CN102439047A - 用于从海藻提取物制备琼脂糖聚合物的方法 - Google Patents

用于从海藻提取物制备琼脂糖聚合物的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及用于从江蓠属和凝花菜属的种，更具体地从印度海域的Gracilaria dura和凝花菜制备琼脂糖的更方便和具有更高能源效率的方法，所述方法包括步骤：用碱预处理干燥的海藻，漂洗经预处理的海藻直至洗涤液显示7至9的pH，加入水，高压灭菌以获得提取物，离心热海藻提取物，随后用表面活性化学品处理澄清的热提取物以诱发琼脂糖的沉淀，离心团块以除去附着的液体，用水漂洗离心的团块以除去表面活性化学品，在最少量的水中制备琼脂糖团块的热溶胶，用异丙醇再沉淀琼脂糖以获得这样的产物，其在制备凝胶时具有可分散性并且显示，在DNA凝胶电泳研究中所述凝胶显示与通过更常规的琼脂糖制备方法从相同海藻提取物获得的凝胶以及与从商业基准(commercial benchmark)制备的凝胶等同的性能。

Description

用于从海藻提取物制备琼脂糖聚合物的方法
发明领域
本发明涉及从江蓠属(Gracilaria)和凝花菜属(Gelidiella)的种的提取物，更具体地从获自古吉拉特(Gujarat)和泰米尔纳德(TamilNadu)海岸的印度海域的海藻--Gracilaria dura和凝花菜(Gelidiellaacerosa)--的提取物分离琼脂糖的改进方法。
发明背景
可参考Selby & Wynne(R.L.Whistler(ed.)：Polysaccharidesand Their Derivatives，第2版，Academic Press，New York 1973，pp.29-48)，其中已阐明大多数商业琼脂通过热水提取产生。其他方法也是可能的，例如利用甘油、无水氨或其他溶剂进行提取，但利用热水的常规方法是最被推荐的(www.marinalg.org)。琼脂提取法可根据处理的海藻种类而变化。它们通常经历三个阶段：(1)提取，(2)纯化，(3)脱水，如下文中描述的：首先，用水仔细地洗涤海藻以除去海盐和杂质例如沙。如果海藻已经历碱处理，那么在压力下或在开放式水箱中利用热水来进行提取。后一种方法主要用于江蓠属海藻以降低所得琼脂的硫酸酯或盐(sulfate)的含量。在热条件下将由99％的水和1％的琼脂组成的提取汁(extraction juice)过滤，然后将其冷却至室温。在机械压力下或通过冷冻-解冻使所得的凝胶脱水。在压力脱水中，施加49-98N/cm2的压力以挤压凝胶通过居间的过滤器。水通过过滤器，而琼脂分子作为滤饼得到保留。在-18℃下进行凝胶冷冻。在该温度下，琼脂分子从冰网络(ice network)中选择性排出并且形成条。解冻步骤使冰解冻并且选择性回收琼脂条。所采取的这两种脱水操作各自除去约70％的初始含水量。然后通过用热空气干燥除去部分残留水分。碾磨干琼脂片以制备具有不同筛目大小的粉末形式的终产物。
可参考Lebbar Thami，Lebbar Rachid和Riad Abdelwahab的专利(美国专利5,496,936)，其中描述了琼脂-琼脂的加工，已在提取步骤中从海藻提取了琼脂-琼脂，随后在脱水步骤中将其脱水以形成琼脂-琼脂凝胶或粉末，其中通过冷冻-解冻或机械挤压或利用单螺杆或双螺杆挤出机来进行脱水。该方法受困于使用冷冻-解冻的耗能操作或需要复杂硬件的机械挤压的繁琐操作的缺点。
可参见D.Du，Z.Zhuang和C.Zhuang的专利(CN1587284-A，2005年3月2日；CNl296390-C，2007年1月24日)，其中按照下述来生产琼脂：“生产方法包括浸渍、中和、漂白和明胶提取。将材料在高温和加压条件下在低浓度碱溶液中浸渍，随后进行过滤，水洗，用酸调整pH，用次氯酸钠漂白，添加助剂(assistant)，煮沸以提取明胶，压滤以脱水和干燥，获得琼脂”。该方法的不利方面在于其使用需要复杂硬件的“压滤来脱水和干燥琼脂”。
可参见Sigma产品目录(2006-2007；第269-270页)，在该目录中其阐明“琼脂糖是从琼脂或具有琼脂的海藻分离的经纯化的直链半乳聚糖水胶体(hydrocolloid)。琼脂形成对于生物聚合物的扩散和电动运动几乎是理想的凝胶基质。因此，其可用于电泳、免疫电泳和免疫扩散”。其中还提及：不同等级的琼脂糖具有在0.10-0.35％范围内的硫酸酯/盐含量，其适合应用于分子生物学、蛋白质电泳和细胞培养。
可参考几个报导，在所述报导中已阐明，琼脂糖是从琼脂分离的或直接从具有琼脂的海藻例如红藻回收的经纯化的直链半乳聚糖水胶体。从其提取琼脂糖的属包括石花菜属(Gelidium)、江蓠属、刺盾藻属(Acanthopeltis)、仙菜属(Ceramium)、鸡毛菜属(Pterocladia)和凝菜属(Campylaephora)。Grabar(1957)已报导，通过在水中煮沸从红藻提取琼脂，然后通过过滤除去颗粒，胶凝化和冷冻-解冻胶体以除去水溶性杂质并且用乙醇沉淀来分离琼脂(Methods Biochem.Anal.7(1957)1-38)。所得的产物是多糖的混合物，其为1，4-连接的3，6-酐-α-L-半乳糖和1，3-连接的β-D-半乳糖的交替共聚物。重复的二糖称为琼脂二糖(Araki，Proceedings 5th International Seaweed Symposium，Halifax，1965，pp.3-17)。当然，这是理想的结构，因为即使纯化的琼脂糖也包含可觉察量的下列取代基(substituent)：硫酸盐/酯、丙酮酸盐/酯和甲氧基。硫酸通常被酯化至β-D-吡喃半乳糖的C-4以及3，6-酐-α-L-半乳糖的C-2和C-6上的羟基。丙酮酸连接至β-D-吡喃半乳糖的一些残基的C-4和C-6两者。所得的化合物被Duckworth和Yaphe(Carbohydr.Res.16，1971，189-197)称为4，6-0-羧基亚乙基。
