CN102459600B - 提高种子中的物质生产性的基因及其利用方法 - Google Patents

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Abstract

探索了具有能够增加或减少物质生产性、特别地是种子中油脂含量的新功能的基因。将包含序列号1～158中任一偶数编号所示氨基酸序列的蛋白质的转录因子与将任意转录因子转换成转录抑制因子的功能性肽融合而成的嵌合蛋白质在植物体表达。

Description

提高种子中的物质生产性的基因及其利用方法
背景技术
植物是以获得其一部分组织本身(种子、根、叶茎等)为目的栽培的，或者是以生产油脂等各种物质为目的栽培的。例如，作为由植物产生的油脂，大豆油、胡麻油、橄榄油、椰子油、米糠油、棉籽油、向日葵油、玉米油、红花油、棕榈油和菜籽油等自古以来已经为人们所知，在家庭用途和/或工业用途中被广泛利用。另外，由植物产生的油脂也可以作为生物柴油燃料和/或生物塑料的原料使用，作为石油替代能源应用性正在扩大。
在这样的现状下，为了使用植物在工业上成功地进行油脂生产，需要提高每单位耕地面积的生产性。这里假定每单位耕地面积的栽培个体数一定，则可判定需要提高每个个体的油脂生产量。在从由植物体采摘的种子中回收油脂的情况下，通过提高每个个体的种子产量、和提高种子中的油脂含量等技术，可期待能够实现提高每个个体的油脂生产量。
增加植物种子的油脂生产量的技术大致分为通过改良栽培法的技术和油脂增产品种的开发。油脂增产品种的开发方法大致分为以杂交技术为核心的现有育种法和利用基因重组的分子育种法。作为通过基因重组的油脂增产技术，已知：A)改变作为植物油脂的主成分的种子三酰甘油(TAG)的合成体系的技术、和B)对调控植物的形态形成和/或代谢和与它们相关的基因的表达的各种调控基因进行改变的技术。
对于上述A)的方法，作为增加以通过光合成生产的糖为原料合成的TAG的合成量的方法，可以考虑(1)提高从作为TAG的构成成分的脂肪酸或甘油的糖的合成活性的方法、(2)强化由甘油和脂肪酸合成TAG的反应的方法。对于这些方法，作为使用基因工程学方法的技术，报告了以下技术。作为(1)的例子，可列举通过使拟南芥的细胞质型乙酰辅酶A羧化酶(ACCase)在油菜籽的质体中过量表达，从而将种子的油脂含量提高5％的报告(非专利文献1)。另外，作为(2)的例子，可列举涉及通过在二酰甘油的sn-3位转移酰基的DGAT(二酰甘油酰基转移酶)的过量表达来使油脂增产的技术的报告(非专利文献2)。在非专利文献2的方法中，还报告了有时油脂含量和种子重量随着DGAT的表达量增加而增加，每个个体的种子数增加。应用了该方法的拟南芥的种子油脂含量增加46％，每个个体的油脂量最高增加约125％。
另一方面，作为上述B)的方法，考虑了对与生物合成体系酶基因的表达调控相关的转录因子基因的表达进行调控的方法。作为其例子可列举专利文献1。在该专利文献1中，采用了制作大范围地将转录因子过量表达或敲除而得的重组植物，然后筛选出提高种子的油脂含量的基因的方法。专利文献1记载了通过ERF亚家族B-4转录因子基因的过量表达而使种子的油脂含量增加了23％。但是，在专利文献1中，没有记载每个个体的油脂含量增减。另外，非专利文献3记载了通过使作为具有AP2/EREB结构域的转录因子的WRINKLED1过量表达，提高了种子的油脂含量。
另一方面，在将植物体中含有的纤维素等烃成分进行糖化后，通过发酵制备醇的情形，植物中含有的油脂成分成为杂质，认为这引起了糖化工序中的糖化效率低下。因此，如果能够降低油脂含量，则能够提高糖化工序中的糖化效率，结果能够期待提高醇的生产性。例如，在非专利文献3中，公开了WRI1/ASML1(AP2家族转录因子、AGI代码：AT3g54320)缺陷株的种子变为皱的，油脂含量减少。另外，专利文献2中公开了，通过过量表达AT3g23250(MYB15)将种子的油脂含量减少了13％，通过过量表达AT1g04550(IAA12)将种子的油脂含量减少了12％，通过过量表达AT1g66390(MYB90)将种子的油脂含量减少了16％。
但是，尽管以改良各种性状为目的开发了上述的分子育种法，但实现油脂的生产性提高或者降低的技术尚未达到实用的程度。
认为其原因在于：未发现真正优异的基因；在试验阶段有效的重组新品种在实用阶段多样的自然环境下不能发挥如期待的效果。另外，目的物质的生产性等量的性状与从调控体系到代谢体系的各步骤中的大量基因相关，发现、开发改善量的性状的真正优异的有用基因是困难的。为了解决这些问题，发现效果非常高的新基因、开发虽然效果水平同等但能在实用环境条件下发挥效果的基因成为课题。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：WO01/36597
专利文献2：WO01/35727
非专利文献
非专利文献1：Plant Physiology(1997)，第11卷，第75-81页；
非专利文献2：Plant Physiology(2001)，第126卷，第861-874页；
非专利文献3：Plant J.(2004)40，575-585
发明内容
发明要解决的问题
因此，鉴于上述事实，本发明的目的是探索具有能够增加或减少物质生产性的新功能的基因，提供能够提高植物体中的这些特性的技术。
用于解决问题的方法
为了实现上述目的，本发明者们进行了深入研究，结果发现，通过表达由特定的转录因子和将任意转录因子转换成转录抑制因子的功能性肽(以下，也有时称为阻遏物结构域)融合而成的嵌合蛋白质，可以改善各种量的性状，特别是能够增加或减少物质生产性，从而完成了本发明。
本发明所涉及的植物体表达由转录因子和功能性肽融合而成的嵌合蛋白质，所述转录因子是包含以下(a)～(c)任一项所述蛋白质的转录因子，所述功能性肽是将任意转录因子转换成转录抑制因子的功能性肽。
(a)包含序列号1～158中任一偶数编号所示氨基酸序列的蛋白质；
(b)包含序列号1～158中任一偶数编号所示氨基酸序列中缺失、置换、添加或插入了1个或多个氨基酸而得的氨基酸序列、并具有转录促进活性的蛋白质；
(c)与包含序列号1～158中任一奇数编号所示碱基序列的互补碱基序列的多核苷酸在严格条件下杂交的多核苷酸编码的、并具有转录促进活性的蛋白质。
在本发明所涉及的植物体中，优选通过融合功能性肽，来抑制特定的转录因子的转录调控活性、特别是转录促进活性。这里作为上述功能性肽，可列举以下所示的式(1)～(8)。
(1)X1-Leu-Asp-Leu-X2-Leu-X3
(其中，式中的X1表示0～10个氨基酸残基、X2表示Asn或Glu、X3表示至少6个氨基酸残基。)
(2)Y1-Phe-Asp-Leu-Asn-Y2-Y3
(其中，式中的Y1表示0～10个氨基酸残基、Y2表示Phe或Ile、Y3表示至少6个氨基酸残基。)
(3)Z1-Asp-Leu-Z2-Leu-Arg-Leu-Z3
(其中，式中的Z1表示Leu、Asp-Leu或Leu-Asp-Leu、Z2表示Glu、Gln或Asp、Z3表示0～10个氨基酸残基。)
(4)Asp-Leu-Z4-Leu-Arg-Leu
(其中，式中的Z4表示Glu、Gln或Asp。)
(5)α1-Leu-β1-Leu-γ1-Leu
