CN1993474A - 一种划算的用于从江蓠属藻类制备琼脂糖的方法 - Google Patents

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拉马瓦塔尔·米纳
卡马莱什·普拉萨德
巴拉特库马尔·卡利达斯·拉马瓦特
普什皮托·库马尔·高希
卡鲁帕南·埃斯瓦兰
圣加伊娅·蒂鲁保蒂
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Abstract

本发明涉及一种简单、直接及划算的从天然的或栽植的江篱属藻类，特别是从江篱属藻类硬膜中制备凝胶强度高并且胶凝温度低的琼脂糖的方法。所述方法包括如下步骤：用碱预处理干的海藻，冲洗预处理后的海藻直至所示冲洗后海藻的pH范围在7－8之间，加水，高压蒸煮以获得提取物，用活性炭及赛力特硅藻土处理前述提取物以获取热的提取物，在赛力特硅藻土层上真空过滤前述热的提取物，将前述滤出液冻结成块然后将其解冻，通过在高压釜中加热再溶解在水中的块，重复前述冻结－解冻循环过程，过滤前述产物以去除解冻后的液体，其后挤压以排出剩余的液体至可以获得琼脂糖的程度。

Description

一种划算的用于从江蓠属藻类制备琼脂糖的方法
技术领域
一种简单、直接及划算的从天然的或栽植的江篱属藻类(Gracilariaspp.)，特别是从江篱属藻类硬膜(Gracilaria dura)中制备凝胶强度高并且胶凝温度低的琼脂糖的方法。
背景技术
可参看因特网址www.sporeworks.com，该网站描述琼脂主要用于食品、医疗/制药以及化妆品行业。琼脂也用于其它行业，例如其近来用于包装泡沫材料行业以生产可生物降解的包装泡沫材料。此外，该网站描述了高品质细菌琼脂的显著特征。该网站描述此种琼脂的胶凝温度应该为34-35℃，以使在灭菌后加入培养基中的热敏性抗体可能的降解降至最低。此外，其还描述了越凉的琼脂越容易处理并且在陪替氏(Petri)培养皿中浓缩的问题越少。高品质细菌琼脂的另一重要特征在于，在标准测量条件下，其应具有的最低凝胶强度为800gcm-2。
可参阅2003-2004年的Fluka目录册(Fluka Catalog)，其中描述了系列琼脂产品的规格。
可参阅2000-2001年的Sigma目录册(Sigma Catalog)，其中描述了琼脂糖是一种从琼脂或含有琼脂的海藻分离得到的纯化的线性半乳糖体水状胶体。琼脂糖凝胶强度范围为650-1200g/cm2(1％溶液)，胶凝点的范围为36-42℃。此类产品的缺点之一在于其成本高，这大概是由于其涉及精细的纯化过程。
也可再参看因特网址www.sporeworks.com，该网站描述了石花菜(Gelidium)海藻生产最高等级的琼脂以及琼脂糖。
可以参阅从石花菜生产细菌琼脂的论文，其中提到源自这种海藻的产品具有高凝胶强度(R.Armisen，J.Appl.Phycology，1995，7：231-243，and J.Cosson et al.in Progress in PhycologicalResearch，F.E.Round and D.J.Chapman，Eds.，Biopress Ltd.1995.Vol.11；pp.269-324)。
可提及Andres Lemus等人所著的论文(《食品水状胶体》(FoodHydrocolloids)，1991，5：469-479)，其中提到源自不同石花菜种类的琼脂的胶凝温度为34.0-37.5℃，通过两个冻结-解冻循环对提取的琼脂进行提取以及纯化之前将碱预处理后的海藻的pH调整至6-6.5(大概用酸)的工艺获得的凝胶强度为687-1470g/cm2。
可提及Lebbar等人的“从藻类提取物汁生产琼脂的方法”(“Processfor producing agar-agar from an algae extraction juice”)(US4,780,534；1988)，其中，从藻类(石花菜属藻类、江篱属藻类(Gracilaria)以及鸡毛菜属藻类(Pterocladia spp.)提取汁制备琼脂的方法包括：(a)将提取汁置于Na+形式的阳离子交换树脂中，然后将其置入(b)Cl-及/或SO4 2-形式的阴离子交换树脂中，然后(c)可选择地将提取汁置于OH-形式的阴离子交换树脂中，(d)紧随其后将提取汁胶凝化，(e)从制得的凝胶中提取琼脂，以及(f)通过将提取的琼脂与负载有臭氧的运载气体接触从而处理制得的粉末。这样的工艺可以低成本生产高等级的琼脂，在医疗、制药以及生物工程领域尤其有用。所描述的凝胶强度的范围为1.5％的凝胶820-910g/cm2。
可提及M.Y.Roleda等人所著的论文(《海洋植物学》(BotanicaMarina 1997，40：63-69)，文中所述源自凝花菜(Gelidiella acerosa)的琼脂的胶凝温度分别为38℃以及47℃，凝胶强度分别为493g cm-2以及200g cm-2，文中所述琼脂的制备方法涉及在提取之前的乙酸预处理。
可提及O.P.Mairh等人所著的论文(《海洋植物学》(BotanicaMarina 1978，21：169-174)，文中所述源自在印度西海岸阿拉伯海栽植的匍匐石花菜(Gelidium pusillum)的琼脂凝胶强度为210g cm-2，在本发明内容中该凝胶强度被认为是不足的。此外，该论文没有提供胶凝温度的信息。