可参考Craigie和Leigh的″Isolation of partially purifiedagarose with a quaternary base″(参见由J A Hellebust和J S Craigie编著的Handbook of Phycological Methods，Cambridge UniversityPress，Cambridge，1978；pp.126)，其中将250mg粗制琼脂溶解在100ml煮沸的蒸馏水中。加入25mgλ-角叉菜胶，在80-100℃溶液中加入10ml 2％溴棕三甲铵(Cetavlon)(西吡氯铵)。利用硅藻土(Celite)过滤热提取物，将其在膜(0.8微米)上加压过滤，然后冷冻和解冻产物以产生部分纯化的琼脂糖，但该方法的缺点是，通过非常耗能的冷冻-解冻操作从热提取物分离琼脂糖聚合物。
可参考美国国家生物信息中心(NCBI)的网站www.ncbi.nlm.nih.gov，其中用于本发明的印度海域的海藻Gracilariadura的18S核糖体RNA基因具有基因库登录号DQ399795。
可参考Siddhanta，A.K.等(PCT 2005/118830；US 20050267296A1)，其中覆盖了利用不同方法制备琼脂和琼脂糖的现有技术。该发明人进一步公开了用于从Gracilaria dura制备具有高凝胶强度和低胶凝温度的琼脂糖的改进方法，所述方法包括步骤：用碱预处理干燥的海藻；漂洗预处理的海藻直至洗涤液显示在7至8的范围内的pH；加入水并且高压灭菌以获得提取物；用炭和硅藻土处理热提取物以获得热提取物；在硅藻土床上真空过滤热提取物；将滤液冷冻成团块并且使团块解冻；通过在高压灭菌器中加热将团块再溶解在水中，重复冷冻-解冻循环，对产物施压以除去解冻的液体，随后挤压以尽可能排除残留液体，从而获得琼脂糖和其琼脂糖，该方法的缺点是将热提取物在-15℃以下冷却15小时，这是非常耗时和耗能的。此外，该方法中重复的冷冻-解冻循环使得其更加成本敏感。
还可参考Meena等人的论文(Carbohydrate Polymers 69：179-188，2007)，其中已表征了相同琼脂糖并且将其性能与商购可得的琼脂糖的性能进行了比较。
可参考Kiyoshi Arai等人(JP 7017，130，1970年1月13日；Chemical Abstr.74，32889r，1971)的“Purification of agar”，其中报导，用二甲基甲酰胺(DMF)提取粗制琼脂以分离高纯度的琼脂糖。在搅拌的条件下将10g琼脂与500ml DMF混合，在热水中浸渍10小时，离心，将上清液倒入2升丙酮，将沉淀通过玻璃滤器，用500ml丙酮洗涤，将其溶解在热水中并且过滤以产生琼脂糖粉末。
可参考R.B.Provonchee(US 4,990,611，1991年2月)的“Agarosepurification method using glycol”，其中通过将琼脂或琼脂糖溶解在低级亚烷基二醇中来从琼脂或不纯的琼脂糖回收纯化的琼脂糖，其中在升高的温度下将充足的琼脂或琼脂糖溶解在二醇中以形成包含至少约0.1wt％琼脂或琼脂糖的二醇溶液，冷却含有琼脂或琼脂糖的二醇溶液以诱发纯化的琼脂糖产物的沉淀，然后回收沉淀的琼脂糖产物。
还参考Kirkpatrick等人的美国专利4,983,268，该专利描述适合于快速电泳的纯化的琼脂糖的制备，所述琼脂糖的特征在于硫酸酯/盐含量低于0.2wt％和凝胶强度至少1200g/cm2(1％)。如下纯化琼脂糖：将琼脂糖或碱修饰的琼脂糖溶解在于pH6.0至8.0下缓冲的并且包含不超过2.0nM的盐如氯化物的水介质中，然后如下通过与低级烷醇接触来沉淀琼脂糖：“再次滤出琼脂糖，随后将其重悬浮于水中至1000g的总重量，通过煮沸溶解，从而形成2％的溶液。将其冷却至74℃，然后与两升共沸异丙醇(IPA)(按重量计算87.7％的IPA)混合”。
也可参考Alfred Polson的著作(Chemical Abstract 65：p5865a；1965)，其中已描述了用于琼脂糖制备的琼脂糖和琼脂胶的混合物的分级分离。用分子量为300的聚乙二醇的水溶液处理混合物，产生富集琼脂糖的沉淀。在该方法中，将80g Ion agar No.2溶解在2升水中。向热溶液(80℃)中加入2升40％(wt/vol)的分子量为6000的聚乙二醇，随后利用110目的尼龙布过滤分离所得的沉淀。随后将沉淀在40℃下洗涤2-3分钟，在15℃下悬浮于水中，在5升水中搅拌过夜，收集在尼龙过滤网中，用丙酮洗涤，然后在温暖空气中干燥。
可参考Prasad等人的论文(Int.J.Biol.Macromol.35，135-144，2005)，其中报导，离子型和非离子型表面活性剂以不同的方式改变琼脂溶胶和凝胶的流变性质和热力学性质。所述论文还公开了其中使用表面活性剂的其他现有技术。
除了使用大量的多种有机溶剂外，从海藻提取物分离琼脂的耗能问题仍然存在于上述现有技术中。然而，上述论文和任何其他现有技术都没有公开，使用表面活性剂在环境条件下将琼脂糖从含水海藻提取物中沉淀出来而不使用任何有机溶剂，这是本发明的主要目的。
根据现有技术很明显的是，通过冷冻-解冻法以及在其他情况下通过压力脱水收缩从含水海藻提取物分离琼脂/琼脂糖。随后通过溶剂沉淀或层析分离纯化产物。因此，从提取物分离产物所遵照的方法是高耗能的或需要复杂的硬件，因此期望发现从提取物分离产物的改进的方法。
本发明的目的
本发明的主要目的是设计从稀释的含水海藻提取物分离琼脂糖的改进的方法，所述方法省却了对冷冻-解冻或机械挤压提取物或向提取物中加入大量溶剂的需要。
本发明的另一个目的是使用非离子型表面活性剂作为促凝剂诱发琼脂糖从含水提取物凝结。
本发明的另一个目的是证实，对于通常具有≤0.3％(w/w)的硫酸酯或盐(sulphate)的琼脂糖，所述凝结方法是特别有效的。
本发明的另一个目的是将来自Gracilaria dura和凝花菜的提取物用于上述目的。
本发明的另一个目的是用碱处理海藻以降低琼脂/琼脂糖的硫酸酯或盐含量并且除了如现有技术中公开的增加其凝胶强度外，还使其顺从通过本发明的方法进行的凝结。