(6)α1-Leu-β1-Leu-γ2-Leu
(7)α1-Leu-β2-Leu-Arg-Leu
(8)α2-Leu-β1-Leu-Arg-Leu
(其中，式(5)～(8)中，α1表示Asp、Asn、Glu、Gln、Thr或Ser、α2表示Asn、Glu、Gln、Thr或Ser、β1表示Asp、Gln、Asn、Arg、Glu、Thr、Ser或His、β2表示Asn、Arg、Thr、Ser或His、γ1表示Arg、Gln、Asn、Thr、Ser、His、Lys或Asp、γ2表示Gln、Asn、Thr、Ser、His、Lys或Asp。)
另外，在本发明所涉及的植物体中，每个个体的物质生产性、特别是种子中含有的油脂的生产性变为显著提高或减少。作为特定的组织，可以例举种子。此处的显著是指，与不表达上述嵌合蛋白质的植物体中的物质生产性相比较时，具有统计上显著不同的物质生产性增加或减少。
另一方面，本发明提供了上述的嵌合蛋白质、编码该嵌合蛋白质的基因、包含该基因的表达载体、以及包含该基因的转化体。
本说明书包含作为本申请的优先权基础的日本专利申请2009-135321的说明书和/或附图所记载的内容。
发明的效果
本发明所涉及的植物体是每个个体的物质生产性、特别是种子中含有的油脂量提高或减少了的植物体。因此，通过使用本发明所涉及的植物体，能够在以源自植物体的油脂为目的的情形时提高生产性，或者，能够减低作为杂质的油脂，从而能够例如在利用植物体生产生物醇等中实现优异的效率。
具体实施方式
以下，详细说明本发明。
本发明所涉及的植物体表达特定的转录因子与将任意转录因子转换成转录抑制因子的功能性肽融合而成的嵌合蛋白质，与野生型植物体相比较，每个个体的物质生产性、特别是种子中含有的油脂的生产性显著提高或减少。即，本发明所涉及的植物体是以所需的植物为对象，为了显著提高或减少该植物的物质生产性，使转录因子作为与上述功能性肽的嵌合蛋白质表达的植物体。
特别是在本发明所涉及的植物体中，优选通过与上述功能性肽融合来抑制转录因子的转录促进活性。换言之，本发明所涉及的植物体优选具有如下特征：表达转录因子与上述功能性肽融合而成的嵌合蛋白质，结果由上述功能性肽所产生的转录抑制效果作为优势的性状而显现出来。
这里，所谓每个个体的物质生产性是指由植物产生的各种物质的每单位体积的含量。作为物质，不特别限定，既可以是植物体本来产生的物质，也可以是植物体本来不产生但能够通过基因操作技术等产生的物质。
特别是如果每个组织的目的生产物的含量高，则能够降低精制成本和/或运输成本，因此产业上的有用性高。特别是作为目的生产物，可以是占植物的大部分重量的木素纤维素，也可以是作为种子油在产业上利用的植物油。植物油可以是作为脂肪酸与醇的酯的单纯脂质，也可以是含有磷、糖和/或氮等的复合脂质，还可以是脂肪酸本身。作为单纯脂质的醇，可以是分子量高的高级醇，也可以是丙三醇(甘油)等多元醇。作为单纯脂质的脂肪酸，可以是饱和脂肪酸，也可以是不饱和脂肪酸，另外，还可以是含有羟基和/或环氧基的特殊脂肪酸。作为甘油与脂肪酸的酯的单纯脂质，可以是单酰甘油，也可以是二酰甘油，还可以是三酰甘油。
另一方面，根据植物体的用途，植物体中含有的特定物质成为杂质。因此，如果降低该特定物质的生产性，则降低了杂质含量，这在产业上有用性是高的。例如，在糖化植物体中含有的木素纤维素的情形，植物体中含有的油脂成分作为杂质，有时对于糖化效率产生坏的影响。因此，如果降低油脂的生产性，则能够在利用植物体制备生物醇等的工艺中提高糖化工序的效率。
在以下的说明中，作为提高或降低其生产性的物质例示油脂进行说明，但本发明的技术范围不限于此。本发明对于作为植物所产生的物质的除油脂以外的物质也同样适用。
这里，作为植物体，不特别限定，可以以任何植物为对象。特别优选以一直以来用于油脂生产的植物为对象。作为对象植物，可列举例如，大豆、胡麻、橄榄油、椰子、稻、棉花、向日葵、玉米、甘蔗、麻疯树、椰子(パ一ムヤシ)、烟草、红花和油菜籽等。另外，还可以以在植物的基因分析中作为模型生物被广泛应用的、已确立了基因表达分析方法的拟南芥为对象植物。
另外，所谓转录因子的嵌合蛋白质所具有的转录抑制活性，是指识别该转录因子所识别的cis序列、和/或与该cis序列类似的其他转录因子中的cis序列，积极地抑制下游基因表达的活性，也称为转录抑制因子。对使转录因子的嵌合蛋白质具有转录抑制活性的方法，不特别限定，特别是构建添加了阻遏物结构域序列和/或SRDX序列的嵌合蛋白质(融合蛋白质)的方法是最优选的。
在该方法中所谓阻遏物结构域序列，是指构成将任意转录因子转换成转录抑制因子的肽的氨基酸序列，是由本发明者们发现的各种序列。对于使用阻遏物结构域序列的方法，例如，可以参考特开2001-269177公报、特开2001-269178公报、特开2001-292776公报、特开2001-292777公报、特开2001-269176公报、特开2001-269179公报、国际公开第WO03/055903号小册子、Ohta，M.，Matsui，K.，Hiratsu，K.，Shinshi，H.和Ohme-Takagi，M.，The Plant Cell，Vol.13，1959-1968，2001年8月；以及Hiratsu，K.，Ohta，M.，Matsui，K.，Ohme-Takagi，M.，FEBS Letters 514(2002)351-354。阻遏物结构域序列是从II类ERF(乙烯应答元件结合蛋白(Ethylene ResponsiveElement Binding Factor))蛋白质和/或植物的锌指蛋白(Zinc FingerProtein，例如拟南芥SUPERMAN蛋白质等)中截取的序列，具有极其单纯的结构。
作为以嵌合蛋白质的形式表达的转录因子，可以列举表1及表2中所示的在拟南芥中以AGI代码表示的特定转录因子。其中，表1所示的转录因子是在植物体以与阻遏物结构域融合的嵌合蛋白质形式表达时，显著提高种子中的油脂含量的转录因子。另一方面，表2所示的转录因子是在植物体以与阻遏物结构域融合的嵌合蛋白质形式表达时，显著降低种子中的油脂含量的转录因子。
表1
  AGI代码   碱基序列   氨基酸序列
  At5g47230   序列号1   序列号2
  At1g22985   序列号3   序列号4
  At1g80580   序列号5   序列号6
  At1g25470   序列号7   序列号8
  At1g67260   序列号9   序列号10
  At4g36160   序列号11   序列号12
  At5g64750   序列号13   序列号14
  At4g01550   序列号15   序列号16
  At1g24260   序列号17   序列号18
  At5g09330   序列号19   序列号20
  At2g31230   序列号21   序列号22
表2