可以参阅Krishnamurthy等人所著的论文(《印度洋区域海藻研讨会论文集》，中央盐以及海藻化学制品研究院，包纳加尔，1979，第41页)(Proceedings，symposium on marine algae of Indian Ocean Region，Central Salt&Marine Chemicals Research Institute，Bhavnagar，1979，p41)，文中提到源自凝花菜的琼脂的最大凝胶强度为325gcm-2，而相应的胶凝温度为38-52℃。
也可以参阅K.S.Pillai所著的论文(J.Phycol.，13(Suppl.)，1977，p54)，K.S.Pillai已尝试使加工条件最优化以使琼脂质量最佳，并且提到由凝花菜制备的产率高达48％，但最大凝胶强度为300gcm-2，而由江篱属藻类(未提及品种)的制备的产率为45-50％，最大凝胶强度为125gcm-2。
可以参阅Patel等人所著的论文(J.Phycol.13(Suppl.)，1977，p52)，Patel等人从生长在印度洋海岸中的凝花菜制备的产率为24.3％，凝胶强度为790gcm-2。
可以看出，对石花菜而言，所提到的最好结果为：对于1.5％凝胶，胶凝点为37.5℃，凝胶强度为1470gcm-2，而对石花菜属(Gelidiella)种类而言，所提到的最好凝胶强度为790gcm-2。如果对产品例如琼脂糖还要求更高的规格，那么所述琼脂为此须进一步纯化。如果此类产品可以由海藻制得而不需精细的纯化将是理想的。
可以提及Kiyoshi Arai等人所著的“琼脂的纯化”(“Purificationof agar”)(JP 7017，130，1970年1月13日；《化学摘要》，74，32889r，1971)(JP 7017，130，January 13，1970；Chemical Abstr.74，32889r，1971)，文中提到用DMF提取粗制琼脂以分离高纯度琼脂糖。10g琼脂与500mlDMF搅拌混合，在热水中浸泡10小时，离心分离，将上清液倒入2公升丙酮中，沉淀物通过玻璃过滤器，用500ml丙酮清洗，在热水中溶解并且过滤以得到琼脂糖粉。
可以提及Craigie以及Leigh所著的“用季碱分离部分纯化的琼脂糖”(“Isolation of partially purified agarose with a quaternarybase”)(《海藻学方法手册》，J A Hellebust以及J S Craigie编，剑桥大学出版社，剑桥，1978；第126页)(in Handbook of PhycologicalMethods，edited by J A Hellebust and J S Craigie，CambridgeUniversity Press，Cambridge，1978；p.126)，其中提到：250mg粗制琼脂溶解于100ml沸腾的蒸馏水中，加入25mgλ-角叉菜胶，然后将10ml2％的塞太弗伦(氯化十六烷基吡啶)加入80-100℃的溶液中。用赛力特硅藻土(Celite)过滤热的提取物并且在膜上(0.8微米)加热过滤，然后将产物冻结以及解冻以制得部分纯化的琼脂糖。
可以提及R.B.Provonchee的“使用乙二醇的琼脂糖纯化方法”(“Agarose purification method using glycol”)(US 4,990,611，1991年2月)，文中提到通过下述方法由琼脂或不纯的琼脂糖中重新得到纯化的琼脂糖：在升高的温度中将琼脂或琼脂糖溶解在低级(lower)亚烃基二醇中，将包含琼脂或琼脂糖的二醇溶液冷却以诱导出纯化的琼脂糖产物沉淀，并且重新得到琼脂糖产物沉淀物。
也可提及Kirkpatrick等人的专利号为4,983,268的美国专利，所述专利描述了适于快速电泳制备纯化琼脂糖的方法，其特征在于硫酸盐含量少于0.2重量％，并且凝胶强度至少为1200gcm-2(1％)。通过如下方法纯化琼脂糖：在pH为6.0-8.0并且包含不超过2.0nM的氯化物盐的缓冲水溶液中溶解琼脂糖或碱改性的(alkali-modified)琼脂，并且通过与低级烷醇接触沉淀琼脂糖。
也可参阅Alfred Polson的论文(《化学摘要》65：p5865a；1965)(Chemical Abstract 65：p5865a；1965)，文中提到通过分馏琼脂糖以及琼脂胶混合物制备琼脂糖。所述混合物用分子量为300的聚(乙烯基乙二醇)水溶液处理，获得富含琼脂糖的沉淀物。在该过程中，80g二号离子琼脂(Ionagar)溶解于两公升水中。加入2公升分子量为6000的40％(重量/体积)聚乙烯乙二醇至热(80℃)的溶液中，并且通过110目的尼龙布过滤分离出产生的沉淀物。然后将所述沉淀物在40℃清洗2-3分钟，悬置于15℃的水中，在5公升水中过夜搅拌，收集于尼龙网中，用丙酮清洗并且在温暖的空气中干燥。
可以参阅R.Armisen的出版物(J.Appl.Phycol.1995，7：231-243)，文中提到：从十七世纪中期以来，世界上琼脂的第一来源是日本的石花菜，但到二十世纪初叶时对藻胶的需求量超过了该藻类的供给量，这使得有必要寻求可替代的海藻资源。文中也提到碱水解硫酸盐的生产工艺的发展已经可以从江蓠属藻类制得优良品质的食品级琼脂。