另一个目的是在添加表面活性剂之前离心热提取物以除去所有悬浮物。
本发明的另一个目的是仅通过用水洗涤产物来除去凝结的琼脂糖中的残留表面活性剂。
另一个目的是制备易分散的琼脂糖。
另一个目的是通过下列来获得这样的易分散性：将产物再溶解在热水中至多达7％(w/v)的浓度，然后用异丙醇处理溶液以利用最少的溶剂获得期望的产物。
另一个目的是循环和再使用所述溶剂和所述表面活性剂。
另一个目的是证实，本发明的琼脂糖与通过现有技术的方法获得的琼脂糖相似。
发明概述
本发明涉及从由江蓠属和凝花菜属的种制备的稀释的海藻提取物获得琼脂糖的改进的方法。海藻(i)用碱进行处理以降低硫酸酯或盐的含量，(ii)用水进行洗涤以除去碱，随后(iii)进行水煮以制备稀释的提取物。随后材料(iv)进行均质化，然后(v)在热条件下进行离心以获得不含不溶性杂质的澄清海藻提取物。随后热提取物(vi)在剧烈搅拌的条件下用水溶性非离子型表面活性剂进行处理，然后(vii)让内容物静置以冷却至室温，之后琼脂糖沉淀出来，随后所述琼脂糖(viii)通过离心进行分离，然后(ix)用水洗涤以除去附着的表面活性剂。随后，(x)在热条件下将湿的琼脂糖团块再分散于最小体积的水中，(xi)用等体积的异丙醇进行处理以使琼脂糖团块脱水，其在(xii)过滤和干燥后产生适合用于DNA凝胶电泳的精制的且易分散的产物。
因此，本发明提供了使用表面活性剂从海藻的含水提取物纯化琼脂糖的改进的方法，所述方法包括步骤：
(a)以10000-14000rpm离心经碱处理的热海藻提取物(70-80℃)5-15分钟；
(b)在连续搅拌的条件下将步骤(a)中获得的热海藻提取物与2-5％的表面活性剂在60-100℃的温度下混合；
(c)使步骤(b)中获得的内容物在25-35℃的温度下静置1-10小时以沉淀出琼脂糖的固体团块；
(d)倾倒上清液，然后用水洗涤所述团块以除去固体中的残留表面活性剂；
(e)将步骤(d)中获得的湿的团块以7-10％w/w琼脂糖产物的范围溶解在最少量的水中，用最少量的异丙醇处理以沉淀出琼脂糖，其中琼脂糖溶胶对异丙醇的比率为1∶0.5至1∶1.5w/w；
(f)分离固体产物并且在适当的干燥器中干燥以获得具有200至300的网目大小的琼脂糖粉末。
附图概述
图1.1显示PCR扩增的产物在Gracilaria dura琼脂糖凝胶样品上的DNA凝胶电泳。本发明的琼脂糖凝胶样品由图1.1a显示，而先前(PCT2005/118830；US 2005/0267296 A1)发明的琼脂糖凝胶样品显示于图1.1b中。图a和b由相同的泳道组成，这些泳道为：
泳道1：1kb DNA梯
泳道2，3：1.2kb的PCR产物
泳道4，5：1.4kb的PCR产物
图1.2涉及从图1.1的凝胶上洗脱的DNA在Gracilaria dura琼脂糖凝胶样品上的凝胶电泳。本发明的琼脂糖凝胶样品由图1.2a显示，而先前(PCT 2005/118830；US 2005/0267296 A1)发明的琼脂糖凝胶样品由图1.2b显示。图a和b由相似的泳道组成，这些泳道是：
泳道1：100bp DNA梯
泳道2：来自凝胶(1.1b)的洗脱的1.2kb产物
泳道3：来自凝胶(1.1b)的洗脱的1.4kb产物
泳道4：来自凝胶(1.1a)的洗脱的1.2kb产物
泳道5：来自凝胶(1.1a)的洗脱的1.4kb产物
图1.3表示使用洗脱的产物作为模板(获自图1.1)产生的PCR扩增的产物在Gracilaria dura琼脂糖凝胶样品上的凝胶电泳。本发明的琼脂糖凝胶样品示于图1.3a，而先前(PCT 2005/118830；US 2005/0267296A1)发明的琼脂糖凝胶样品由图1.3b显示。图a和b由相似的泳道组成，这些泳道是：
泳道1：1kb DNA梯
泳道2：-ve对照
泳道3，4：来自凝胶(1.1b)和(1.1a)洗脱的产物的PCR产物1.0kb
泳道5：-ve产物
泳道6，7：来自凝胶(1.1b)和(1.1a)洗脱的产物的PCR产物1.4kb
发明详述
本发明涉及从江蓠属和凝花菜属的种，更具体地Gracilaria dura和凝花菜制备具有高和低胶凝温度的高凝胶强度的琼脂糖的新型、直接且经济有效的方法，所述方法包括步骤：(i)用碱预处理干燥的海藻以降低硫酸酯或盐的含量，(ii)用水洗涤以除去碱，随后(iii)进行水煮以制备稀释的提取物。随后材料(iv)进行均质化，然后(v)在热条件下离心以获得不含不溶性杂质的澄清海藻提取物。随后热提取物(vi)在剧烈搅拌的条件下用水溶性非离子型表面活性剂处理，然后(vii)让内容物静置以冷却至室温，之后琼脂糖沉淀出来，随后所述琼脂糖(viii)通过离心进行分离，然后(ix)用水洗涤以除去附着的表面活性剂。随后，(x)在热条件下将湿的琼脂糖团块再分散于最小体积的水中，(xi)用等体积的异丙醇处理以使琼脂糖团块脱水，其在(xii)过滤和干燥后产生适合用于DNA凝胶电泳的精制的且易分散的产物。此外，所获得的琼脂糖的质量能够在塑料容器中贮存至少达到1年而无任何变质。
本发明描述了“用于从海藻提取物制备琼脂糖聚合物的改进的方法”，利用新型方法分别从Gracilaria dura和凝花菜产生具有高端应用、高凝胶强度，具有低和高胶凝温度的琼脂糖聚合物，所述新型方法包括：(i)在25-95℃的温度下在1-15％的碱浓度范围内用含水的碱分别预处理35份(对于江蓠属的种)和20份(对于凝花菜属的种)(v/w)，进行0.5-5.0小时的时间。
(ii)用水充分漂洗经预处理的海藻以除去过量的碱直至洗涤液显示7至9的pH，
(iii)对于每一份原始海藻分别加入约35份(对于江蓠属的种)和20份(对于凝花菜属的种)的水(v/w)，并且在100-125℃的范围内高压灭菌，进行1.0-2.5小时的持续时间，以获得提取物，
(iv)均质化热提取物，然后离心，
(v)以10,000至14,000rpm离心热提取物5至15分钟，
(vi)在连续搅拌下在60至100℃的温度下用约2-5％的表面活性剂处理提取物，
(vii)在1至10小时的时间内，在环境温度(25-35℃)下保持提取物与表面活性剂，以使固体团块从海藻提取物中凝结，