另外，作为嵌合蛋白质的对象的转录因子不仅限于包含表1及2所示氨基酸序列(序列号1～158中的偶数编号)的转录因子，也可以是含有在该氨基酸序列中缺失、置换、添加或插入了1个或多个氨基酸序列的氨基酸序列、且具有转录促进活性的转录因子。这里，作为多个氨基酸，例如，表示1～20个，优选为1～10个，更优选为1～7个，进一步优选为1个～5个，特别优选为1个～3个。此外，氨基酸的缺失、置换或添加可以通过利用该技术领域公知的方法改变编码上述转录因子的碱基序列来进行。为了在碱基序列中导入突变，可以通过Kunkel法或Gapped duplex法(缺口双链体法)等公知方法或依据这些公知方法的方法来进行，例如，使用利用了定点诱变法的突变引入用试剂盒(例如Mutant-K和/或Mutant-G(均为商品名，TAKARA Bio社制))等，或使用LA PCR in vitro Mutagenesis系列试剂盒(商品名，TAKARA Bio社制)来引入突变。另外，作为突变引入方法，还可以是使用以EMS(甲磺酸乙酯)、5-溴尿嘧啶、2-氨基嘌呤、羟胺、N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍、其他的致癌性化合物为代表的化学诱变剂的方法，还可以是利用以X射线、α射线、β射线、γ射线、离子束为代表的放射线处理和/或紫外线处理的方法。
另外，作为嵌合蛋白质的对象的转录因子不限于表1及2所示的拟南芥中的转录因子，还包括除拟南芥以外的植物(例如上述的植物)中具有相同功能的转录因子(以下，称为同源转录因子)。对于这些同源转录因子，如果植物基因组信息已清楚，则可以基于表1及2所示的氨基酸序列或各基因的碱基序列从检索对象植物的基因组信息中进行检索。这时，作为同源转录因子，检索与表1及2所示的氨基酸序列具有例如为70％以上、优选为80％以上、更优选为90％以上、最优选为95％以上的同源性的氨基酸序列。这里，同源性的值意味着使用安装了blast算法的计算机程序和存储了基因序列信息的数据库、以默认设定求得的值。
另外，在植物基因组信息不清楚的情况下，可以从对象植物提取基因组或构建对象植物的cDNA文库，通过分离与编码表1及2所示的转录因子的基因的至少一部分在严格条件下杂交的基因组区域或cDNA来鉴定同源基因。这里，所谓严格条件，是指形成所谓特异性的杂合体、且不形成非特异性的杂合体的条件。例如，可列举在45℃、6×SSC(氯化钠/柠檬酸钠)下进行杂交、然后在50～65℃、0.2～1×SSC、0.1％SDS下进行洗涤，或者作为这样的条件，可列举在65～70℃、1×SSC下进行杂交、然后在65～70℃、0.3×SSC下进行洗涤。杂交可以按照J.Sambrook等人，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，2nd Ed.(分子克隆实验指南第二版)，Cold Spring Harbor Laboratory(1989)所记载的方法等现有公知的方法来进行。
本发明所涉及的植物体通过表达如上所述的转录因子与功能性肽的嵌合蛋白质来显示种子中的油脂生产量显著变动(提高或减少)这样的特征。特别是通过制成嵌合蛋白质，可以使对象转录因子以抑制了转录促进活性的状态表达，并且使其以识别与对象转录因子所识别的cis序列具有同源性的cis序列的转录抑制活性表达，使对象转录因子所具有的与其他因子、核酸、脂质和/或糖质的亲和特异性变化，从而显示种子中的油脂生产量显著变动(提高或减少)这样的特征。这时，在上述植物体中，既可以改变内源性的转录因子来产生其嵌合蛋白质，也可以导入编码嵌合蛋白质的基因来使该基因表达。
作为一例，优选以下方法：将编码由如上所述的转录因子与将任意转录因子转换成转录抑制因子的功能性肽融合而成的嵌合蛋白质(融合蛋白质)的基因导入对象植物中，使该嵌合蛋白质(融合蛋白质)在植物内表达的方式。
作为本说明书中所记载的“转录促进活性被抑制的转录因子”，不特别限定，是指该转录因子本来具有的转录促进活性显著降低了的转录因子。另外，所谓“将任意转录因子转换成转录抑制因子的功能性肽”，是指当与任意转录因子融合形成嵌合蛋白质时，具有形成该转录因子本来具有的转录促进活性显著降低了的转录因子的功能的肽(也有时称为转录抑制转换肽)。作为这样的“将任意转录因子转换成转录抑制因子的功能性肽”，不特别限定，但优选含有作为阻遏物结构域序列和/或SRDX序列已知的氨基酸序列的肽。对于转录抑制转换肽，在特开2005-204657号公报中有详细叙述，可以使用该公报所公开的所有肽。
转录抑制转换肽可以列举例如以下所示式(1)～(8)的任一项所示的氨基酸序列。
(1)X1-Leu-Asp-Leu-X2-Leu-X3
(其中，式中的X1表示0～10个氨基酸残基、X2表示Asn或Glu、X3表示至少6个氨基酸残基。)
(2)Y1-Phe-Asp-Leu-Asn-Y2-Y3
(其中，式中的Y1表示0～10个氨基酸残基、Y2表示Phe或Ile、Y3表示至少6个氨基酸残基。)
(3)Z1-Asp-Leu-Z2-Leu-Arg-Leu-Z3
(其中，式中的Z1表示Leu、Asp-Leu或Leu-Asp-Leu、Z2表示Glu、Gln或Asp、Z3表示0～10个氨基酸残基。)
(4)Asp-Leu-Z4-Leu-Arg-Leu
(其中，式中的Z4表示Glu、Gln或Asp。)
(5)α1-Leu-β1-Leu-γ1-Leu
(6)α1-Leu-β1-Leu-γ2-Leu
(7)α1-Leu-β2-Leu-Arg-Leu
(8)α2-Leu-β1-Leu-Arg-Leu
(其中，式(5)～(8)中，α1表示Asp、Asn、Glu、Gln、Thr或Ser、α2表示Asn、Glu、Gln、Thr或Ser、β1表示Asp、Gln、Asn、Arg、Glu、Thr、Ser或His、β2表示Asn、Arg、Thr、Ser或His、γ1表示Arg、Gln、Asn、Thr、Ser、His、Lys或Asp、γ2表示Gln、Asn、Thr、Ser、His、Lys或Asp。)
式(1)的转录抑制转换肽
在上述式(1)的转录抑制转换肽中，上述X1所示的氨基酸残基的数只要在0～10个的范围内即可。另外，对构成X1所示的氨基酸残基的具体氨基酸种类不特别限定，可以是任何氨基酸。从合成式(1)的转录抑制转换肽时的容易程度出发，该X1所示的氨基酸残基优选尽量短。具体来说，X1所示的氨基酸残基优选为5个以下。
同样地，在上述式(1)的转录抑制转换肽中，上述X3所示的氨基酸残基的数只要是至少6个即可。另外，对构成X3所示的氨基酸残基的具体氨基酸种类不特别限定，可以是任何氨基酸。
式(2)的转录抑制转换肽
在上述式(2)的转录抑制转换肽中，与上述式(1)的转录抑制转换肽的X1同样地，上述Y1所示的氨基酸残基的数只要在0～10个的范围内即可。另外，对构成Y1所示的氨基酸残基的具体氨基酸种类不特别限定，可以是任何氨基酸。具体来说，Y1所示的氨基酸残基优选为5个以下。
同样地，在上述式(2)的转录抑制转换肽中，与上述式(1)的转录抑制转换肽的X3同样地，上述Y3所示的氨基酸残基的数只要是至少6个即可。另外，对构成Y3所示的氨基酸残基的具体氨基酸种类不特别限定，可以是任何氨基酸。
式(3)的转录抑制转换肽
在上述式(3)的转录抑制转换肽中，上述Z1所示的氨基酸残基在1～3个的范围内、并含有Leu。在氨基酸为1个的情况下，是Leu，在氨基酸为2个的情况下，是Asp-Leu，在氨基酸为3个的情况下，是Leu-Asp-Leu。