可以参阅A.Q.Hurtado-Ponce等人的论文(《海洋植物学》，1988，31：171-174)，文中已报道了如下的源自各种江蓠属品种的具有较差的凝胶特性，特别是不同的胶凝温度以及凝胶强度(低及高，并且反之亦然)的琼脂：(i)源自江篱属藻类(Gracilaria sp.)(未提供种类的详细信息)的琼脂的胶凝温度为41.3℃，凝胶强度为470gcm-2；(ii)源自可食江篱属藻类(Gracilaria edulis)的琼脂的胶凝温度为55℃，凝胶强度为140gcm-2；(iii)源自江篱(Gracilaria verrucosa)的琼脂的胶凝温度为53℃，凝胶强度为270gcm-2；(iv)源自凤尾菜(Gracilariaeucheumoides)的琼脂的胶凝温度为34℃，凝胶强度为130gcm-2。
可以参阅J.Rebello等人的论文(J.Appl.Phycol.1997，8：517-521)，文中已报道了具有高胶凝温度(59℃)和低凝胶强度(350gcm-2)的江篱属藻类薄束(Gracilaria gracilis)的琼脂。
可以提及因特网址(www.rheofuture.com)以及Y.Freile-Pelegrin等人所著的论文(J.Appl.Phycol.1997，9：533-539)，文中提到在为制备琼脂提取物对江篱属藻类的预处理中，碱的最佳浓度是特定种类的。该论文的作者进一步提及对弱碱以及3％与5％的NaOH预处理后的海藻分别用0.025％的H3PO4以及0.025％的H2SO4浸泡以中和前述碱。发现此类预处理对源自墨西哥尤卡坦半岛(Yucatan)的江篱角膜(Gracilariacornea)制备的琼脂的凝胶强度范围为974-1758g/cm2。然而，随着凝胶强度增强，胶凝温度也升高，并且凝胶强度为1758g/cm2的琼脂的胶凝温度为42-43℃，然而，许多应用都有胶凝温度低、凝胶强度高的要求。
可以参阅R.D.Villanueva等人的论文(《海洋植物学》，第40卷，1997，pp 369-372)，文中提到源自麒麟龙须菜(Gracilaria eucheumoidesHarvey)的最佳琼脂提取物。在该方法中，海藻用NaOH预处理，然后用0.5％的乙酸清洗。在最佳处理条件下，获得的最大凝胶强度为423±43g/cm2，未提及相应的胶凝温度。
Ma.R.J.Luhan也已经进行了一项针对从菲律宾中部伊洛伊洛(Iloilo)采集的江篱水竹(Gracilaria heteroclada)的与如上所述的研究相类似的研究(《海洋植物学》，35，1992，pp.169-172)，研究发现在早期干燥季节期间以及湿润季节期间采集的海藻的凝胶强度范围分别为510-794g/cm2以及43-101g/cm2，未提及其胶凝温度。
E.Marinho-Soriano报道了源自不同江篱属品种(红藻门(Rhodophyta)，江蓠科(Gracilariaceae))，包括江篱属藻类硬膜(《生物技术学报》89：81-84，2001)(Journal of Biotechnology 89：81-84，2001)的琼脂多糖提取物，采用110℃的热水提取1小时，对海藻不进行任何预处理。制得的琼脂的凝胶强度为318±49g/cm2。
可以参阅E.Murano等人的论文(《水生生物学》204/205：567-571，1990)(Hydrobiologia 204/205：567-571，1990)，其已提及亚得里亚海(Adriatic Sea)中出现的江篱属藻类硬膜。
可以参阅E.Murano等人的论文(《碳水化合物聚合体》1992，18：171-178)(Carbohydrate Polymers 1992，18：171-178)，文中提到，用碱或不用碱预处理，从生长在亚得里亚海北部的江篱属藻类硬膜提取琼脂。在提取前用碱预处理后用HCL中和。天然的以及碱处理后制得的琼脂的凝胶强度为160-390g/cm2。
可以参阅E.Murano，C.Brandolin，F.Zanetti，S.Paoletti以及R.Rizzo的论文(《水生生物学》，204/205：567-571，1990)(Hydrobiologia 204/205：567-571，1990)，其报道了从在亚得里亚海北部实验性地在一体化的混养系统中栽植的江篱属藻类硬膜(江蓠科，红藻门)提取的琼脂组分的特性，将其置于热水(90℃)以及0.5M NaOH(90℃，3小时)后用淀粉酶进行酶处理处理。除了所报道的结果说明在琼脂的品质方面并未具有什么不同寻常的事实外，这是一种比常规的琼脂提取方法更复杂的处理方法。
也可参阅E.Marinho-Soriano的论文(《生物技术学报》89：81-84，2001)(Journal of Biotechnology 89：81-84，2001)，其已报道在地中海的Thau湖(43°24′N；03°32′E)中出产江篱属藻类硬膜。
可参阅R.M.Oza以及S.H.Zaidi的论文(“印度海藻修订一览表”，国家海藻以及海洋化学制品数据中心，印度政府海洋发展部；中央盐以及海洋化学制品研究院，包纳加尔，古吉拉特，印度，2001；p 25)(Arevised checklist of Indian marine algae，National Marine DataCentre on Algae and Marine Chemicals，Department of OceanDevelopment，Government of India；Central Salt and MarineChemicals Research Institute，Bhavnagar，Gujarat，India，2001；p 25)，其已报道在印度西海岸出产江篱属藻类硬膜(C.阿加德)(C.Agardh)(J.阿加德)(红藻门，江蓠科)。
