酸溶液;
当待测样品为果汁或者果汁糖浆时,料液比为:1ml待测样品/0.8~1.2ml的三氟乙酸溶液;
3)、将待测样品水解物用N2吹干的方式进行干燥处理,然后调节pH值至中性,并用水定容;
4)、称取作为标准品的半乳糖醛酸配成浓度为0.001mol/L~0.01mol/L的梯度标准溶液;
5)、将步骤3)的所得物和步骤4)所得的梯度标准溶液分别进行PMP衍生:
在步骤3)的所得物/步骤4)所得的梯度标准溶液中分别加入浓度为0.1~1.0mol/L的PMP溶液(即1-苯基-3-甲基-5-吡唑酮溶液,以甲醇为溶剂)、浓度为0.1~1.0mol/L的NaOH溶液以及浓度为0.0018~0.0022mol/L的半乳糖溶液,于60~80℃衍生20~40min;
所述步骤3)的所得物/所述步骤4)所得的梯度标准溶液、PMP溶液、NaOH溶液和半乳糖溶液的体积比为1∶0.9~1.1∶0.9~1.1∶0.12~0.13;
将衍生后所得产物用0.1~1.0mol/L的HCl溶液中和至pH值为7,用氯仿萃取2~6次,;萃取结束后过水膜;
6)、采用HPLC测定衍生样品:
流动相A:乙腈+0.05mol/L磷酸盐缓冲溶液(pH6.9);乙腈在流动相A中的体积浓度为15%;
溶剂B:乙腈+0.05mol/L磷酸盐缓冲溶液(pH6.9);乙腈在溶剂B中的体积浓度为40%;
HPLC条件:
色谱柱:Agilent Eclipse XDB C-18分离柱(4.6×250mm,5μm),
检测器:waters 2998紫外检测器;
检测波长:250nm;
流速:1.0mL/min;
柱温:25℃;
时间梯度:0→10→30min;
洗脱液由流动相A和溶剂B组成,溶剂B在洗脱液的体积浓度梯度为:0→15%→25%;
进样体积:10μL;
7)、以标准半乳糖醛酸浓度为横坐标,峰面积为纵坐标制作标准曲线;根据峰面积查待测样品在标准曲线上对应的浓度,从而计算待测物中的果胶含量。
即,以半乳糖醛酸衍生物的峰面积代入标准曲线中求出待测样品中半乳糖醛酸的含量(C);半乳糖醛酸的含量乘以转化系数即得待测物(包括植物组织、果汁或果粒饮料)中的果胶含量。
果胶含量(mg/g)=C*K*194,其中K=1/样品质量;这属于常规的推算法则。
作为本发明的果胶含量的测定方法的改进:步骤3)中:
当待测样品为细胞壁材料时,每2mg的待测样品用水定容至0.8~1.2ml;
当待测样品为果汁或者果汁糖浆时,每2ml的待测样品用水定容至0.8~1.2ml;
在本发明的步骤3)中,将待测样品水解物用N2吹干的方式进行干燥处理,是为了降低水分含量,从而便于后续的定容;因此,可将待测样品水解物用N2吹干至水分全部挥发掉。调节pH值至中性时:可先利用0.3M的NaOH进行粗调,再用0.1M的NaOH进行精调;因为如果全部用0.1M的NaOH进行调节,可能会导致水分过多,不利用后续的定容。
本发明是基于1-苯基-3甲基-5吡唑啉酮-高效液相色谱(PMP-HPLC)柱前衍生法测定植物组织及相应产品如果蔬制品(鲜切制品、果蔬汁等)中果胶含量,本发明与现行的植物组织及相应产品中果胶含量的测定方法相比其主要优点是:简单、快速、准确、稳定,无需对植物组织及相应产品中的果胶进行提取而直接测定其中果胶含量,避免了果胶在提取过程中的损失。
本发明所使用的PMP-HPLC柱前衍生法无需对果胶进行提取分离,而是将果浆及果渣细胞壁材料直接在酸中完全水解,利用HPLC进行测定。此方法避免了果胶在提取过程中的损失,简化了操作过程,克服了咔唑比色法测定果胶含量的不稳定性,测定结果准确可靠,并可同时获取植物组织及相应产品中果胶的单糖组成。
