CN102432540A

CN102432540A - 双依达拉奉及其药用盐的制备与用途

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Publication number: CN102432540A
Application number: CN2011103053810A
Authority: CN
Inventors: 许佑君; 马占芝; 闫浩; 李志强; 李红亮; 刘宇; 卜平; 张磊
Original assignee: SHUANGDING PHARMACEUTICAL CO Ltd SHENYANG; Shenyang Pharmaceutical University
Current assignee: SHUANGDING PHARMACEUTICAL CO Ltd SHENYANG; Shenyang Pharmaceutical University
Priority date: 2011-10-11
Filing date: 2011-10-11
Publication date: 2012-05-02

Abstract

本发明属于药物合成技术领域，涉及一种制备双依达拉奉的新方法：在空气或氧气氛围下，苯肼与乙酰乙酸酯反应先生成依达拉奉，再氧化二聚化生成双依达拉奉，该法收率高，产品更易纯化；为增加双依达拉奉的溶解度，本发明还提供双依达拉奉的可溶性药用盐的制备方法，如：单钠盐、双钠盐、单钾盐、双钾盐、单锂盐、双锂盐；该盐能够发挥自由基清除剂的作用，临床可用于预防和治疗脑梗死。

Description

双依达拉奉及其药用盐的制备与用途

技术领域

本发明属于药物合成技术领域，涉及一种制备双依达拉奉的新方法：在空气或氧气氛围下，苯肼与乙酰乙酸酯反应先生成依达拉奉，再氧化二聚化生成双依达拉奉，该法收率高，产品更易纯化；为增加双依达拉奉的溶解度，本发明还提供其可溶性药用盐及其制备；该盐可发挥其自由基清除剂作用，临床可用于预防和治疗脑梗死。

背景技术

依达拉奉(Edaravone, 1)，化学名为3-甲基-1-苯基-2-吡唑啉-5-酮，是由日本东京三菱制药公司(Mitsubishi–Tokyo Pharmaceuticals Inc.)研制并开发的一种新型特效自由基清除剂。2001年4月日本厚生省批准该药用于治疗急性脑梗死。目前依达拉奉主要用于脑缺血的治疗。药效学研究表明，依达拉奉对动物模型和中风患者阻止局部缺血后的脑水肿和再灌注损伤有显著的效果。同时，它对大鼠心脏和人急性心肌梗塞局部缺血后的脑水肿和再灌注损伤伴随的心肌损伤有预防作用。依达拉奉主要通过促进前列腺素的生成而发挥抗氧化作用，依达拉奉能够抗缺血脑内的脂质过氧化、清除自由基、抑制自由基引起的脂质过氧化和细胞坏死，对脑缺血造成的脑损伤有确切的疗效。是治疗脑梗死的一线用药。

依达拉奉在合成和储存过程中，很容易产生双依达拉奉(Bisedaravone, 2)。研究发现，双依达拉奉也为良好的自由基清除剂，在治疗脑梗死方面有潜在临床价值。El Rady报道(Journal of the Chinese Chemical Society, 2004, 51(4), 859–62) 在2-氨基苯酚羟基苯胺、2-氨基苯硫酚或1,2-苯二胺作用下，3-亚硝基依达拉奉自身二聚化可合成双依达拉奉；Das等报道(Journal of the Indian Chemical Society, 1978,55(8), 829–831)以4-溴依达拉奉、乙酰乙酸乙酯和苯肼一起反应也可合成双依达拉奉。但是，这些方法均需多步反应方可制备双依达拉奉，合成路线长，收率和纯度偏低。

发明内容

本发明的目的，是提供一种双依达拉奉的制备方法；

本发明的另一目的，是提供一种双依达拉奉药用盐的制备方法。

采用的技术方案是：

一种双依达拉奉的制备方法：在空气或氧气氛围下，于特定溶剂中，苯肼与乙酰乙酸酯(MeCOCH₂COOR)反应先生成依达拉奉，再氧化二聚化直接生成双依达拉奉。所得的反应液中主要为双依达拉奉和少量的依达拉奉，但依达拉奉在回流状态时易溶于该特定溶剂，而双依达拉奉在此状态下溶解度较低，趁热抽滤，滤饼主要为双依达拉奉，经精制即可获得双依达拉奉，其纯度可达到98%以上。