可以参阅A.K.Siddhanta等人的论文(《海藻研究以及应用》，19(1&2)：95-99，1997)(Seaweed Research and Utilisation 19(1&2)：95-99，1997)，其报道了从印度西海岸采集江篱属藻类硬膜天然原料制备琼脂。干的海藻用1N硫酸预处理后用1.5％的碱中和。通过该过程获得凝胶强度为260g/cm2的琼脂。
显然，上述例子中没有报道从任何江篱品种制备下述琼脂：具有高的凝胶强度(＞1500g/cm2在1％水平)，同时具有低的胶凝温度(35-36℃)。
从上述例子中还可以看出：在所有例子中，江篱海藻要么用水直接提取，要么通过预处理以产生碱水解的效果，并且随后在提取琼脂之前用酸(HCl，H2SO4，CH3COOH以及磷酸(o-phosphoric acid)中和过量的碱。
可以参阅H.H.Selby以及R.L.Whistler的论文(“工业胶体-多糖及其衍生物”，R.L.Whistler以及J.N.BeMiller Eds.，第3版，学术出版股份公司，纽约，1993，pp 87-103)(Industrial gums-Polysaccharides and their Derivatives，R.L.Whistler and J.N.BeMiller，Eds.，3rd Edition，Academic Press Inc.，New York，1993，pp 87-103)。文中提到混合几种类型的海藻可以制得具有所需特性的琼脂组合物。然而，其没有提及基于江篱属藻类硬膜的任何配方。
显然，根据现有技术，由生长在世界不同地区的江篱属藻类硬膜生产的所需要的琼脂的品质是相当普通的，并且没有报道由此类海藻制得具有高凝胶强度以及低胶凝温度的琼脂类型的产品。
本发明目的
本发明的主要目的在于从产自印度水域的江篱属藻类硬膜制备琼脂糖。
另一目的在于以一划算的方式制备具有高凝胶强度(＞1900g/cm2；1％凝胶，20℃)，低胶凝温度(约35℃)，低(0.25)硫残留及低灰分含量(＜1％)的琼脂糖。
另一目的在于用一最佳浓度的碱预处理海藻以制备琼脂糖。
此外，本发明另一目的在于只通过水清洗而不是用常规的酸中和方法去除残留的碱(预处理后)。
此外，另一目的在于证明上述过量的碱去除的方法制得的产品具有大大增强的凝胶强度。
此外，另一目的在于制备喷雾干燥的琼脂糖以使产物更易于溶解。
此外，另一目的在于证明当在室温条件下在塑料袋中贮藏干燥江篱属藻类硬膜海藻超过一年时，琼脂糖的品质没有显著退化。
此外，本发明另一目的在于说明海藻适于栽植，甚至在远离其天然产地处。
此外，本发明另一目的在于说明由天然的以及栽植的江篱属藻类硬膜制得的琼脂糖的品质是类似的。
本发明另一目的在于说明，即使天然琼脂糖的产量是受限的，由具有足够量的江篱属藻类硬膜生产琼脂糖也是可行的。
发明内容
本发明涉及一种简单、直接及划算的从天然的或栽植的江篱属藻类，特别是从江篱属藻类硬膜中制备凝胶强度高并且胶凝温度低的琼脂糖的方法。所述方法包括如下步骤：用碱预处理干的海藻，冲洗预处理后的海藻直至所示冲洗后海藻的pH范围在7-8之间，加水，高压蒸煮以获得提取物，用活性炭及赛力特硅藻土(Celite)处理前述提取物以获取热的提取物，在赛力特硅藻土层上真空过滤前述热的提取物，将前述滤出物冻结成块然后将其解冻，通过在高压釜中加热再溶解在水中的块，重复前述冻结-解冻循环过程，过滤前述产物以去除解冻后的液体，其后挤压以排出剩余的液体至可以获得琼脂糖的程度。
具体实施方式
因此，本发明涉及一种简单、直接及划算的从天然的或栽植的江篱属藻类，特别是从江篱属藻类硬膜中制备凝胶强度高并且胶凝温度低的琼脂糖的方法。所述方法包括如下步骤：用碱预处理干的海藻，冲洗预处理后的海藻直至所示冲洗后海藻的pH范围在7-8之间，加水，高压蒸煮以获得提取物，用活性炭及赛力特硅藻土处理前述提取物以获取热的提取物，在赛力特硅藻土层上真空过滤前述热的提取物，将前述滤出物冻结成块然后将其解冻，通过在高压釜中加热再溶解在水中的块，重复前述冻结-解冻循环过程，过滤前述产物以去除解冻后的液体，其后挤压以排出剩余的液体至可以获得琼脂糖的程度。
在本发明的一实施例中，本发明涉及的一种琼脂糖具有下述特性：
i.在大约20℃时的凝胶强度大约为1％(≥1900g/cm2)，
ii.胶凝温度为35-35.5℃，
iii.硫酸盐含量≤0.25％，且
iv.灰分含量≤0.9％，
此外，在本发明的另一实施例中，琼脂糖由江篱属藻类，特别是从江篱属藻类硬膜中制得。
在本发明的另一实施例中，琼脂糖凝胶体的融化温度范围在98-100℃之间。
在本发明的另一实施例中，一种简单、直接及划算的从天然的或栽植的江篱属藻类，特别是从江篱属藻类硬膜中制备凝胶强度高并且胶凝温度低的琼脂糖的方法包括如下步骤：
●获取干的海藻江篱属藻类，
●在25-95℃用大约35份(v/w)的大约为1-15％的碱预处理干的海藻0.5-5.0小时，
●用水彻底冲洗预处理后的海藻以去除过量的碱，直至所示冲洗后海藻的pH在7-8之间，