(viii)通过离心将琼脂糖的固体团块与液体分离，
(ix)通过简单的洗涤或通过使用透析除去残留表面活性剂，直至终洗涤液显示与水相同的表面张力，
(x)任选地，将湿的团块以7至10％(w/w)的范围再溶解于最少量的水中，
(xi)对于100g琼脂糖分散系，在50至150g IPA范围内的最少量的异丙醇中使其脱水，和
(xii)过滤、干燥并且碾磨以获得适合于DNA凝胶电泳的易分散的琼脂糖产物。
在Nikkansui型凝胶测试仪上于20℃下以1.0％和1.5％琼脂糖凝胶测量本发明的琼脂糖产物的凝胶强度。在STAR-Toledo TGA机器，Switzerland上进行热重分析法(TGA)。通过在奥斯特瓦尔德粘度计(参考C.Rochas和M.Lahaye.Carbohydrate Polymers 1989，10：289)上测量固有粘度(intrinsic viscosity)来进行分子量测定。按照Craigie等人描述的方法(Hand Book of Phycological Methods，1978(Eds.Hellebust.J A and Craigie J S，Cambridge University Press)；pp.127)测量胶凝温度和熔化温度，通过在800℃下焚烧固体6小时来测量灰分含量，通过用浓硝酸处理灰分，蒸发至干燥，将残留物溶解在水中，过滤，然后针对硫进行电感耦合等离子体-光发射光谱(inductivelycoupled plasma-optical emission spectroscopy，ICP-OES)分析来估计硫酸酯或盐的含量。
在本发明的一个实施方案中，可从江蓠属和凝花菜属的种，更具体地从获自古吉拉特和泰米尔纳德海岸的印度海域的Gracilaria dura和凝花菜获得琼脂糖。
在本发明的另一个实施方案中，如现有技术中所实施的，进行步骤i-iv。
在本发明的另一个实施方案中，可在60-90℃，更具体地70-80℃的温度下向热提取物中加入表面活性剂，然后以10,000至14,000rpm离心热提取物5至15分钟。
在本发明的另一个实施方案中，可在连续搅拌的条件下，在60-100℃的温度下以2％至5％(w/w)，更具体地3％(w/w)的浓度向热提取物中加入表面活性剂。
在本发明的另一个实施方案中，可通过在环境温度(25-35℃)下静置含有表面活性剂的提取物1-10小时，更具体地3-4小时，凝结琼脂糖聚合物。
在本发明的另一个实施方案中，可通过在环境温度下离心来分离沉淀后产生的粗制琼脂糖。
在本发明的另一个实施方案中，粗制琼脂糖中的残留表面活性剂可通过简单的水洗涤或通过将再分散的粗制琼脂糖经历透析来除去。
在本发明的另一个实施方案中，将湿的琼脂糖团块再分散于热水(120℃)中同时将琼脂糖的浓度维持在7％至10％的范围内，更具体地7％。
在本发明的另一个实施方案中，用等体积的异丙醇处理浓缩的琼脂糖团块以使琼脂糖团块脱水并且使其易于分散。
在本发明的另一个实施方案中，在适当的干燥器中进行固体产物的分离和干燥以获得具有200至300的网目大小的琼脂糖粉末。
在本发明的另一个实施方案中，通过已知的方法制备提取物，所述方法包括步骤：在25-95℃下用20-35份(w/w)1-15％(w/w)氢氧化钠水溶液处理干燥的海藻0.5-5小时，然后洗涤以将pH调整至7-9的范围内，随后向经洗涤的海藻中加入去矿质水，并且在100-125℃的温度下高压灭菌1-2.5小时。
在本发明的另一个实施方案中，所使用的表面活性剂是水溶性非离子型表面活性剂，更具体地Triton X-100和Synperonic 91/6。
在本发明的另一个实施方案中，其中洗涤操作的次数可以为5至20次，更具体地6至10次操作，并且对于每一次洗涤操作，洗涤的持续时间可在10-30分钟的范围内。
在本发明的另一个实施方案中，当硫酸酯或盐的含量和灰分的含量相似或分别低于0.3％和1.0％时，可使用其他多糖，并且这可顺从该方法。
在本发明的另一个实施方案中，对于江蓠属和凝花菜属海藻，热提取物中琼脂糖的硫酸酯或盐的含量分别可以为0.20％至0.25％。
在本发明的另一个实施方案中，仅当琼脂糖中硫酸酯或盐的水平低于1％(w/w)，优选低于0.5％(w/w)以及更优选低于0.25％(w/w)时，所使用的表面活性剂才诱发絮凝。
在本发明的另一个实施方案中，可通过化学或生物化学方法将多糖脱硫酸化以使其具有约0.3％或低于0.3％的硫酸化内容物。
在本发明的另一个实施方案中，可从海藻提取物分离适合用于DNA的琼脂糖凝胶电泳的琼脂糖聚合物，其在更低的浓度例如≤0.8％的浓度下展示令人满意的分辨性能。
在本发明的另一个实施方案中，在从琼脂糖凝胶回收后，DNA的质量和数量相似。
在本发明的另一个实施方案中，DNA片段的分离在从本发明中获得的琼脂糖制备的琼脂糖凝胶中是良好的。
在本发明的其他实施方案中，所获得的琼脂糖的质量能够在塑料容器中贮存至少达到1年而无任何变质。
以举例说明的方式提供下列实施例，因此，所述实施例不应当被解释为限制本发明的范围。本发明中的实施例1-6遵从现有技术中提及的冷冻-解冻方法。但本发明的主要目的在于实施例7至11，其不使用冷冻-解冻方法。
实施例1
将Gracilaria dura(25g)海藻在35℃下于自来水中浸渍1小时，然后在氢氧化钠(NaOH)不存在的情况下在85℃下浸渍2小时。随后将浸渍的海藻置于蒸馏水(海藻∶水＝1∶35w/w)中并且于120℃下进行高压灭菌1.5小时。将提取物均质化，离心以获得不含不溶于水的杂质的澄清提取物。将热提取物倾倒在不锈钢托盘中，并且使其冷却至室温。将装有胶凝的提取物的托盘在冰箱中于-20℃下保持20小时。随后在室温下解冻冷冻的凝胶。挤压解冻的凝胶以除去附着的液体，之后其用去矿质水进行洗涤，最后进行挤压以除去附着的水。风干天然琼脂，然后在烘箱中于50℃干燥2小时。
得率：6.5g(26.0％)，相对于完全干燥的海藻；凝胶强度(1％的凝胶)：在20℃下，250g cm-2；胶凝温度：34.0℃；灰分：≤8.06％；硫酸酯或盐：≤3.26％。
实施例2