另一方面，在上述式(3)的转录抑制转换肽中上述Z3所示的氨基酸残基的数只要在0～10个的范围内即可。另外，对构成Z3所示的氨基酸残基的具体氨基酸种类不特别限定，可以是任何氨基酸。具体来说，Z3所示的氨基酸残基更优选为5个以下。作为Z3所示的氨基酸残基的具体例，可列举Gly、Gly-Phe-Phe、Gly-Phe-Ala、Gly-Tyr-Tyr、Ala-Ala-Ala等，当然不限于这些。
另外，对该式(3)所示的转录抑制转换肽整体的氨基酸残基的数不特别限定，从合成时的容易程度出发，优选为20个氨基酸以下。
式(4)的转录抑制转换肽
上述式(4)的转录抑制转换肽是含有6个氨基酸残基的六聚体(6mer)。此外，在上述式(4)的转录抑制转换肽中Z4所示的氨基酸残基是Glu的情况下的氨基酸序列，相当于拟南芥SUPERMAN蛋白质(SUP蛋白质)的第196～201位氨基酸序列。
以上说明的各种转录抑制转换肽可以通过与上述转录因子融合形成嵌合蛋白质(融合蛋白质)，从而改变该转录因子的特性。具体来说，可以通过与上述转录因子融合形成嵌合蛋白质(融合蛋白质)，从而将转录因子转换成转录抑制因子和/或负的转录共激活因子。另外，还可以将不是显性的转录抑制因子变成显性型转录抑制因子。
另外，如果使用编码上述转录抑制转换肽的多核苷酸，获得了与编码转录因子的基因的融合基因，则可以生产嵌合蛋白质(融合蛋白质)。具体来说，通过将编码上述转录抑制转换肽的多核苷酸(称为转录抑制转换多核苷酸)与编码上述转录因子的基因连接来构建融合基因，并导入植物细胞中。由此可以生产嵌合蛋白质(融合蛋白质)。对上述转录抑制转换多核苷酸的具体碱基序列不特别限定，只要基于遗传密码，包含与上述转录抑制转换肽的氨基酸序列对应的碱基序列即可。另外，根据需要，上述转录抑制转换多核苷酸还可以含有作为用于与转录因子基因连接的连接部位的碱基序列。而且，在上述转录抑制转换多核苷酸的氨基酸阅读框与转录因子的基因的阅读框不一致这样的情况下，还可以含有用于使它们一致的添加的碱基序列。并且，还可以含有具有用于使转录因子与转录抑制转换肽之间连接的接头(linker)功能的多肽、和/或像His和/或Myc、Flag等那样用于赋予嵌合蛋白质(融合蛋白质)表位标记的多肽等的各种附加多肽。另外，根据需要，上述嵌合蛋白质(融合蛋白质)还可以含有除多肽以外的结构、例如糖链和/或类异戊二烯基等。
对于制造植物体的方法，只要是包括在植物体内生产上述转录因子与转录抑制转换肽的嵌合蛋白质的过程即可，不特别限定，例如，可列举包括表达载体构建工序、转化工序、筛选工序等工序的制造法方法。以下对各工序进行具体说明。
表达载体构建工序
表达载体构建工序只要是构建含有编码上述转录因子的基因、转录抑制转换多核苷酸和启动子的重组表达载体的工序即可，不特别限定。作为重组表达载体的母体的载体，可以使用现有公知的各种载体。例如，可以使用质粒、噬菌体或粘粒等，可以根据所导入的植物细胞和/或导入方法不同来适当选择。具体来说，可列举例如，pBR322、pBR325、pUC19、pUC119、pBluescript、pBluescriptSK、pBI系列的载体等。特别是在向植物体的载体导入法是使用农杆菌的方法时，优选使用pBI系列的双元载体。作为pBI系列的双元载体，具体来说，可列举例如pBIG、pBIN19、pBI101、pBI121、pBI221等。
启动子只要是能够在植物体内表达基因的启动子即可，不特别限定，优选使用公知的启动子。作为所述启动子，可列举例如，花椰菜花叶病毒35S启动子(CaMV35S)、各种肌动蛋白基因启动子、各种遍在蛋白基因启动子、胭脂碱合成酶基因的启动子、烟草的PR1a基因启动子、番茄的核酮糖1，5-二磷酸羧化酶/加氧酶小亚基基因启动子、Napin(油菜储藏蛋白)基因启动子、油质蛋白(oleosin)基因启动子等。其中，更优选使用花椰菜花叶病毒35S启动子、肌动蛋白基因启动子或遍在蛋白基因启动子。如果使用上述各启动子，则可以在导入植物细胞内时可以使任意基因强表达。启动子只要使得编码转录因子的基因与转录抑制转换多核苷酸连接而成的融合基因能够表达那样地连接、并导入载体内即可，对作为重组表达载体的具体结构不特别限定。
此外，重组表达载体中除了启动子和上述融合基因之外，还可以含有其他DNA节段。对该其他DNA节段不特别限定，可列举终止子、筛选标记、增强子、用于提高翻译效率的碱基序列等。另外，上述重组表达载体还可以具有T-DNA区。T-DNA区特别是在使用农杆菌将上述重组表达载体导入植物体中的情况下可以提高基因导入的效率。
转录终止子只要具有作为转录终止部位的功能即可，不特别限定，可以是公知的终止子。例如，具体来说，优选使用胭脂碱合成酶基因的转录终止区(Nos终止子)、花椰菜花叶病毒35S的转录终止区(CaMV35S终止子)等。其中更优选使用Nos终止子。在上述重组载体中，可以通过将转录终止子配置在适当的位置，从而在导入植物细胞之后防止不必要地合成长转录物、强启动子使质粒的拷贝数减少等现象发生。
作为转化体筛选标记，例如，可以使用抗药性基因。作为所述抗药性基因的具体例，可列举例如，针对潮霉素、博来霉素、卡那霉素、庆大霉素、氯霉素等的抗药性基因。由此，通过选择在含有上述抗生素的培养基中生长的植物体，可以容易地筛选转化的植物体。
作为用于提高翻译效率的碱基序列，可列举例如，烟草花叶病毒来源的omega序列。通过使该omega序列配置在启动子的非翻译区(5’UTR)，可以提高上述融合基因的翻译效率。这样，根据其目标，上述重组表达载体可以含有各种DNA节段。
对于重组表达载体的构建方法，不特别限定，只要在适当选择的作为母体的载体中，以规定的顺序导入上述启动子、编码转录因子的基因、转录抑制转换多核苷酸、以及根据需要的上述其他DNA节段即可。例如，将编码转录因子的基因与转录抑制转换多核苷酸连接来构建融合基因，接着将该融合基因与启动子(根据需要的转录终止子等)连接来构建表达盒(expression cassette)，将其导入载体即可。
在嵌合基因(融合基因)的构建和表达盒的构建中，例如，可以通过预先使各DNA节段的切割部位形成彼此互补的突出末端，然后用连接酶使其反应，从而规定该DNA节段的顺序。此外，在表达盒包含终止子的情况下，从上游开始依次为启动子、上述嵌合基因、终止子即可。另外，对于用于构建重组表达载体的试剂种类、即限制性酶和/或连接酶等的种类不特别限定，适当选择使用市售的试剂即可。
另外，对上述重组表达载体的增殖方法(生产方法)也不特别限定，可以使用现有公知的方法。一般以大肠杆菌为宿主使其在该大肠杆菌内增殖即可。这时，可以根据载体的种类来选择优选的大肠杆菌的种类。
转化工序
本发明中进行的转化工序，是使用上述重组表达载体将上述融合基因导入植物细胞以使其表达的工序。对使用重组表达载体导入植物细胞的方法(转化方法)不特别限定，可以根据植物细胞而使用适当的现有公知的方法。具体来说，例如，可以使用利用农杆菌的方法和/或直接导入植物细胞的方法。作为利用农杆菌的方法，例如，可以使用Bechtold，E.，Ellis，J.和Pelletier，G.(1993)In Planta Agrobacterium-mediated gene transfer byinfiltration of adult Arabidopsis plants.C.R.Acad.Sci.Paris Sci.Vie，316，1194-1199或者Zyprian E，Kado Cl，Agrobacterium-mediated planttransformation by novel mini-T vectors in conjunction with a high-copy virregion helper plasmid.Plant Molecular Biology，1990，15(2)，245-256.所记载的方法。