●按每一份未处理的海藻(original seaweed)大约加入35份(v/w)的水的比例加入水，在大约115-125℃高压蒸煮1.5-2.5小时以获得提取物，
●在温度85-95℃用大约0.05-0.07％的活性炭及大约10-15％的赛力特硅藻土处理前述提取物以获取热的提取物，
●在赛力特硅藻土层上真空过滤前述热的提取物，
●在大约-20℃将前述滤出物冻结成块12-15小时，然后将其解冻，
●通过在高压釜中加热再溶解大约在25份水中的块，
●如必要，重复前述冻结-解冻循环过程，
●过滤步骤(i)中的产物以去除溶解后的液体，其后挤压以排出剩余的液体至可以获得琼脂糖的程度，及
●任选地再溶解前述固体，然后喷雾干燥以获得精细粉末。
在本发明的另一实施例中，所述碱是氢氧化钠。
在本发明的另一实施例中，所述碱的浓度大约为10％。
在本发明的另一实施例中，步骤(d)中的高压蒸煮时间优选大约为1.5小时。
在本发明的另一实施例中，琼脂糖的产率为干海藻重量的20-23％。
在本发明的另一实施例中，优选在温度大约为85℃预处理海藻。
在本发明的另一实施例中，预处理海藻的时间优选大约为2.0小时。
在本发明的另一实施例中，优选在温度大约为120℃高压蒸煮。
在本发明的另一实施例中，活性炭的浓度大约为0.06％。
在本发明的另一实施例中，赛力特硅藻土的浓度大约为12.5％。
虽然现有技术披露了主要地从石花菜海藻(Gelidium)以及凝花菜海藻制取高品质的琼脂及琼脂糖，以及从江篱属藻类硬膜提取的琼脂显示的凝胶强度只有160-390g/cm2(1.5％)，但本发明描述了从印度西海岸阿拉伯海(Arabian Sea)中稀有的江篱属藻类硬膜以及为提高实际效用的生物产量而成功栽植的相同的海藻中制备琼脂糖：收获鲜海藻，在地上干燥，室温下在化工厂重新浸泡，用NaOH水溶液处理，水洗去除剩余的碱，浸泡于充足的水中，高压蒸煮，然后将热的提取物均质，然后加入清洗助剂(clarifying aids)煮沸，在赛力特硅藻土层上过滤，将滤出液进行冻结-解冻循环，再溶解制得的固体，然后再次进行冻结-解冻循环以进一步减少杂质，置于地上风干或优选在水中再溶解然后喷雾干燥。
在本发明的一实施例中，收获的江篱属藻类硬膜产自位于20°54′N、70°22′E的印度西部的韦拉沃尔(Veraval)海岸。
在本发明的另一实施例中，使用氢氧化钠作为选择的碱在80-85℃进行碱预处理1-2小时。
在本发明的另一实施例中，用于预处理的碱的浓度范围为0-15％(w/v)，且优选10％。
在本发明的另一实施例中，使用的碱的量为每10g海藻300mL。
此外，在本发明的另一实施例中，通过用水清洗海藻去除预处理后剩余的碱从而避免使用任何酸且确保最终洗涤后的pH范围为7-8。
此外，在本发明的另一实施例中，预处理后的湿海藻被放入一高压釜内的水中，其中，水的量为每10g最初的干海藻300mL。
此外，在本发明的另一实施例中，预处理后的海藻在120℃的水中蒸煮1.5-2.0小时。
此外，在本发明的另一实施例中，在70-80℃放出热的提取物，随后将活性炭及赛力特硅藻土加入前述提取物中，然后在大气压下将提取物煮沸。
此外，在本发明的另一实施例中，煮沸的提取物在赛力特硅藻土上真空过滤。
此外，在本发明的另一实施例中，将澄清的热滤出液倒入平钢盘中冷却至室温以形成凝胶体。
此外，在本发明的另一实施例中，用刀沿X及Y轴以一定的间距将凝胶体切块，然后冷却至-20℃2-5小时以冻结所切的块，然后在低温下保持12-15小时。
此外，在本发明的另一实施例中，如必要，重复冻结-解冻过程。
此外，在本发明的另一实施例中，在最适宜的提取条件下制得的琼脂糖的凝胶强度在浓度为1％、温度为20℃时＞1900gcm-2。
此外，在本发明的另一实施例中，从最适宜的提取条件下制得的琼脂糖制备的胶凝体的融化温度为98-100℃，而溶胶的胶凝温度为35.0-35.5℃。
此外，在本发明的另一实施例中，在最适宜的加工条件下制得的琼脂糖的硫酸盐含量为0.25％、灰分含量为0.9％。
此外，在本发明的另一实施例中，喷雾干燥热的琼脂糖溶胶以在加热时易于溶解。
此外，在本发明的另一实施例中，江篱属藻类硬膜在印度东南海岸的马纳尔湾(Gulf of Mannar)中的聚乙烯袋中或筏(raft)上可栽植，在Krusadai岛(9°16′N，79°19′E)的浮筏式栽植的日生长率达到5％。
此外，在本发明的另一实施例中，天然的及栽植的海藻产出类似品质的琼脂糖，由于通过栽植可获得大的生物产量，使本发明在实践中可行。
此外，在本发明的另一实施例中，从存储在塑料袋中长达1年的干海藻提取的琼脂糖的品质与从新干制的海藻中制备的琼脂糖的品质类似。