由于该反应必须在空气或氧气氛围中进行，加入氧化剂能促进反应发生，氧化剂包括1,2-苯二醌、1,4-苯二醌和过氧化氢。

该反应中乙酰乙酸酯(MeCOCH₂COOR)中R为甲基、乙基、正丙基、异丙基、或苄基；

特定溶剂为水、醇性溶剂或醚性溶剂，醇性溶剂包括甲醇、乙醇、正丙醇或异丙醇，醚性溶剂包括1,4-二氧六环、1,2-二甲氧基乙烷或四氢呋喃，或上述溶剂的任意组合。

为提高双依达拉奉的水溶性，本发明还提供了该化合物的可接受的药用盐及其制备方法。其特征在于：

M₁包括钠盐、钾盐、或锂盐，M₂可以为M₁或氢；M₁或M₂优选钠盐或钾盐。

其中双依达拉奉的单钠、单钾、或单锂盐均具有较好的水溶

性和适宜的稳定性。而其二钠、二钾、或二锂盐均易吸潮，空气中放置易潮解，需选用适宜方式干燥及保存。

所述的双依达拉奉可接受药用盐的制备方法具体如下：

单盐制备时，以无机碱或有机碱与双依达拉奉于溶剂中成盐来制备相应的双依达拉奉的单盐。其投料摩尔比为双依达拉奉：碱=1.0:0.5~1.0，优选摩尔比为0.9~1.0；溶剂可为水、甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、正丁醇、异丁醇、1,4-二氧六环、1,2-二甲氧基乙烷、四氢呋喃、乙醚、异丙醚、丙酮、丁酮、乙腈或丙腈，或上述溶剂的任意组合，优选溶剂为水、甲醇、乙醇、异丙醇、丙酮、1,4-二氧六环、1,2-二甲氧基乙烷、四氢呋喃或乙腈的一种或几种。

双盐制备时，以单盐制备的类似方法，将双依达拉奉与无机碱或有机碱于溶剂中成盐来制备相应双依达拉奉的双盐，但其投料摩尔比为双依达拉奉：碱=1.0:1.5~3.0，优选摩尔比为1.8~2.0。

本发明提供的双依达拉奉药用盐具有自由基清除作用，临床可用于预防和治疗脑梗死。

一种优选的双依达拉奉的制备方法是：

在氧气氛围中、于回流状态下，将摩尔比为1.00 mol的乙酰乙酸乙酯116.1 g -130.1 g或摩尔比为1.00 mol的乙酰乙酸甲酯116.1 g快速滴加至摩尔比为1.05 mol的苯肼113.5 g与无水乙醇150 mL的混和液中，边滴加边搅拌，很快析出固体；加毕，继续搅拌回流反应6 h-8 h，趁热抽滤，分别用50 mL无水乙醇洗3次，滤饼经干燥，得淡黄色粉末状固体，为双依达拉奉粗品；以无水乙醇1500 mL重结晶，并以活性炭脱色，得白色粉末状固体197.1 g -229.7 g，即得双依达拉奉，收率为56.9%-66.3%。

采用本发明方法制备双依达拉奉，收率高，产品更易纯化；为增加双依达拉奉的溶解度，本发明还提供双依达拉奉可溶性药用盐及其制备；该盐能够发挥自由基清除的作用，临床可用于预防和治疗脑梗死。

具体实施方式

双依达拉奉的制备

实施例1

一种双依达拉奉的制备方法，是在氧气氛围中、于回流状态下，将乙酰乙酸乙酯130.1 g(1.00 mol)快速滴加至苯肼113.5 g(1.05 mol)与无水乙醇150 mL的混和液中，注意边滴加边搅拌，很快析出固体。加毕，继续搅拌回流反应6 h。趁热抽滤，无水乙醇(50 mL×3)洗，滤饼经干燥，得淡黄色粉末状固体，为双依达拉奉粗品。以无水乙醇1500 mL重结晶，并以活性炭脱色，得白色粉末状固体229.7 g，收率为66.3%。