作为将含有重组表达载体和对象基因的DNA直接导入植物细胞的方法，例如，可以使用微注射法、电穿孔法、聚乙二醇法、基因枪法、原生质体融合法、磷酸钙法等。
另外，如果采用将DNA直接导入植物细胞的方法，则只要是含有对象基因表达所需的转录单位例如启动子和/或转录终止子、以及对象基因的DNA就足够了，载体功能不是必须的。而且，即使是不具有转录单位的仅含有对象基因的蛋白质编码区的DNA也可以，只要是能够整合到宿主的转录单位内、并表达对象基因即可。
作为导入了上述含有重组表达载体和对象基因的DNA、和/或不含表达载体而含有对象基因DNA的DNA的植物细胞，可列举例如，花、叶、根等植物器官中各组织的细胞、愈伤组织、悬浮培养细胞等。这里，在本发明所述的植物体的生产方法中，上述重组表达载体既可以根据要进行生产的植物体的种类来构建适当载体，也可以预先构建通用的重组表达载体，将其导入植物细胞。即，在本发明所涉及的植物体的制造方法中，既可以包含上述使用重组表达载体的转化用DNA构建工序，也可以不包含所述工序。
其他工序、其他方法
在本发明所涉及的植物体的生产方法中，只要包含上述转化工序即可，还可以包含上述使用重组表达载体的转化用DNA构建工序，但还可以另外包含其他工序。具体来说，可列举从转化后的植物体中筛选适当的转化体的筛选工序等。
对筛选方法不特别限定，例如，可以以潮霉素抗性等抗药性为基准进行筛选，也可以在培育出转化体之后，采集植物体的种子，基于种子中的油脂含量进行筛选。例如，作为基于油脂含量进行筛选的例子，可列举采集植物体的种子，然后按照常规方法测定种子中的油脂含量，并与未转化的植物体种子中的油脂含量进行比较的方法(参考后述的实施例)。
在本发明所涉及的植物体的制造方法中，由于将上述融合基因导入植物体，因而可以由该植物体通过有性繁殖或无性繁殖来获得油脂含量显著提高的后代。另外，可以由该植物体和/或其后代获得植物细胞和/或种子、果实、植株、愈伤组织、块茎、扦插枝、块等繁殖材料，以它们为基础来大量生产该植物体。因此，在本发明所涉及的植物体的制造方法中，可以包含繁殖筛选后的植物体的繁殖工序(大量生产工序)。
此外，所谓本发明中的植物体，包含长成的植物个体、植物细胞、植物组织、愈伤组织、种子的至少任一者。即，在本发明中，只要是最终能生长成植物个体的状态即全部可看作是植物体。另外，上述植物细胞包括各种形态的植物细胞。作为所述植物细胞，包含例如，悬浮培养细胞、原生质体、叶的切片等。通过使这些植物细胞增殖、分化可以获得植物体。此外，由植物细胞再生植物体可以根据植物细胞的种类使用现有公知的方法来进行。因此，在本发明所涉及的植物体的制造方法中，还可以包括由植物细胞等再生植物体的再生工序。
另外，本发明所涉及的植物体的生产方法不限于利用重组表达载体进行转化的方法，还可以使用其他方法。具体来说，例如，可以将上述嵌合蛋白质(融合蛋白质)本身给予植物体。在这种情形时，为了能够在最终利用的植物体的部位提高油脂含量，只要对幼年期的植物体给予嵌合蛋白质(融合蛋白质)即可。另外对嵌合蛋白质(融合蛋白质)的给予方法也不特别限定，使用公知的各种方法即可。
正如以上说明的那样，根据本发明，可以通过使特定的转录因子与上述功能性肽的嵌合蛋白质表达，来提供与野生型植物体相比较而言物质生产性变动(提高或减少)了的植物体。如果在植物体中表达上述嵌合蛋白质，则有时对象转录因子的转录促进活性被抑制，或有时针对对象转录因子所识别的cis序列的同源序列显示转录抑制效果。而且，嵌合蛋白质有时针对与对象转录因子和/或转录共激活因子具有亲和性的其他因子、DNA、RNA、脂质或糖质发挥作用以使该亲和特异性发生变化，或有时针对与对象转录因子无亲和性的物质发挥作用以使其亲和性提高。在本发明所涉及的植物体中，虽然嵌合蛋白质的对象转录因子、识别与该转录因子所识别的cis序列具有同源性的cis序列的转录因子、与嵌合蛋白质的对象转录因子具有同源性的转录因子、与嵌合蛋白质的对象转录因子具有亲和性的其他因子等也同样地在植物体内表达，但通过上述嵌合蛋白质的作用效果，能够显性负性地抑制调控对象的基因表达。由此，认为在本发明所涉及的植物体中，与植物的生长相关的基因簇的表达水平、以及与油脂生产相关的基因簇和/或与生产出的油脂的分解相关的基因簇的表达水平发生变化，其结果是油脂含量显著变动。
这里所谓油脂含量显著变动，意味着以下任一种情况：与野生型相比较每一粒种子的质量无变化但油脂量提高的情况；与野生型相比较每一粒种子的质量显著变大或者变小、且油脂量提高的情况；与野生型相比较种子中的油脂含量提高或减少的情况。在任一种情况下，每一个植物个体所生产的油脂量变动。
更具体地，在表达表1所示转录因子的嵌合蛋白质的情形，植物体的油脂含量提高。在本发明所涉及的植物体中，对于油脂含量增加了的植物体，能够在植物来源的油性的制造方法中利用。例如，可以使本发明所涉及的植物体成长并采摘种子，从采摘的种子中回收油脂成分来制造油脂。特别是利用了本发明所涉及的植物体的油脂制造方法由于植物的每一个个体中油脂含量高，因而可以说是生产性优异的方法。换言之，如果假定每单位耕地面积的栽培个体数一定，则通过利用本发明所涉及的植物体，可以大幅提高由每单位耕地面积制造的油脂量。因此，通过利用本发明所涉及的植物体，可以大幅削减油脂生产所需的制造成本。
而且，利用了本发明所涉及的植物体的油脂制造方法由于每单位重量的种子中的油脂含量高，因而可以说是生产性优异的方法。此外，在利用了本发明所涉及的植物体的油脂制造方法中，作为制造对象的油脂，不特别限定，可例示例如，大豆油、胡麻油、橄榄油、椰子油、米糠油、棉籽油、向日葵油、玉米油、红花油和菜籽油等植物来源的油脂。另外，制造的油脂可以在家庭用途和/或工业用途中广泛利用，还可以作为生物柴油燃料的原料使用。即，通过利用本发明所涉及的植物体，可以低成本地制造上述的家庭用途或工业用途的油脂、和/或生物柴油燃料等。
另一方面，在表达表2所示转录因子的嵌合蛋白质的情形，植物体的油脂含量减少。在本发明所涉及的植物体中，对于油脂含量减少了的植物体，能够在利用植物中含有的木素纤维素来制备生物醇的方法中利用。即，在糖化木素纤维素的工序中，由于成为杂质的油脂成分低，能够制备糖化效率优异且杂质含量少的生物醇。
关于At5g22380
如上所述，表1所示的转录因子是在植物体中作为与阻遏物结构域的嵌合蛋白质表达时，显著提高种子中油脂含量的转录因子；表2所示的转录因子是在植物体中作为与阻遏物结构域的嵌合蛋白质表达时，显著减少种子中油脂含量的转录因子。因此，将表1所示的转录因子以没有阻遏物结构域的本来形式导入植物体时，显著地减少种子中油脂含量的可能性高。另外，将表2所示的转录因子以没有阻遏物结构域的本来形式导入植物体时，显著地提高种子中油脂含量的可能性高。在此处，各转录因子可以适用上述“表达载体构建工序”、“转化工序”及“其他工序、其他方法”条目下描述的技术。