将凝花菜(25g)海藻在35℃下于自来水中浸渍1小时，然后在NaOH不存在的情况下在85℃下浸渍2小时。随后将浸渍的海藻置于蒸馏水(海藻∶水＝1∶35w/w)中并且于120℃下进行高压灭菌1.5小时。将提取物均质化，离心以获得不含不溶于水的杂质的澄清提取物。将热提取物倾倒在不锈钢托盘中，并且使其冷却至室温。将装有胶凝的提取物的托盘在冰箱中于-20℃下保持20小时。随后在室温下解冻冷冻的凝胶。挤压解冻的凝胶以除去附着的液体，之后其用去矿质水进行洗涤，最后进行挤压以除去附着的水。风干天然琼脂，然后在烘箱中于50℃干燥2小时。
得率：5.5g(22.0％)，相对于完全干燥的海藻；凝胶强度(1.5％的凝胶)：在20℃下，300g cm-2；胶凝温度：41.0℃；灰分：≤4.56％；硫酸酯或盐：≤2.60％。
实施例3
将可食江蓠(Gracilaria edulis)(25g)海藻在35℃下于自来水中浸渍1小时，然后在NaOH不存在的情况下在85℃下浸渍2小时。随后将浸渍的海藻置于蒸馏水(海藻∶水＝1∶35w/w)中并且于120℃下进行高压灭菌1.5小时。将提取物均质化，离心以获得不含不溶于水的杂质的澄清提取物。将热提取物倾倒在不锈钢托盘中，并且使其冷却至室温。将装有胶凝的提取物的托盘在冰箱中于-20℃下保持20小时。随后在室温下解冻冷冻的凝胶。挤压解冻的凝胶以除去附着的液体，之后其用去矿质水进行洗涤，最后进行挤压以除去附着的水。风干天然琼脂，然后在烘箱中于50℃干燥2小时。
得率：5.0g(20.0％)，相对于完全干燥的海藻；凝胶强度(1.5％的凝胶)：在20℃下，≤100g cm-2；胶凝温度：40.0℃；灰分：≤6.56％；硫酸酯或盐：≤5.60％。
实施例4
在分开的实验中将实施例1和2的Gracilaria dura和凝花菜(各25g)海藻在35℃下于自来水中浸渍1小时；弃去洗涤液，用2％NaOH在85℃下处理所述湿海藻2小时，然后用水洗涤海藻以除去过量的碱。随后将经预处理的海藻置于蒸馏水(海藻∶水＝1∶35或1∶20w/w)中并且于120℃下进行高压灭菌1.5小时。将Gracilaria dura和凝花菜的提取物分别均质化，离心以获得不含不溶于水的杂质的澄清提取物，其分别具有≤1.87％和≤1.76％的硫酸酯或盐含量。用两种非离子型[Triton X-100(S.D.Fine Chemicals，India)；Synperonic 91/6(ICIUniqema，India)]表面活性剂(3％w/w，相对于提取物)处理这些提取物。在剧烈搅拌的条件下，以不搀水的形式(neat form)逐渐加入表面活性剂。在完成表面活性剂的添加后，中断搅拌并且让内容物在室温下静置5小时。在任何情况下未观察到沉淀。
Gracilaria dura的琼脂糖：得率：18％；凝胶强度：530g cm-2；硫酸酯或盐：≤1.87％。
凝花菜的琼脂糖：得率：14％；凝胶强度：850g cm-2；硫酸酯或盐：≤1.76％。
实施例5
在分开的实验中将实施例1和2的Gracilaria dura和凝花菜海藻在35℃下于自来水中浸渍1小时；弃去洗涤液，用3.5％NaOH在85℃下处理所述湿海藻2小时，然后用水洗涤海藻以除去过量的碱。随后将用3.5％NaOH预处理的海藻置于蒸馏水(海藻∶水＝1∶35或1∶20w/w)中并且于120℃下进行高压灭菌1.5小时。将Gracilaria dura和凝花菜的提取物分别均质化，离心以获得不含不溶于水的杂质的澄清提取物，其分别具有≤1.22％和≤1.47％的硫酸酯或盐含量。用两种非离子型[Triton X-100(S.D.Fine Chemicals，India)；Synperonic 91/6(ICIUniqema，India)]表面活性剂(3％w/w，相对于提取物)处理这些提取物。在剧烈搅拌的条件下，以不搀水的形式逐渐加入表面活性剂。在完成表面活性剂的添加后，中断搅拌并且让内容物在室温下静置5小时。在任何情况下未观察到沉淀。
Gracilaria dura的琼脂糖：得率：16％；凝胶强度：820g cm-2；硫酸酯或盐：≤1.02％。
凝花菜的琼脂糖：得率：14％；凝胶强度：980g cm-2；硫酸酯或盐：≤1.47％。
实施例6
在分开的实验中将实施例1和2的Gracilaria dura和凝花菜海藻在35℃下于自来水中浸渍1小时；弃去洗涤液，用4％NaOH在85℃下处理所述湿海藻2小时，然后用水洗涤海藻以除去过量的碱。随后将用4％NaOH预处理的海藻置于蒸馏水(海藻∶水＝1∶35或1∶20w/w)中并且于120℃下进行高压灭菌1.5小时。将Gracilaria dura和凝花菜的提取物分别均质化，离心以获得不含不溶于水的杂质的澄清提取物，其分别具有≤0.72％和≤1.38％的硫酸酯或盐含量。用两种非离子型[TritonX-100(S.D.Fine Chemicals，India)；Synperonic 91/6(ICI Uniqema，India)]表面活性剂(3％w/w，相对于提取物)处理这些提取物。在剧烈搅拌的条件下，以不搀水的形式逐渐加入表面活性剂。在完成表面活性剂的添加后，中断搅拌并且让内容物在室温下静置5小时。在使用非离子型表面活性剂的情况下，在从Gracilaria dura制备的、包含≤0.82％的硫酸酯或盐的提取物中观察到沉淀。对于上述任何表面活性剂，在从凝花菜制备的、包含≤1.38％的硫酸酯或盐的提取物中未观察到沉淀。
Gracilaria dura的琼脂糖：得率：15％；凝胶强度：1300g Gm-2；硫酸酯或盐：≤0.82％。
凝花菜的琼脂糖：得率：13％；凝胶强度：1020g cm-2；硫酸酯或盐：≤1.38％。
表1：用阳离子型、阴离子型和非离子型表面活性剂处理经碱处理的海藻提取物
Figure BDA0000100294450000151
实施例6得出结论：如果硫酸酯或盐含量为≤0.82％的多糖，那么非离子型表面活性剂在从热海藻提取物凝结琼脂糖中是有用的，从而本发明的方法可理想地用于制备低硫酸化的琼脂或琼脂糖。
实施例7