本发明与已有的PMP-HPLC柱前衍生法的主要区别在无需对样品进行前处理,避免了果胶提取过程中造成的损失;此外,本方法采用内标定量法,与研究者常用的PMP-HPLC柱前衍生外标定量法相比,可以避免进样体积对测定结果造成的影响,使测定结果更加准确可靠。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
图1为标准半乳糖醛酸的HPLC图;
图2(a)番茄中果胶的HPLC图;(b)是为果粒饮料中果渣的HPLC图;(c)胡柚皮中果胶的HPLC图;
图3为半乳糖醛酸标准曲线(以半乳糖醛酸峰面积/乳糖峰面积为纵坐标,半乳糖醛酸摩尔浓度为横坐标)。
具体实施方式
为了更好的理解本发明,下面结合实施例进一步阐明本发明的内容,但本发明的内容不局限于下面的实施例。
实施例1、一种果粒饮料(果肉饮料)中果胶含量的测定方法,依次进行以下步骤:
1)、将果粒饮料(果肉饮料)过滤,分别得果汁糖浆和果渣;
将10g的果渣用200ml体积浓度为80%乙醇煮沸20min,重复两次(即,将果渣取出后再次用200ml体积浓度为80%乙醇煮沸20min);过滤,丙酮冲洗滤渣,干燥(至恒重),得0.5g细胞壁材料,所得细胞壁材料为待测样品I;
将果汁糖浆作为待测样品II。
2)、取2mg细胞壁材料加入2ml的浓度为2mol/L的三氟乙酸(TFA)溶液进行水解,水解时间为8h,水解温度为110℃;得待测样品水解物I;
取2mL果汁加入2ml的浓度为2mol/L的三氟乙酸(TFA)溶液进行水解,水解时间为8h,水解温度为110℃;得待测样品水解物II。
3)、待测样品水解物I和待测样品水解物II分别进行如下操作:
用N2吹干至不含水分后,利用浓度分别为0.3M和0.1M的NaOH溶液调节pH值至中性(先用0.3M的NaOH溶液粗调,然后再用0.1M的NaOH溶液精调);然后定容至1ml。
4)、称取作为标准品的D-半乳糖醛酸配成浓度为0.002mol/L、0.004mol/L、0.006mol/L、0.008mol/L、0.01mol/的梯度标准溶液;
5)、将步骤3)的所得物和步骤4)所得的梯度标准溶液分别进行PMP衍生:
取400μL步骤3)的2种所得物,分别进行以下操作:
加入浓度为0.5mol/L的PMP溶液(PMP即1-苯基-3-甲基-5-吡唑酮,以甲醇为溶剂)400μL、浓度为0.3mol/L的NaOH溶液400μL以及50μL的0.002mol/L的半乳糖溶液,于70℃衍生30min;
将衍生后所得产物用0.3mol/L的HCl溶液(用量约400μL)中和至pH值为7,用氯仿萃取6次,每次氯仿的用量是1ml;最后所得萃取液过0.22μm的水膜备用。
分别取步骤4)所得的5个浓度的梯度标准溶液各400μL,均分别进行以下操作:
加入浓度为0.5mol/L的PMP溶液400μL、浓度为0.3mol/L的NaOH溶液400μL以及50μL0.002mol/L的半乳糖溶液,于70℃衍生30min;
将衍生后所得产物用0.3mol/L的HCl溶液(用量约400μL)中和至pH值为7,用氯仿萃取6次,每次氯仿的用量是1ml;最后所得萃取液过0.22μm的水膜备用。
6)、采用HPLC测定衍生样品(即将步骤5)的所得物均进行此步骤):
流动相A:15%(V/V)乙腈+0.05mol/L磷酸盐缓冲溶液(pH6.9);(即,乙腈与该磷酸盐缓冲溶液的体积比为15∶85;)
溶剂B:40%(V/V)乙腈+0.05mol/L磷酸盐缓冲溶液(pH6.9);(即,乙腈与该磷酸盐缓冲溶液的体积比为40∶60;)
HPLC条件:
色谱柱:Agilent Eclipse XDB C-18分离柱(4.6×250mm,5μm);
检测器:waters 2998紫外检测器;检测波长:250nm;
总流速:1.0mL/min;柱温:25℃;时间梯度:0→10→30min;
以流动相A和溶剂B的混合物作为洗脱液,溶剂B在洗脱液中的浓度梯度为0→15%→25%;