特别地，表2所示转录因子中的At5g22380如在后述实施例中所证实的那样，显示了以下特征性的性质：当在植物体作为与阻遏物结构域的嵌合蛋白质表达时种子中的油脂含量显著地减少，当在植物体中作为没有阻遏物结构域的本来转录因子形式表达时使得种子中的油脂含量显著提高。即，通过在植物体中表达拟南芥转录因子At5g22380，能够提高种子中含有的油脂的生产性。
对于使转录因子At5g22380在植物体中表达，可以适用上述“表达载体构建工序”、“转化工序”及“其他工序、其他方法”条目下描述的技术。另外，作为为了提高种子中的油脂含量而表达的转录因子，不限于来自拟南芥的转录因子At5g22380，也可以是如上所述定义的同源转录因子。基于序列号156所示At5g22380的氨基酸序列或序列号155所示At5g22380基因的碱基序列，能够自作为检索对象的植物基因组信息检索同源转录因子。此时，作为同源转录因子，检索与序列号156所示的氨基酸序列具有例如70％以上、优选为80％以上、更优选为90％以上、最优选为95％以上的同源性的氨基酸序列。这里，同源性的值意味着使用安装了blast算法的计算机程序和存储了基因序列信息的数据库、以默认设定求得的值。
另外，在植物基因组信息不清楚的情况下，可以从对象植物提取基因组或构建对象植物的cDNA文库，通过分离与包含序列号155所示碱基序列的基因的至少一部分在严格条件下杂交的基因组区域或cDNA来鉴定同源基因。这里，所谓严格条件是与上述的各种条件同义。
实施例
以下，通过实施例更详细地说明本发明，但本发明的技术的范围不限于这些实施例。
[实施例1]
转录因子基因的扩增
自拟南芥的cDNA文库，使用以下所述的引物，通过PCR扩增转录因子At1g01010、At1g01250、At1g09540、At1g10200、At1g12260、At1g12890、At1g12980、At1g14510、At1g15360、At1g17520、At1g18330、At1g18570、At1g19490、At1g22640、At1g22985、At1g24260、At1g24590、At1g25470、At1g25580、At1g27360、At1g27370、At1g27730、At1g28160、At1g28520、At1g30210、At1g30810、At1g32770、At1g33760、At1g34190、At1g36060、At1g43160、At1g43640、At1g44830、At1g49120、At1g52150、At1g52880、At1g52890、At1g53230、At1g56010、At1g56650、At1g60240、At1g61110、At1g62700、At1g63040、At1g63910、At1g64380、At1g67260、At1g67780、At1g68800、At1g69120、At1g69490、At1g71030、At1g71450、At1g71692、At1g72360、At1g72570、At1g74840、At1g74930、At1g76580、At1g77200、At1g77450、At1g78080、At1g79180、At1g80580、At2g02070、At2g02450、At2g17040、At2g18060、At2g22200、At2g23290、At2g23760、At2g26060、At2g28550、At2g30420、At2g30470、At2g31230、At2g33480、At2g33710、At2g35700、At2g40220、At2g41710、At2g42400、At2g42830、At2g44840、At2g44940、At2g45650、At2g45680、At2g46310、At2g46590、At2g47520、At3g01530、At3g02150、At3g02310、At3g04060、At3g04070、At3g04420、At3g05760、At3g09600、At3g10490、At3g11280、At3g14230、At3g15500、At3g15510、At3g18550、At3g20770、At3g23220、At3g23230、At3g23240、At3g25890、At3g27920、At3g28910、At3g29035、At3g45150、At3g49850、At3g54320、At3g61910、At4g01060、At4g01550、At4g18390、At4g18450、At4g23750、At4g26150、At4g27950、At4g28140、At4g28530、At4g31060、At4g31270、At4g32800、At4g34410、At4g35580、At4g36160、At4g37750、At4g38620、At4g39780、At5g02460、At5g06100、At5g07310、At5g07580、At5g07680、At5g07690、At5g08070、At5g08790、At5g09330、At5g13180、At5g13330、At5g13910、At5g14000、At5g18270、At5g18560、At5g18830、At5g22290、At5g22380、At5g23260、At5g24520、At5g24590、At5g25190、At5g25390、At5g25810、At5g35550、At5g39610、At5g40330、At5g41030、At5g43270、At5g47220、At5g47230、At5g47390、At5g51190、At5g52020、At5g53290、At5g54230、At5g58900、At5g60970、At5g61600、At5g62380、At5g64530、At5g64750、At5g66300、At5g67000、At5g67300及At5g67580的除终止密码子之外的编码区DNA片段。另外，对于At5g22380，也同样地扩增包含终止密码子的区域的DNA片段。PCR条件是94℃1分钟、47℃2分钟、延伸反应74℃1分钟，进行25个循环。接下来，将PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳分离、回收。
表3
  AGI代码  正向引物   碱基序列   反向引物   碱基序列
  At1g01010  GATGGAGGATCAAGTTGGGTTTGGG   序列号159   ACCAACAAGAATGATCCAACTAATG   序列号160
  At1g01250  ATGTCACCACAGAGAATGAAGC   序列号161   CAGACACGCCATGAACTGATAC   序列号162
  At1g09540  GATGGGGAGACATTCTTGCTGTTACAAACA   序列号163   AAGGGACTGACCAAAAGAGACGGCCATTCT   序列号164
  At1g10200  GGGATGGCGTTCGCAGGAACAACCCAGAAATG   序列号165   AGCAGCGACGACTTTGTCCTTGGCG   序列号166