因此，本发明描述了从天然的或栽植的江篱属藻类硬膜制备高凝胶强度及低胶凝温度的琼脂糖的方法，该方法包括：(i)称量干海藻，(ii)在85℃用35份(v/w)的10％氢氧化钠预处理干海藻2小时，(iii)用水彻底清洗海藻以去除过量的碱直至pH显示为7-8，(iv)按每一份未处理的海藻加入35份(v/w)的水的比例加入水，在温度120℃高压蒸煮1.5小时，(v)在温度85-90℃用大约0.06％的活性炭及大约12.5％的赛力特硅藻土(基于干海藻的重量百分比)处理提取物，(vi)在赛力特硅藻土层上真空过滤前述热的提取物，(vii)在-20℃将前述滤出物冻结15小时，然后将其解冻，(viii)通过在高压釜中加热再溶解大约在25份水中的块，(ix)如必要，重复前述冻结-解冻循环过程，(x)过滤解冻后的液体，其后挤压以排出剩余的液体至可以获得琼脂糖的程度，(xi)再溶解前述固体，然后喷雾干燥以获得精细粉末。通过Nikkansui型凝胶检测仪测量20℃时1.5％的琼脂凝胶体强度。通过瑞士制造的STAR-Toledo热重分析仪器进行热重分析(TGA)。通过Ostwald黏度计(参照C.Rochas及M.Lahaye.，《碳水化合物聚合体》，1989，10：289)(cf.C.Rochas and M.Lahaye.Carbohydrate Polymers 1989，10：289)测量内在的粘度而确定分子量。依照Craigie等人描述的方法(《藻类学方法手册》，1978，Eds.Hellebust.JA and Craigie JS，剑桥大学出版社，第127页)(Hand Book Of Phycological Methods，1978(Eds.Hellebust.JA and Craigie JS，Cambridge University Press)；pp.127)测量胶凝及融化温度。通过在800℃将固体烧成灰6小时测量灰分含量。通过用高浓度的硝酸处理前述灰，蒸发至干燥，在水中溶解残留物，过滤，然后用ICP-OES分析硫含量。
主要的发明点在于消除了传统的观念：只有产自印度海岸的石花菜海藻以及凝花菜海藻才可产出高品质的琼脂。
另一发明点在于重新采用(revisiting)了海藻，江篱属藻类硬膜，原先由于所制得的琼脂的普通品质以及自然界有限的生物产量使其只具有少许实用性而被放弃。
另一发明点在于确定了用于预处理海藻的NaOH的最佳浓度。
另一发明点在于避免了用酸中和过量碱(预处理后)的常规方法，而只是用水清洗以去除过量的碱，由此防止了由于高浓度酸的存在而可能发生的酸催化多糖降解。
另一发明点在于未受制于(undeterred)自然界海藻的低生物产量，而是在适合的地方寻求栽植以获得来源。
另一发明点在于确定了浮筏式栽植作为一种可行的栽植方法，在适当的海岸处，该方法的日生长率超过5％。
另一发明点在于重新采用了原先由于只具有少许实用性而被放弃了的海藻。
另一发明点在于未受制于自然界海藻的低生物产量，而是在与天然原产地完全不同的地方的有益环境中寻求栽植已获得来源。
另一发明点在于在放置在户外、平静的海上的筏上通过植物插条栽植海藻，从而获得高的日生长率。
另一发明点在于根据现有技术认识到：不同的海藻底物在预处理步骤中可能需要不同数量的碱及后续碱的最佳浓度。
另一发明点在于认识到：依照现有技术去除碱的方法，即，用酸中和剩余的碱，可能由于系统中局部的高浓度酸的瞬间累积会危害线性半乳糖体分子的稳定性而引起困难。
另一发明点在于喷雾干燥产物以在加热时易于溶解。
另一发明点在于通过系统研究发现：由于栽植可能不仅只持续一年，晒干后的海藻具有足够的保存期以使其具有必需的延长贮藏期。
另一发明点在于通过无溶剂方法制备。
为了示例的目的给出了下述实施例，因此，不应该认为本发明的范围局限于此。实施例1和2属于现有技术，而实施例3-8举例说明了此处描述的本发明。
实施例1
2003年4月从印度的韦拉沃尔(20°54′N and 70°22′E)收获江篱属藻类硬膜并晒干。在室温(30-35℃)将15g海藻浸泡于自来水中1小时，然后将水倒掉。然后将湿的海藻置于蒸馏水中(海藻∶水＝1∶35，w/v)，然后在120℃高压蒸煮1.5小时。将提取物均质然后与清洗助剂(活性炭及赛力特硅藻土)一起煮沸，接着在赛力特硅藻土层上减压过滤。然后，将滤出液在-20℃冻结15小时后解冻。将解冻后的溶液置于一块布中尽可能地将水挤出。将残留物在室温(30-35℃)风干，随后在50℃烘干2小时。制得4.41g琼脂(基于干透了的海藻，产率32.5％)，该琼脂的凝胶强度(1.5％凝胶体；20℃)为265g/cm2，胶凝温度为32℃，灰分为8.04％，硫酸盐为3.26％。
实施例2
实施例1中的江篱属藻类硬膜最初浸泡入水中，然后将水倒掉，在80-85℃用5％的NaOH处理湿海藻2小时，随后用水清洗以去除过量的碱。一种情形下用0.5％的硝酸，另一种情形下用0.025％的H2SO4中和残留的碱。然后高压蒸煮前述海藻并如实施例1中描述的那样进一步处理。表1归纳了所获得的结果。
表1用碱处理及用酸中和残留碱制得的琼脂
  海藻重量   预处理条件   产量(g)；(基于干透海藻的产率％)   凝胶强度(g/cm2)，20℃；(％胶凝体)   胶凝温度(℃)
  20g   5.0％碱，用0.025％H2SO4酸洗   3.6(21.0)   470(1.0％)   33.5
  10g   5.0％碱，用0.5％AcOH酸洗   1.31(15.0)   465(1.0％)   33.0
实施例3
除了在碱处理海藻后只用水清洗以去除所有的碱并且处理过程中未使用酸外，如实施例2那样处理20g江篱属藻类硬膜。从下述表2可见，由于这种改变，可测得显著增加的凝胶强度。
表2用水清洗去除海藻上残留的碱后制得的琼脂
  海藻重量   预处理条件   产量(g)；(基于干透海藻的产率％)   凝胶强度(g/cm2)，20℃；(％胶凝体)   胶凝温度(℃)   灰分(％)   硫酸盐(％)
  20g   5％碱，用水清洗   3.8(21.0％)   1620(1.0％)   35.0   2.02   0.50