实施例2

一种双依达拉奉的制备方法，是在氧气氛围中、于回流状态下，将乙酰乙酸甲酯116.1 g(1.00 mol)快速滴加至苯肼113.5 g(1.05 mol)与无水乙醇150 mL的混和液中，注意边滴加边搅拌，很快析出固体。加毕，继续搅拌回流反应6 h。趁热抽滤，无水乙醇(50 mL×3)洗，滤饼经干燥，得淡黄色粉末状固体，为双依达拉奉粗品。以无水乙醇1500 mL重结晶，并以活性炭脱色，得白色粉末状固体215.1 g，收率为62.1%。

实施例3

一种双依达拉奉的制备方法，是在氧气氛围中、于回流状态下，将乙酰乙酸乙酯130.1 g(1.00 mol)快速滴加至苯肼113.5 g(1.05 mol)与无水甲醇150 mL的混和液中，注意边滴加边搅拌，很快析出固体。加毕，继续搅拌回流反应8 h。趁热抽滤，无水甲醇(50 mL×3)洗，滤饼经干燥，得淡黄色粉末状固体，为双依达拉奉粗品。以无水乙醇1500 mL重结晶，并以活性炭脱色，得白色粉末状固体203.0 g，收率为58.6%。

实施例4

一种双依达拉奉的制备方法，是在氧气氛围中、于回流状态下，将乙酰乙酸甲酯116.1 g(1.00 mol)快速滴加至苯肼113.5 g(1.05 mol)与无水甲醇150 mL的混和液中，注意边滴加边搅拌，很快析出固体。加毕，继续搅拌回流反应8 h。趁热抽滤，无水甲醇(50 mL×3)洗，滤饼经干燥，得淡黄色粉末状固体，为双依达拉奉粗品。以无水乙醇1500 mL重结晶，并以活性炭脱色，得白色粉末状固体197.1 g，收率为56.9%。

实施例5

一种双依达拉奉的制备方法，是在氧气氛围中、于回流状态下，将乙酰乙酸乙酯130.1 g(1.00 mol)快速滴加至苯肼113.5 g(1.05 mol)与异丙醇150 mL的混和液中，注意边滴加边搅拌，很快析出固体。加毕，继续搅拌回流反应8 h。趁热抽滤，异丙醇(50 mL×3)洗，滤饼经干燥，得淡黄色粉末状固体，为双依达拉奉粗品。以无水乙醇1500 mL重结晶，并以活性炭脱色，得白色粉末状固体216.8 g，收率为62.6%。

实施例6

一种双依达拉奉的制备方法，是在氧气氛围中、于回流状态下，将乙酰乙酸甲酯116.1 g(1.00 mol)快速滴加至苯肼113.5 g(1.05 mol)与异丙醇150 mL的混和液中，注意边滴加边搅拌，很快析出固体。加毕，继续搅拌回流反应8 h。趁热抽滤，异丙醇(50 mL×3)洗，滤饼经干燥，得淡黄色粉末状固体，为双依达拉奉粗品。以无水乙醇1500 mL重结晶，并以活性炭脱色，得白色粉末状固体211.3 g，收率为61.0%。

双依达拉奉单钠盐的制备

实施例7

一种双依达拉奉单钠盐的制备方法，是在室温、搅拌下，将双依达拉奉34.6 g(0.10 mol)分散于无水甲醇200 mL中，缓慢滴入含28.5%甲醇钠的甲醇溶液19.0 g(0.10 mol)，反应液逐渐澄清，过滤除去机械杂质，滤液升温至回流，搅拌下缓慢向其中滴加四氢呋喃200 mL，逐渐析出固体，自然降至室温。过滤，四氢呋喃(50 mL×2)洗涤滤饼，干燥得白色粉末状固体26.6 g，收率72.2%。

实施例8

一种双依达拉奉单钠盐的制备方法，是在室温、搅拌下，将双依达拉奉34.6 g(0.10 mol)分散于无水甲醇200 mL中，缓慢滴入含28.5%甲醇钠的甲醇溶液19.0 g(0.10 mol)，反应液逐渐澄清，过滤除去机械杂质，滤液升温至回流，搅拌下缓慢向其中滴加1,2-二甲氧基乙烷200 mL，逐渐析出固体，自然降至室温。过滤，1,2-二甲氧基乙烷(50 mL×2)洗涤滤饼，干燥得白色粉末状固体27.6 g，收率75.0%。