在分开的实验中将实施例1和2的Gracilaria dura和凝花菜海藻在35℃下于自来水中浸渍1小时；弃去洗涤液，用5％NaOH在85℃下处理所述湿海藻2小时，然后用水洗涤海藻以除去过量的碱。随后将用5％NaOH预处理的海藻置于蒸馏水(海藻∶水＝1∶35w/w)中并且于120℃下进行高压灭菌1.5小时。将提取物分别均质化，离心以获得不含不溶于水的杂质的澄清提取物，其分别具有≤0.50％和≤1.08％的硫酸酯或盐含量。用两种非离子型[Triton X-100(S.D.Fine Chemicals，India)；Synperonic 91/6(ICI Uniqema，India)]表面活性剂(3％w/w，相对于提取物)处理这些提取物。在剧烈搅拌的条件下，以不搀水的形式逐渐加入表面活性剂。在完成表面活性剂的添加后，中断搅拌并且让内容物在室温下静置5小时。在从Gracilaria dura制备的、包含0.5％的硫酸酯或盐的提取物中观察到沉淀。在从凝花菜制备的、包含1.08％的硫酸酯或盐的提取物中未观察到沉淀。
Gracilaria dura的琼脂糖：-得率：14％；凝胶强度：1600g cm-2；硫酸酯或盐：≤0.50％。
凝花菜的琼脂糖：-得率：13％；凝胶强度：1140g cm-2；硫酸酯或盐：≤1.08％。
表2：用阳离子型、阴离子型和非离子型表面活性剂处理经碱处理的海藻提取物
Figure BDA0000100294450000171
实施例7得出结论：如果硫酸酯或盐的含量≤0.50％，那么非离子型表面活性剂在从热海藻提取物完全凝结琼脂中是有用的。
实施例8
在分开的实验中将实施例1和2的Gracilaria dura和凝花菜海藻在35℃下于自来水中浸渍1小时；弃去洗涤液，用7％NaOH在85℃下处理所述湿海藻2小时，然后用水洗涤海藻以除去过量的碱。随后将用5％NaOH预处理的海藻置于蒸馏水(海藻∶水＝1∶35w/w)中并且于120℃下进行高压灭菌1.5小时。将提取物分别均质化，离心以获得不含不溶于水的杂质的澄清提取物，其分别具有≤0.50％和≤1.08％的硫酸酯或盐含量。用两种非离子型[Triton X-100(S.D.Fine Chemicals，India)；Synperonic 91/6(ICI Uniqema，India)]表面活性剂(3％w/w，相对于提取物)处理这些提取物。在剧烈搅拌的条件下，以不搀水的形式逐渐加入表面活性剂。在完成表面活性剂的添加后，中断搅拌并且让内容物在室温下静置5小时。在从Gracilaria dura制备的、包含0.5％的硫酸酯或盐的提取物中观察到沉淀。在从凝花菜制备的、包含0.80％的硫酸酯或盐的提取物中未观察到沉淀。
Gracilaria dura的琼脂糖：-得率：13％；凝胶强度：1800g cm-2；硫酸酯或盐：≤0.38％。
凝花菜的琼脂糖：-得率：12％；凝胶强度：1550g cm-2；硫酸酯或盐：≤0.80％。
表3：用阳离子型、阴离子型和非离子型表面活性剂处理经碱处理的海藻提取物
Figure BDA0000100294450000181
Figure BDA0000100294450000191
实施例8还得出结论：如果硫酸酯或盐含量≤0.80％，那么非离子型表面活性剂在从获自凝花菜的热海藻提取物完全凝结琼脂糖中是有用的。
实施例9
将如实施例1中的Gracilaria dura(各25g)海藻在35℃下于自来水中浸渍1小时，随后弃去水，用10％NaOH在85℃下处理所述湿海藻2小时，然后用水洗涤海藻以除去过量的碱。随后将经预处理的海藻置于蒸馏水(海藻∶水＝1∶35w/w)中并且于120℃下进行高压灭菌1.5小时。将提取物均质化，离心以获得不含不溶于水的杂质的澄清提取物。将热提取物倾倒在不锈钢托盘中，并且使其冷却至室温。将装有胶凝的提取物的托盘在冰箱中于-20℃下保持20小时。随后在室温下解冻冷冻的凝胶。挤压解冻的凝胶以除去附着的液体，之后其用去矿质水进行洗涤，最后进行挤压以除去附着的水。风干天然琼脂聚合物，然后在烘箱中于50℃干燥2小时。
得率：5.0g(20.0％)，相对于完全干燥的海藻；凝胶强度(1.0％的凝胶)：在20℃下，＞1900g cm-2；胶凝温度：35.0℃；灰分：≤1.0％；硫酸酯或盐：≤0.25％。
实施例10
将如实施例2中的凝花菜(G.acerosa)(25g)海藻在35℃下于自来水中浸渍1小时，随后弃去水，用10％NaOH在85℃下处理所述湿海藻2小时，然后用水洗涤海藻以除去过量的碱。随后将经预处理的海藻置于蒸馏水(海藻∶水＝1∶35w/w)中并且于120℃下进行高压灭菌1.5小时。将提取物均质化，离心以获得不含不溶于水的杂质的澄清提取物。将热提取物倾倒在不锈钢托盘中，并且使其冷却至室温。将装有胶凝的提取物的托盘在冰箱中于-20℃下保持20小时。随后在室温下解冻冷冻的凝胶。挤压解冻的凝胶以除去附着的液体，之后其用去矿质水进行洗涤，最后进行挤压以除去附着的水。风干天然琼脂聚合物，然后在烘箱中于50℃干燥2小时。
得率：3.5g(14.0％)，相对于完全干燥的海藻；凝胶强度(1.5％的凝胶)：在20℃下，≥2000g cm-2；胶凝温度：41.0℃；灰分：≤1.1％；硫酸酯或盐：≤0.30％。
实施例11
将如实施例3中的可食江蓠(G.edulis)(25g)海藻在35℃下于自来水中浸渍1小时，随后弃去水，用10％NaOH在85℃下处理所述湿海藻2小时，然后用水洗涤海藻以除去过量的碱。随后将经预处理的海藻置于蒸馏水(海藻∶水＝1∶35w/w)中并且于120℃下进行高压灭菌1.5小时。将提取物均质化，离心以获得不含不溶于水的杂质的澄清提取物。将热提取物倾倒在不锈钢托盘中，并且使其冷却至室温。将装有胶凝的提取物的托盘在冰箱中于-20℃下保持20小时。随后在室温下解冻冷冻的凝胶。挤压解冻的凝胶以除去附着的液体，之后其用去矿质水进行洗涤，最后进行挤压以除去附着的水。风干天然琼脂聚合物，然后在烘箱中于50℃干燥2小时。
得率：3.0g(12.0％)，相对于完全干燥的海藻；凝胶强度(1.5％的凝胶)：在20℃下，≥400g cm-2；胶凝温度：40.0℃；灰分：≤2.56％；硫酸酯或盐：≤1.90％。