实施例4
用不同浓度的碱处理江篱属藻类硬膜，所有情形下其余的处理均与实施例3相同。表3中示出了该研究结果。从表中可以看出，10％的碱是产生最高凝胶强度的最佳浓度，同时避免碱的浓度超出10％是必须的。
表3不同浓度的碱预处理后制得的琼脂/琼脂糖的性质
  海藻重量   预处理条件   产量(g)；(基于干透海藻的产率％)   凝胶强度(g/cm2)，20℃；(％胶凝体)   胶凝温度(℃)   灰分(％)   硫酸盐(％)
  15g   1.5％碱，用水清洗   3.10(20.7)   275(1.0％)   33.0   4.5   ＞0.50
  10g   3％碱，用水清洗   1.98(22.0)   800(1.0％)   35.0   3.4   ＞0.50
  20g   5％碱，用水清洗   3.80(21.0)   1620(1.0％)   35.0   2.02   0.50
  10g   7％碱，用水清洗   1.80(20.0)   1875(1.0％)   35.0   1.80   ＜0.50
  10g   10％碱，用水清洗   1.85(20.5)   ＞1920(1.0％)；1450(0.75％)；900(0.5％)   35.0   ≤0.9   ≤0.25
  15g   15％碱，用水清洗   3.20(23.0)   ＞1920(1.0％)；1465(0.75％)；900(0.5％)   35.0   ≤0.9   ≤0.28
实施例5
实施例4中的产物与如实施例4中那样用10％的碱处理江篱属藻类硬膜但如实施例2中所述情形之一用0.5％AcOH中和残留的碱所制得的产物进行比较。从表4中可以看出，由AcOH中和伴随的凝胶强度降低引起线性半乳糖体分子量的伴随减少。这明显表明多聚糖的酸催化水解导致凝胶强度的下降。
表4在各种浓度的碱预处理条件下随后用酸清洗制得的琼脂
  海藻重量   预处理条件   产量(g)；(基于干透海藻的产率％)   凝胶强度(g/cm2)，20℃；(％胶凝体)   重量平均分子量(道尔顿)
  10g   10％碱，用0.5％AcOH清洗   1.63(18.1)   1025(1.0％)   0.199×105
  10g   10％碱，用水清洗   1.85(20.5)   ＞1920(1％)   1.23×105
实施例6
如实施例3所述用5％的碱处理在不同时期从古吉拉特韦拉沃尔(Veraval，Gujarat)采集的江篱属藻类硬膜。数据在表5中列出。可以看出，海藻品质的季节变化是可忽略的。
表5从一年中不同时期收获的江篱属藻类硬膜制得的琼脂
  海藻采集数据   海藻重量   预处理条件   产量(g)；(基于干透海藻的产率％)   凝胶强度(g/cm2)，20℃；(％胶凝体)   胶凝温度(℃)   灰分(％)   硫酸盐(％)
  2003年2月   20g   5％碱，用水清洗   4.1(22.8)   1650(1.0％)   35.0   2.0   0.50
  2003年4月   20g   5％碱，用水清洗   3.8(21.0)   1620(1.0％)   35.0   2.02   0.50
  2003年6月   20g   5％碱，用水清洗   4.2(23.0)   1600(1.0％)   35.0   2.0   0.50
  2004年12月   10g   5％碱，用水清洗   1.85(20.5)   1600(1.0％)   35.0   2.0   0.50
  2004年1月   15g   5％碱，用水清洗   2.90(20.0)   1630(1.0％)   35.0   2.0   0.50
实施例7
实施例1的江篱属藻类硬膜在2004年1月收获，且存活地运送至泰米尔那度马纳尔湾(Gulf of Mannar，Tamil Nadu)(9°17′N和78°8′E)。在三个不同地方(Thonithurai，Ervadi以及Krusadai岛)的栽植结果列在表6中。日生长率用下述公式计算：
r＝(Wt/W0)1/t×100，
式中r代表日生长率百分比，Wt是第t天的湿重，W0是最初的湿重。从表6可以看出海藻栽植的日生长率可以高达4.34％。
表6在印度泰米尔那度马纳尔湾三个不同地方在穿孔的聚乙烯袋中及筏上的江篱属藻类硬膜的栽植
                栽植方法
  Thonithurai   聚乙烯袋   筏_绳
  起始重量(09.01.′04)   250gm(10袋×25gm/袋)   1800gm(181.5m绳×100gm/绳)
  最终重量(23.02.′04)   883gm   5076gm
  DGR％/天   2.8   2.3
  Erwadi   聚乙烯袋   筏_绳
  起始重量(13.01.′04)   100gm(10袋×10gm/袋)   900gm(18绳×50gm/绳)
  最终重量(27.02.′04)   306gm   2318
  DGR％/天   2.5   2.1
  Krusadai岛   聚乙烯袋   筏_绳
  起始重量(12.01.′04)   100gm(10袋×10gm/袋)   800gm(16绳×50gm/绳)
  最终重量(26.02.′04)   692gm   11312gm