  At1g12260  GATGAATTCATTTTCCCACGTCCCTCCGGG   序列号167   CTTCCATAGATCAATCTGACAACTGGAAGA   序列号168
  At1g12890  ATGTTGAAATCAAGTAACAAGAG   序列号169   CATAAGAAACTGTGGAGCATC   序列号170
  At1g12980  AATGGAAAAAGCCTTGAGAAACTTC   序列号171   CCCCACGATCTTCGGCAAGTACA   序列号172
  At1g14510  ATGGAAGGAATTCAGCATCC   序列号173   GGCTTTCATTTTCTTGCTGG   序列号174
  At1g15360  ATGGTACAGACGAAGAAGTTCAG   序列号175   GTTTGTATTGAGAAGCTCCTCTATC   序列号176
  At1g17520  GATGGGAAATCAGAAGCTCAAATGGACGGC   序列号177   ATTCAAGTACATAATCTTTCCCTGACTACA   序列号178
  At1g18330  GATGGCCGCTGAGGATCGAAGTGAGGAACT   序列号179   GCATATACGTGCTCTTTGGCTTTTCTTTTC   序列号180
  At1g18570  GATGGTGCGGACACCGTGTTGCAAAGCTGA   序列号181   CCAAAATAGTTATCAATTTCGTCAAACAA   序列号182
  At1g19490  GATGGAGTTGGAGCCTATATCATCGAGTTG   序列号183   CCGACCTGCATCCGACATTGACGGCCATG   序列号184
  At1g22640  GATGGGAAGATCACCATGCTGCGAGAAAGC   序列号185   ATGAGTTCTAACATCAGAAACCCGACAATT   序列号186
  At1g22985  ATGAAACGAATTGTTCGAATTTCATTC   序列号187   AACAACTTCTTCAGAAGCACCAC   序列号188
  At1g24260  GATGGGAAGAGGGAGAGTAGAATTGAAGAG   序列号189   AATAGAGTTGGTGTCATAAGGTAACCAACC   序列号190
  At1g24590  ATGGAAGAAGCAATCATGAGAC   序列号191   ATAATCATCATGAAAGCAATACTG   序列号192
  At1g25470  ATGTCGGCTGTGTCTGAATCG   序列号193   AACCAAACCGAGAGGCGGTG   序列号194
  At1g25580  GATGGCTGGGCGATGATGGCTGATC   序列号195   CAGCAGCGTGGCAGTGTGTTGCC   序列号196
  At1g27360  GATGGACTGCAACATGGTATCTTCGTCCCA   序列号197   TTTTGGTACAACATCATATGAACAGAGTAG   序列号198
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  At5g61600   ATGGCAACTAAACAAGAAGCTTTAG   序列号503   AGTGACGGAGATAACGGAAAAG   序列号504
  At5g62380   GATGGAAAGTCTCGCACACATTCCTCCCGG   序列号505   CGTGTGTGTATTTTGAGCCCAAGAGTAGAA   序列号506
  At5g64530   GATGAATCTACCACCGGGATTTAGG   序列号507   CGGTAAGCTTACTTCGTCAAGATC   序列号508
  At5g64750   ATGTGTGTCTTAAAAGTGGCAAATC   序列号509   GGAGGATGGACTATTATTGTAG   序列号510
  At5gG6300   GATGATGAAGGTTGATCAAGATTATTCGTG   序列号511   GTCTTCTCCACTCATCAAAAATTGAGACGC   序列号512
  At5g67000   ATGGATAATTCAGAAAATGTTC   序列号513   TCTCCACCGCCGTTTAATTC   序列号514
  At5g67300   GATGGCTGATAGGATCAAAGGTCCATGGAG   序列号515   CTCGATTCTCCCAACTCCAATTTGACTCAT   序列号516
  At5g67580   GATGGGTGCACCAAAGCAGAAGTGGACACC   序列号517   CCAAGGATGATTACGGATCCTGAACTTCAA   序列号518
改良型转录因子的制作
为了在由上述DNA片段所编码的转录因子基因的3’末端添加阻遏物结构域序列，使用在CaMV35S启动子的下游具有SmaI位点和阻遏物结构域(氨基酸序列：GLDLDLELRLGFA(序列号519))序列的载体p35SSXG。为了连接转录因子基因序列和阻遏物结构域序列，将本载体用SmaI切割，分别插入编码上述转录因子的PCR扩增片段，制作了180种载体(p35SSXG(TFs))。另外，将载体表示为p35SSXG(TFs)，在该表示中，TFs部分记载的是转录因子的AGI代码。例如，具有以At3g04070特定的转录因子的载体为p35SSXG(At3g04070)。在以下的说明中对载体等的表示也同样地使用TFs这一表述。
改良型转录因子表达载体的构建
为了利用农杆菌向植物中进行基因导入，使用了双元载体中的pBCKH。本载体是在pBIG(Hygr)(Nucleic Acids Res.18，203(1990))的HindIII位点插入Gateway载体转换系统(Invitrogen)的盒而成的载体。为了在该载体中插入改良型转录因子基因序列，将本载体分别与180种p35SSXG(TFs)混合，使用GATEWAY LR clonase(Invitrogen)进行重组反应，制作了180种载体(pBCKH-p35SSXG(TFs))。
改良型转录因子基因表达载体向植物的导入
用于导入改良型转录因子的植物使用拟南芥(Arabidopsis thaliana，Columbia(Col-0))。基因导入法按照Transformation of Arabidopsisthaliana by vacuum infiltration(http://www.bch.msu.edu/pamgreen/protocol.htm)来进行。但是，感染时不进行减压处理，仅将其浸入农杆菌菌液中。具体来说，将改良型转录因子表达载体pBCKH-p35SSXG(TFs)分别用电穿孔法导入农杆菌Agrobacterium tumefaciens strainGV3101(C58C1Rifr)pMP90(Gmr)(koncz和Schell 1986)菌株中。将进行了导入的菌分别在1升含有抗生素(卡那霉素(Km)50μg/ml、庆大霉素(Gm)25μg/ml、利福平(Rif)50μg/ml)的YEP培养基中培养至OD600为1。接下来，从培养液回收菌体，悬浮在1升的感染用培养基(Infiltrationmedium，每1升含有2.2g MS盐、1×维生素B5、50g蔗糖、0.5g MES、0.044μM苄氨基嘌呤、400μl Silwet，pH为5.7)中。