实施例12
用2种阳离子型[溴化十六烷基三甲基铵(CTAB)；和西吡氯铵(CPC)]、3种阴离子型[月桂基硫酸钠(SLS)；SC-896(ICI Uniqema，India)和SC-229(ICI Uniqema，India)]和5种非离子型[Triton X-100(S.D.Fine Chemicals，India)；Synperonic 91/6(ICI Uniqema，India)；SC-892(ICI Uniqema，India)；Tween-80(ICI Uniqema)和Atplus 245(ICI Uniqema，India)]表面活性剂处理如实施例1、2和3中制备的并且分别具有3.26、2.60和5.60的硫酸酯或盐含量(％w/w)的Gracilaria dura、凝花菜和可食江蓠海藻的热(70℃)琼脂提取物。在剧烈搅拌的条件下，以不搀水的形式逐渐加入表面活性剂。所采用的表面活性剂的浓度为3％(w/w)(相对于提取物)。在完成表面活性剂的添加后，中断搅拌并且让内容物在室温下静置5小时。对于任何情况，未观察到沉淀。
实施例13
使用实施例9、10和11的经碱处理的海藻的热(70℃)提取物(其分别包含具有0.25、0.30和1.90的硫酸酯或盐含量的琼脂糖)重复实施例12的实验。观察结果概述于表4中。可观察到，虽然在采用3％浓度的非离子型表面活性剂的情况下，实施例9和10的热提取物产生沉淀，但在采用任何浓度的离子型表面活性剂的情况下，未观察到这样的沉淀。此外，在采用非离子型表面活性剂的情况下，实施例11的提取物未产生任何沉淀。虽然对于实施例9和10的热提取物，所有非离子型表面活性剂都诱发了沉淀，但Triton X-100和Synperonic 91/6在3％w/w的更低浓度上产生了完全沉淀，因此被选择用于本发明的进一步的方法。
表4：用阳离子型、阴离子型和非离子型表面活性剂处理经碱处理的海藻提取物
Figure BDA0000100294450000211
Figure BDA0000100294450000221
实施例12和13得出结论：如果多糖的硫酸酯或盐的含量如琼脂糖一样低，那么非离子型表面活性剂在从热海藻提取物凝结琼脂糖中是有用的，从而本发明的方法可理想地用于制备琼脂糖。
实施例12的结果显示，当天然琼脂具有高于3％的高硫酸酯或盐含量时，天然琼脂从Gracilaria dura、凝花菜和可食江蓠的海藻提取物的凝结或沉淀在离子型和非离子型表面活性存在的情况下不发生。
实施例13(表4)显示，即使琼脂糖聚合物中硫酸酯或盐含量为ca1％，在阳离子型和阴离子型表面活性剂存在的情况下，琼脂糖从获自Gracilaria dura、凝花菜和可食江蓠的海藻提取物的凝结或沉淀也不会发生。实施例13(表4)还得出结论：当琼脂糖中硫酸酯或盐含量为0.25和0.3％时，在非离子性表面活性剂存在的情况下，发生琼脂糖从仅由经碱处理的Gracilaria dura和凝花菜获得的海藻提取物的完全凝结或沉淀。在可食江蓠的海藻提取物(其甚至在碱处理后具有相对高的硫酸酯或盐含量(1.9％))的情况下，在加入非离子型表面活性剂后，不发生琼脂聚合物的沉淀。由此得出结论：只有当琼脂的硫酸酯或盐含量足够低(＜1％)时，表面活性剂(非离子型)-诱发的琼脂沉淀现象才会充分发生。
实施例14
用2种非离子型[Triton X-100(S.D.Fine Chemicals，India)；和Synperonic 91/6(ICI Uniqema，India)]表面活性剂处理如实施例9和10中制备的并且分别具有0.25和0.30的硫酸酯或盐含量(％w/w)的Gracilaria dura和凝花菜海藻的热(70℃)琼脂糖提取物。表面活性剂的浓度为3％(w/w)(相对于提取物)。在完成表面活性剂的添加后，中断搅拌并且让内容物在室温下静置5小时。在两种非离子型表面活性剂存在的情况下，都发生琼脂糖聚合物的完全沉淀。在琼脂糖聚合物从提取物中沉淀后，通过离心收集沉淀的聚合物。通过下列来从琼脂糖聚合物除去过量的表面活性剂：反复用水洗涤(6x1升)，通过搅拌水-聚合物混合物15分钟进行每一次洗涤操作，或在再分散粗制琼脂糖团块后进行透析，之后通过离心除去洗涤液来分离琼脂糖团块。将不含表面活性剂的湿的琼脂糖团块再溶解在热水中以产生浓缩液(7％w/w)。随后用等量的异丙醇处理该溶液，以进行脱水，从而提供易分散的琼脂糖。
在用非离子型表面活性剂Triton X-100和Synperonic 91/6处理后，从Gracilaria dura和凝花菜的海藻提取物获得的琼脂糖聚合物产物的规格如下。
Gracilaria dura的琼脂糖：得率：3.15g(14.0％)，相对于完全干燥的海藻；凝胶强度(1％的凝胶)：在20℃下，≥1900g cm-2；胶凝温度：35.0℃；灰分：≤0.80％；硫酸酯或盐：≤0.20％。
凝花菜的琼脂糖：得率：2.47g(11.0％)，相对于完全干燥的海藻；凝胶强度(1.5％的凝胶)：在20℃下，≥1900g cm-2；胶凝温度：41.0℃；灰分：≤0.95％；硫酸酯或盐：≤0.25％。
实施例15
按照Wolnik，K.A.描述的方法(Methods Enzymol.，158：190-205，1988)，在Perkin-Elmer ICP-OES Optima 2000DV机器上利用电感耦合等离子体(ICP)分光光度法分析实施例14中从Gracilaria dura和凝花菜制备的琼脂糖聚合物的金属离子含量。将结果与Fluka的琼脂糖(Cat.No.05068，2003/2004)的报导的值相比较(表5)。结果显示，本发明的琼脂糖适合于电泳工作。
表5：Gracilaria dura、凝花菜和Fluka的琼脂糖中的金属离子含量
Figure BDA0000100294450000241
Figure BDA0000100294450000251
注释：NR＝未报导；ND＝未检测到
实施例16