实施例9

一种双依达拉奉单钠盐的制备方法，是在室温、搅拌下，将双依达拉奉34.6 g(0.10 mol)分散于无水乙醇200 mL中，缓慢滴入含28.5%甲醇钠的甲醇溶液19.0 g(0.10 mol)，反应液逐渐澄清，过滤除去机械杂质，滤液升温至回流，搅拌下缓慢向其中滴加四氢呋喃200 mL，逐渐析出固体，自然降至室温。过滤，四氢呋喃(50 mL×2)洗涤滤饼，干燥得白色粉末状固体26.0 g，收率70.5%。

实施例10

一种双依达拉奉单钠盐的制备方法，是在室温、搅拌下，将双依达拉奉34.6 g(0.10 mol)分散于异丙醇200 mL中，缓慢滴入含28.5%甲醇钠的甲醇溶液19.0 g(0.10 mol)，反应液逐渐澄清，过滤除去机械杂质，滤液升温至回流，搅拌下缓慢向其中滴加四氢呋喃200 mL，逐渐析出固体，自然降至室温。过滤，四氢呋喃(50 mL×2)洗涤滤饼，干燥得白色粉末状固体24.6 g，收率66.9%。

实施例11

一种双依达拉奉单钠盐的制备方法，是在室温、搅拌下，将双依达拉奉34.6 g(0.10 mol)分散于蒸馏水200 mL中，缓慢滴入2.0 mol/L氢氧化钠水溶液50.0 mL(0.10 mol)，反应液逐渐澄清，过滤除去机械杂质。滤液减压浓缩至干，残余物分散溶于热的无水乙醇200 mL中之后，搅拌下缓慢向其中滴加四氢呋喃200 mL，逐渐析出固体，自然降至室温。过滤，四氢呋喃(50 mL×2)洗涤滤饼，干燥得白色粉末状固体27.1 g，收率73.6%。

双依达拉奉双钠盐的制备

实施例12

一种双依达拉奉双钠盐的制备方法，是在室温、搅拌下，将双依达拉奉34.6 g(0.10 mol)分散于无水甲醇200 mL中，缓慢滴入含28.5%甲醇钠的甲醇溶液38.0 g(0.20 mol)，反应液逐渐澄清，过滤除去机械杂质。滤液升温至回流，搅拌下缓慢向其中滴加四氢呋喃200 mL，逐渐析出固体，自然降至室温。过滤，四氢呋喃(50 mL×2)洗涤滤饼，干燥得白色粉末状固体30.6 g，收率78.3%。

实施例13

一种双依达拉奉双钠盐的制备方法，是在室温、搅拌下，将双依达拉奉34.6 g(0.10 mol)分散于无水乙醇200 mL中，缓慢滴入含28.5%甲醇钠的甲醇溶液38.0 g(0.20 mol)，反应液逐渐澄清，过滤除去机械杂质，滤液升温至回流，搅拌下缓慢向其中滴加四氢呋喃200 mL，逐渐析出固体，自然降至室温。过滤，四氢呋喃(50 mL×2)洗涤滤饼，干燥得白色粉末状固体29.7 g，收率76.2%。

实施例14

一种双依达拉奉双钠盐的制备方法，是在室温、搅拌下，将双依达拉奉34.6 g(0.10 mol)分散于异丙醇200 mL中，缓慢滴入含28.5%甲醇钠的甲醇溶液38.0 g(0.20 mol)，反应液逐渐澄清，过滤除去机械杂质，滤液升温至回流，搅拌下缓慢向其中滴加四氢呋喃200 mL，逐渐析出固体，自然降至室温。过滤，四氢呋喃(50 mL×2)洗涤滤饼，干燥得白色粉末状固体28.7 g，收率73.5%。

双依达拉奉单钾盐的制备

实施例15

一种双依达拉奉单钾盐的制备方法，是在室温、搅拌下，将双依达拉奉34.6 g(0.10 mol)分散于无水甲醇200 mL中，缓慢滴入含叔丁醇钾11.2 g(0.10 mol)的无水甲醇溶液50 mL，反应液逐渐澄清，过滤除去机械杂质，滤液升温至回流，搅拌下缓慢向其中滴加四氢呋喃200 mL，逐渐析出固体，自然降至室温。过滤，四氢呋喃(50 mL×2)洗涤滤饼，干燥得白色粉末状固体25.3 g，收率65.7%。