将培育了14天的拟南芥在该溶液中浸渍1分钟使其感染，然后再继续栽培使其结果。将采摘的种子(T1种子)在50％ Bleach(漂白剂)、0.02％Triton X-100溶液中灭菌7分钟，然后用灭菌水漂洗3次，接种到灭菌的潮霉素选择培养基(4.3g/l MS盐、0.5％蔗糖、0.5g/l MES、pH 5.7、0.8％琼脂、30mg/l潮霉素、250mg/l万古霉素)上。从在上述潮霉素平板上培育的转化植物体(T1植物)中对各改良型转录基因分别筛选出5至10个品系，移植到装有蛭石混合土的直径50mm的盆中。将其在22℃、16小时光周期8小时暗周期、光强度约60～80μE/cm2的条件下栽培而获得种子(T2种子)。
T2种子的分析
对导入了180种TFs-SRDX的转化体的5至10个品系的T2种子进行油脂含量分析。油脂的定量分析使用MARAN-23(ResonanceInsturumentsLtd.，UK)H-NMR和分析软件RI-NMR 2.0版，对2～10mg的拟南芥种子进行测定。使用橄榄油作为油脂的标准物质来制作标准曲线，求出种子中的油脂含量(重量％)。
导入了各TFs-SRDX基因的转化体T2种子的油脂含量分析结果总结在表4～6中。
表4
表5
表6
没有导入基因的作为对照的WT(Col-0)33个体结果的种子中油脂含量是34.9±3.8％。另一方面，过量表达分别添加至180种转录因子的SRDX而获得的嵌合蛋白质的转化体T2种子的油脂含量平均值成为25.2％～41.3％。为了将得到的平均值与野生株的油脂含量平均值比较，进行t检验的结果是，油脂含量显著地(P＜0.05)增加的是15个品系(分析的转录因子的8.3％)表达嵌合蛋白质的T2种子。另一方面，油脂含量显著地(P＜0.05)降低的是70个品系(分析的转录因子的38.9％)表达嵌合蛋白质的T2种子。通过表达约47.2％的嵌合蛋白质，增加或降低了种子油脂含量的含量。换言之，提供给本次实验的转录因子中约半数以上即使使之为与阻遏物结构域的嵌合蛋白质而表达，基本上不影响种子中的油脂含量(例如，At5g40330、At4g23750及At5g18270等)。
通过本实施例，能够新鉴定到作为添加了阻遏物结构域的嵌合蛋白质表达从而具有提高了种子中油脂含量的功能的转录因子的At5g47230、At1g22985、At1g80580、At1g25470、At1g67260、At4g36160、At5g64750、At4g01550、At1g24260、At5g09330及At2g31230这11种转录因子。另外，通过本实施例，能够新鉴定到作为添加了阻遏物结构域的嵌合蛋白质表达从而具有减少了种子中油脂含量的功能的转录因子的At2g17040、At5g07690、At3g15500、At2g30420、At3g09600、At1g36060、At1g01250、At1g25580、At3g20770、At1g12890、At2g18060、At4g18390、At5g08070、At1g76580、At4g28140、At5g60970、At2g42830、At1g30210、At1g71450、At1g09540、At3g10490、At1g62700、At1g49120、At1g44830、At1g30810、At1g74840、At5g18830、At1g72360、At1g32770、At5g14000、At2g23290、At2g02450、At1g27360、At1g33760、At3g27920、At3g18550、At1g52880、At5g07310、At4g26150、At1g19490、At1g52150、At3g04060、At4g32800、At5g66300、At5g13180、At1g71692、At1g27730、At3g49850、At3g02150、At5g47220、At5g43270、At5g52020、At1g69490、At4g38620、At2g45650、At5g02460、At1g12260、At5g13330、At4g01060、At2g46590、At1g69120、At1g77450、At2g23760、At2g02070、At1g22640、At5g22380及At5g62380这68种转录因子。
如以上所述，由本实施例明确了，通过将特定的转录因子与阻遏物结构域融合并表达，使得显著地改变种子中的油脂含量成为可能。
At5g22380表达株的制作和油脂含量的分析
如以上所述，对于At5g22380，扩增了包含终止密码子的DNA片段。然后，与前述方法同样地在35S启动子下游连接该DNA片段，导入拟南芥。即，在本实验中制作了将没有添加SRDX的本来的At5g22380在恒定表达启动子的调控下表达的转化拟南芥。然后，以上述方法同样地测定该转化拟南芥T2种子的油脂含量。其结果是，表达At5g22380的个体的T2种子的油脂含量是37.6±1.8％。另一方面，同时栽培的野生株的油脂含量是36.3±0.4％。进行t检验，显著地增加了油脂含量(P＜0.05)。油脂含量最大的品系是40.0％的油脂含量，与野生株相比较增加了10.3％。
由该结果可见，在上述实验中强烈教导了，判定为通过与阻遏物结构域融合并表达从而能够显著地降低种子中油脂含量的转录因子，以没有阻遏物结构域的本来的形式表达(例如，在恒定的表达启动子的表达调控下)，能够显著提高种子中的油脂含量。另外，在上述实验中强烈教导了，判定为通过与阻遏物结构域融合并表达从而能够显著地提高种子中油脂含量的转录因子，以没有阻遏物结构域的本来的形式表达(例如，在恒定的表达启动子的表达调控下)，能够显著地减少种子中的油脂含量。
本说明书中引用的所有出版物、专利和专利申请均直接作为参考而引入本说明书中。

Claims (4)

1.提高十字花科植物个体的种子中含有的油脂的生产性的方法，所述方法是，在十字花科植物中表达由转录因子和功能性肽融合而成的嵌合蛋白质，其中所述转录因子是以下(a)的蛋白质，所述功能性肽是将转录因子转换成转录抑制因子的功能性肽，功能性肽的序列是序列号519所示的氨基酸序列：GLDLDLELRLGFA，
(a)由下表所示氨基酸序列组成的蛋白质，
[表]
AGI代码 碱基序列 氨基酸序列 At1g22985 序列号3 序列号4
。
2.权利要求1所述的方法，其特征在于，所述转录因子的转录促进活性被抑制。
3.权利要求1所述的方法，其特征在于，所述嵌合蛋白质具有转录抑制因子活性。
4.权利要求1所述的方法，其特征在于，所述植物是拟南芥。
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