在相同的实验条件下，进行先前发明(PCT 2005/118830；US2005/0267296 A1)和本发明(实施例14)的Gracilaria dura[凝胶强度：在1％的凝胶中，≥1900g cm-2]琼脂糖凝胶的对比评价：在凝胶电泳中两种凝胶的凝胶浓度均为0.8％。使用微波炉在90℃下将适当量的这两种琼脂糖样品分别溶解在50ml 1xTBE(10.8gm Tris碱，5.5gm硼酸，0.744gm Na2EDTA)缓冲液中。将琼脂糖溶液冷却至60℃，加入2μl溴化乙锭(10mg/ml)溶液，然后将凝胶浇铸在凝胶托盘中。
将DNA梯和2个不同的DNA样品(1.2kb和1.5kb)加载在两种凝胶上并且进行电泳(在50V下使用1xTBE缓冲液进行90分钟)。在跑胶后，从凝胶切取含有DNA的凝胶块，使用QIA-quick Gel Extraction试剂盒(Qiagen USA)将DNA提取在50μl无菌水中。在洗脱后，将5μl DNA加载在新浇铸的凝胶中以观察洗脱的DNA的浓度和质量。
然后在标准PCR条件(25ng DNA模板，1xTaq聚合酶缓冲液，150ngPCR引物，200μM dNTP和2.5U Taq聚合酶，于50μl反应体积中)下使用基因特异性引物再次扩增洗脱的DNA。PCR条件为在94℃下进行5分钟；在55℃下进行1分钟以及在72℃下进行1分钟，进行35个循环。利用0.8％的新型琼脂糖凝胶和已有的琼脂糖凝胶通过电泳再检查PCR扩增的DNA。在紫外光(紫外灯管8W，312nm；Bangalore Genei，India)下显现凝胶。
为了检查在本发明中获得的琼脂糖凝胶(图1.1，1.2和1.3中的凝胶a)的质量和性能，进行DNA凝胶电泳并且将其与先前发明(PCT2005/118830；US 2005/0267296 A1)的琼脂糖凝胶(图1.1，1.2和1.3中的凝胶b)相比较。在图1.1中，分析PCR扩增的DNA，从这些凝胶中洗脱DNA产物，利用DNA凝胶电泳再次分析所述产物(图1.2)。利用从图1.1的凝胶洗脱的DNA产物进行PCR扩增，并且利用DNA凝胶电泳检查扩增的DNA产物的质量(图1.3)。在所有图(图1.1，1.2和1.3)中，在两种凝胶样品，即凝胶a和b中，发现DNA样品的分离以及洗脱的DNA的质量相似。
实施例16得出结论：本发明的方法产生这样的琼脂糖，其与利用现有技术从Gracilaria dura获得的琼脂糖相比较具有相似的质量。
本发明的有利方面
本发明的主要有利方面是，可通过这样的方法从印度海域的Gracilaria dura和凝花菜产生所需规格的琼脂糖，所述方法较不耗费资本并且与现有技术相比较更易于进行，并且依然产生具有相当质量的产物。
另一个有利方面是，因省却冷冻-解冻操作而以更高能源效率的方式制备琼脂糖。
另一个有利方面是，通过离心澄清热海藻提取物，该过程省却了对作为澄清剂的硅藻土和炭的需要。
另一个有利方面是，用于本发明的所有非离子型表面活性剂是水溶性的，这使得它们能够通过简单的水洗涤容易地从产物中除去。
另一个有利方面是，表面活性剂是可再循环的。
另一个有利方面是，在从提取物凝结和洗涤后，通过制备高浓度的水分散系，然后利用最少量的醇将其沉淀出来以获得所需粒度范围的产物，可使产物更易于水分散，从而免除了对任何碾磨的需要。
另一个有利方面是，这样的精制产物适用于以这样的浓度进行DNA凝胶电泳，所述浓度低于公知的商品所需的浓度。
另一个有利方面是，所获得的琼脂糖的质量能够在塑料容器中贮存至少达到1年而无任何变质。

Claims (10)

1.利用表面活性剂从海藻的含水提取物纯化琼脂糖的改进的方法，所述方法包括步骤：
a.以10000-14000rpm离心经碱处理的热海藻提取物(70-80℃)5至15分钟；
b.在连续搅拌的条件下将步骤(a)中获得的热海藻提取物与2-5％表面活性剂在60-100℃的温度范围下混合；
c.使步骤(b)中获得的内容物在25-35℃的温度范围下静置1-10小时以沉淀出琼脂糖的固体团块；
d.倾倒上清液并且用水洗涤所述团块以除去固体中的残留表面活性剂；
e.将步骤(d)中获得的湿团块以7至10％w/w琼脂糖产物的范围再溶解于最少量的水中，并且用最少量的异丙醇处理以沉淀出琼脂糖，其中琼脂糖溶胶对异丙醇的比率为1∶0.5至1∶1.5w/w；
f.分离固体产物并且在适当的干燥器中进行干燥以获得具有200至300的网目大小的琼脂糖粉末。
2.权利要求1的方法，其中用于制备提取物的海藻选自江蓠属和凝花菜属的种，更具体地选自获自古吉拉特和泰米尔纳德海岸的印度海域的Gracilaria dura和凝花菜。
3.权利要求1的方法，其中利用已知的方法制备提取物，所述方法包括步骤：在25-95℃下用20-35份(w/w)1-15％(w/w)的氢氧化钠水溶液处理干燥的海藻0.5-5小时，然后进行洗涤以将pH调整在7-9的范围内，随后向经洗涤的海藻中加入去矿质水，并且在100-125℃的温度范围下高压灭菌1-2.5小时。
4.权利要求1的方法，其中所使用的表面活性剂是选自商购可得的辛基苯酚乙氧基化物(Triton X-100)和壬基苯酚乙氧基化物(Synperonic 91/6)的非离子型表面活性剂。
5.权利要求1的方法，其中在环境条件下进行步骤(d)中的洗涤或透析操作直至洗涤液的表面张力与水的表面张力相同。
6.权利要求1的方法，其中从消耗的提取物和洗涤液再循环表面活性剂。
7.权利要求1的方法，其中仅当琼脂糖中硫酸酯或盐的水平＜0.82％(w/w)，优选＜0.5％(w/w)，以及更优选＜0.25％时，所使用的表面活性剂才诱发絮凝。
8.权利要求1的方法，其中所述方法用于纯化这样的多糖，其固有地包含低硫酸酯或盐和/或可通过化学或生物化学方法脱硫酸化至这样低水平的硫酸酯或盐含量。
9.权利要求1的方法，其中所获得的琼脂糖聚合物适合用于DNA凝胶电泳。
10.权利要求1的方法，其中所获得的琼脂糖的质量能够在塑料容器中贮存至少达到1年而无任何变质。
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