进样体积:10μL。
7)、分别以浓度为0.002mol/L、0.004mol/L、0.006mol/L、0.008mol/L和0.01mol/L的D-半乳糖醛酸衍生物所对应的峰面积为纵坐标,以标准D-半乳糖醛酸浓度为横坐标制作标准曲线(如表1和图3所示);根据样品D-半乳糖醛酸对用的峰面积查出待测样品在标准曲线上对应的浓度,从而相应的计算出果汁糖浆和果渣中的果胶含量(如表2所示)。
表1
半乳糖醛酸摩尔浓度 | 0.002mol/L | 0.004mol/L | 0.006mol/L | 0.008mol/L | 0.01mol/L |
半乳糖醛酸峰面积 | 878697 | 1768923 | 2845482 | 3368793 | 4210079 |
乳糖峰面积 | 624630 | 644824 | 692966 | 699009 | 654389 |
当待测物为果汁糖浆时,对应的半乳糖醛酸峰面积为2834285,乳糖峰面积为540269;当待测物为果渣时,半乳糖醛酸峰面积为3740661,乳糖峰面积为699009。
具体如下:
由标准曲线得方程y=606.46x+0.263,X代表半乳糖醛酸摩尔浓度,Y代表半乳糖醛酸峰面积/乳糖峰面积。因此将待测样品的峰面积/乳糖峰面积之比值带入方程y=606.46x+0.263可得到样品中半乳糖醛酸的摩尔浓度。
将上述果汁糖浆采用中华人民共和国农牧渔业部部标准测定果汁糖浆中的果胶含量,采用酸提取结合传统的咔唑比色法测定的果渣中的果胶含量,结果如表2所示。
表2
测定结果表明,本发明测定的果汁糖浆、果渣的果胶含量分别为398.42mg/L、271.28mg/g。采用中华人民共和国农牧渔业部部标准测定果汁中果胶的含量为318.29mg/L;采用酸提取结合传统的咔唑比色法测定的果渣中的果胶含量为63.58mg/g。本方法测定的果胶含量高于中华人民共和国农牧渔业部部标准和传统的咔唑比色法的测定结果,这是因为本方法无需对果胶进行提取,避免了果胶在提取过程中的损失。此外,植物组织细胞壁材料中可能存在酸不溶性果胶,这也是咔唑比色法测定结果偏低的原因之一。
实施例2、以胡柚皮切碎后代替实施例1中的果渣,其余等同实施例1(当然,去除了所有关于果汁糖浆的相应内容)。
实施例3、以番茄匀浆(捣碎)处理后代替实施例1中的果渣,其余等同实施例1(当然,去除了所有关于果汁糖浆的相应内容)。
上述待测物为胡柚皮时,半乳糖醛酸峰面积为4087112,乳糖峰面积为617884;上述待测物为番茄时,半乳糖醛酸峰面积为1718298,乳糖峰面积为512900。
采用酸提取结合传统的咔唑比色法分别测定上述胡柚皮和番茄中的果胶含量。
结论如表3所示。
表3
测定结果表明,本发明测定的胡柚皮和番茄中的果胶含量分别为363.17mg/g和240.85mg/g。采用酸提取结合传统的咔唑比色法测定的胡柚皮和番茄中的果胶含量分别为82.38mg/g和62.68mg/g。本方法测定的果胶含量高于中华人民共和国农牧渔业部部标准和传统的咔唑比色法的测定结果,这是因为本方法无需对果胶进行提取,避免了果胶在提取过程中的损失。此外,植物组织细胞壁材料中可能存在酸不溶性果胶,这也是咔唑比色法测定结果偏低的原因之一。
最后,还需要注意的是,以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然,本发明不限于以上实施例,还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形,均应认为是本发明的保护范围。
Claims (2)
1.果胶含量的测定方法,其特征是包括以下步骤:
1)、获得待测样品:
待测物为植物组织、果汁或果粒饮料;分别选用对应的以下方法:
将植物组织切碎或匀浆,然后加入体积浓度为50~80%的乙醇煮沸10~30分钟,过滤,丙酮冲洗滤渣,干燥,所得细胞壁材料为待测样品;所述植物组织与所述乙醇的料液比为10g/150~250mL;
果汁直接作为待测样品;
将果粒饮料进行过滤,分别得果汁糖浆和果渣;将果汁糖浆作为待测样品;或者在果渣中加入质量浓度为50~80%的乙醇煮沸10~30分钟,过滤,丙酮冲洗滤渣,干燥,所得细胞壁材料为待测样品;所述果渣与所述乙醇的料液比为10g/150~250mL;
2)、在步骤1)的待测样品中加入浓度为0.5~5mol/L的三氟乙酸溶液进行水解,水解时间为2~14h,水解温度为100~120℃;得待测样品水解物;
当待测样品为细胞壁材料时,料液比为:1g待测样品/0.8~1.2ml的三氟乙酸溶液;
当待测样品为果汁或者果汁糖浆时,料液比为:1ml待测样品/0.8~1.2ml的三氟乙酸溶液;
3)、将待测样品水解物用N2吹干的方式进行干燥处理,然后调节pH值至中性,并用水定容;
4)、称取作为标准品的半乳糖醛酸配成浓度为0.001mol/L ~0.01mol/L的梯度标准溶液;
5)、将步骤3)的所得物和步骤4)所得的梯度标准溶液分别进行PMP衍生:
在步骤3)的所得物/步骤4)所得的梯度标准溶液中分别加入浓度为0.1~1.0mol/L的PMP溶液、浓度为0.1~1.0mol/L的NaOH溶液以及浓度为0.0018~0.0022mol/L的半乳糖溶液,于60~80℃衍生20~40min;
所述步骤3)的所得物/所述步骤4)所得的梯度标准溶液、PMP溶液、NaOH溶液和半乳糖溶液的体积比为1:0.9~1.1:0.9~1.1:0.12~0.13;
将衍生后所得产物用0.1~1.0mol/L的HCl溶液中和至pH值为7,用氯仿萃取2~6次;萃取结束后过水膜;
6)、采用HPLC测定衍生样品:
流动相A:乙腈+0.05mol/L磷酸盐缓冲溶液;乙腈在流动相A中的体积浓度为15%;
溶剂B:乙腈+0.05mol/L磷酸盐缓冲溶液;乙腈在溶剂B中的体积浓度为40%;
0.05mol/L磷酸盐缓冲溶液为pH6.9;
HPLC条件:
色谱柱:Agilent Eclipse XDB C-18分离柱,
检测器:waters 2998紫外检测器;
检测波长:250nm;
流速:1.0mL/min;
柱温:25℃;
进样体积:10μL;
7)、以标准半乳糖醛酸浓度为横坐标,峰面积为纵坐标制作标准曲线;根据峰面积查待测样品在标准曲线上对应的浓度,从而计算待测物中的果胶含量。
2.根据权利要求1所述的果胶含量的测定方法,其特征是:所述步骤3)中:
当待测样品为细胞壁材料时,每2mg的待测样品用水定容至0.8~1.2ml;
当待测样品为果汁或者果汁糖浆时,每2ml的待测样品用水定容至0.8~1.2ml。
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Date | Code | Title | Description |
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Application publication date: 20120620 Assignee: Tian Cao biotech inc, Zhejiang Assignor: Zhejiang University Contract record no.: 2019330000028 Denomination of invention: Method for determining pectins content in china grass Granted publication date: 20131218 License type: Common License Record date: 20190315 |