  DGR％/天   4.29   4.34
实施例8
如实施例7所述在Krusadai岛栽植的5kg鲜江篱属藻类硬膜晒干后获得的重量为795g。15g干海藻如实施例4所述那样处理，用10％NaOH预处理，制得2.84g(产率20％)产物，该产物的凝胶强度(1.0％凝胶；20℃)＞1920g/cm2，胶凝温度35℃，灰分含量0.9％。通过将该结果与实施例4中的相应数据比较可以看出，由栽植材料制得的琼脂的产率以及品质与天然海藻制得的琼脂的产率以及品质相同(见实施例4)。
本发明的优点
本发明的主要优点在于可以从印度水域的江篱属藻类硬膜生产具有所需规格的琼脂糖。
另一优点在于琼脂糖的产率基于干海藻重量高达20-23％。
另一优点在于贮存于环境条件下的塑料袋中的干海藻具有足够的保存期。
另一优点在于琼脂糖的制备可简单实施。
另一优点在于海藻适于在印度水域中栽植。

Claims (13)

1.一种具有下述特性的琼脂糖：
i.在大约20℃时的凝胶强度大约为1％(≥1900g/cm2)，
ii.胶凝温度为35-35.5℃，
iii.硫酸盐含量≤0.25％，并且
iv.灰分含量≤0.9％，
其特征在于，所述琼脂糖是通过一种简单、直接及划算的方法从天然的或栽植的江篱属藻类，特别是从江篱属藻类硬膜中制备的，所述方法包括如下步骤：
a.获取干的江篱属藻类海藻，
b.在25-95℃用大约35份(v/w)的大约为1-15％的碱预处理干的海藻0.5-5.0小时，
c.用水彻底冲洗预处理后的海藻以去除过量的碱，直至所示冲洗后海藻的pH在7-8之间，
d.按每一份未处理的海藻大约加入35份(v/w)的水的比例加入水，在温度115-125℃高压蒸煮1.5-2.0小时以获得提取物，
e.在温度85-95℃用大约0.05-0.07％的活性炭及大约10-15％的赛力特硅藻土处理前述提取物以获取热的提取物，
f.在赛力特硅藻土层上真空过滤前述热的提取物，
g.在大约-20℃将前述滤出液冻结成块12-15小时，然后将其解冻，
h.通过在高压釜中加热再溶解在大约25份水中的块，
i.如必要，重复前述冻结-解冻循环过程，
j.过滤步骤(i)中的产物以去除溶解后的液体，其后挤压以排出剩余的液体至可以获得琼脂糖的程度，以及
k.任选地再溶解前述固体，然后喷雾干燥以获得精细粉末。
2.根据权利要求1所述的琼脂糖，其特征在于，所述琼脂糖是从江篱属藻类，尤其是从江篱属藻类硬膜制得的。
3.根据权利要求1所述的琼脂糖，其特征在于，所述琼脂糖凝胶的融化温度在98-100℃之间。
4.一种简单、直接及划算的从天然的或栽植的江篱属藻类，特别是从江篱属藻类硬膜中制备具有高凝胶强度并且具有低胶凝温度琼脂糖的方法，所述方法包括如下步骤：
a.获取干的江篱属藻类海藻，
b.在25-95℃用大约35份(v/w)的大约为1-15％的碱预处理干的海藻0.5-5.0小时，
c.用水彻底冲洗预处理后的海藻以去除过量的碱，直至所示冲洗后海藻的pH值在7-8之间，
d.按每一份未处理的海藻大约加入35份(v/w)的水的比例加入水，在温度115-125℃高压蒸煮1.5-2.0小时以获得提取物，
e.在温度85-95℃用大约0.05-0.07％的活性炭及大约10-15％的赛力特硅藻土处理前述提取物以获取热的提取物，
f.在赛力特硅藻土层上真空过滤前述热的提取物，
g.在大约-20℃将前述滤出液冻结成块12-15小时，然后将其解冻，
h.通过在高压釜中加热再溶解在大约25份水中的块，
i.如必要，重复前述冻结-解冻循环过程，
j.过滤步骤(i)中的产物以去除溶解后的液体，其后挤压以排出剩余的液体至可以获得琼脂糖的程度，以及
k.任选地再溶解前述固体，然后喷雾干燥以获得精细粉末。
4.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述碱是氢氧化钠。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述碱的浓度约为10％。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(d)的高压蒸煮时间优选地约为1.5小时。
7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述琼脂糖的产率为干海藻重量的20-23％。
8.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，预处理海藻的温度优选约为85℃。
9.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，预处理海藻的时间优选约为2.0小时。
10.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，高压蒸煮的温度优选约为120℃。
11.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，活性炭的浓度约为0.06％。
12.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，赛力特硅藻土的浓度约为12.5％。
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