实施例16

一种双依达拉奉单钾盐的制备方法，是在室温、搅拌下，将双依达拉奉34.6 g(0.10 mol)分散于异丙醇200 mL中，缓慢滴入含叔丁醇钾11.2 g(0.10 mol)的异丙醇溶液50 mL，反应液逐渐澄清，过滤除去机械杂质，滤液升温至回流，搅拌下缓慢向其中滴加四氢呋喃200 mL，逐渐析出固体，自然降至室温。过滤，四氢呋喃(50 mL×2)洗涤滤饼，干燥得白色粉末状固体26.5 g，收率68.9%。

双依达拉奉双钾盐的制备

实施例17

一种双依达拉奉双钾盐的制备方法，是在室温、搅拌下，将双依达拉奉34.6 g(0.10 mol)分散于无水甲醇200 mL中，缓慢滴入含叔丁醇钾22.4 g(0.20 mol)的无水甲醇溶液60 mL，反应液逐渐澄清，过滤除去机械杂质，滤液升温至回流，搅拌下缓慢向其中滴加四氢呋喃200 mL，逐渐析出固体，自然降至室温。过滤，四氢呋喃(50 mL×2)洗涤滤饼，干燥得白色粉末状固体29.2 g，收率69.1%。

双依达拉奉单锂盐的制备

实施例18

一种双依达拉奉单锂盐的制备方法，是在室温、搅拌下，将双依达拉奉34.6 g(0.10 mol)分散于异丙醇200 mL中，缓慢滴入含叔丁醇锂8.0 g(0.10 mol)的异丙醇溶液50 mL，反应液逐渐澄清，过滤除去机械杂质，滤液升温至回流，搅拌下缓慢向其中滴加四氢呋喃200 mL，逐渐析出固体，自然降至室温。过滤，四氢呋喃(50 mL×2)洗涤滤饼，干燥得白色粉末状固体21.5 g，收率60.9%。

实施例19

一种双依达拉奉单锂盐的制备方法，是在室温、搅拌下，将双依达拉奉34.6 g(0.10 mol)分散于无水甲醇200 mL中，缓慢滴入含叔丁醇锂8.0 g(0.10 mol)的无水甲醇溶液50 mL，反应液逐渐澄清，过滤除去机械杂质，滤液升温至回流，搅拌下缓慢向其中滴加四氢呋喃200 mL，逐渐析出固体，自然降至室温。过滤，四氢呋喃(50 mL×2)洗涤滤饼，干燥得白色粉末状固体22.8 g，收率64.6%。

双依达拉奉双锂盐的制备

实施例20

一种双依达拉奉双锂盐的制备方法，是在室温、搅拌下，将双依达拉奉34.6 g(0.10 mol)分散于无水甲醇200 mL中，缓慢滴入含叔丁醇锂16.0 g(0.20 mol)的无水甲醇溶液60 mL，反应液逐渐澄清，过滤除去机械杂质，滤液升温至回流，搅拌下缓慢向其中滴加四氢呋喃200 mL，逐渐析出固体，自然降至室温。过滤，四氢呋喃(50 mL×2)洗涤滤饼，干燥得白色粉末状固体23.5 g，收率65.6%。

双依达拉奉单钠盐的初步药效学

实验实施例1

双依达拉奉单钠盐抗脑缺血实验

取健康昆明种小白鼠50只，雌雄各半，按体重、性别均衡分成5组，每组10只。即空白对照组，双依达拉奉单钠盐受试药低、中、高剂量组(4.5, 9.0, 18.0 mg/g)，依达拉奉阳性对照组(9.0 mg/kg)，每天腹腔注射给药1次，空白对照组腹腔注射同体积生理盐水，连续给药7天，末次给药1 h，将小鼠置于装有10 g钠石灰的250 mL密闭广口瓶中。记录小鼠呼吸停止时间，即存活时间。结果见Table 1。

结果表明，双依达拉奉单钠盐中、高剂量组均可延长常压耐缺氧小鼠存活时间，提高小鼠耐缺氧能力。低剂量组虽然有延长小鼠存活时间的趋势，但无显著性差异。

表 1. 双依达拉奉单钠盐对小鼠常压耐缺氧存活时间的影响(

±SE)

^* P<0.05，^** P<0.01，与空白对照组比较

实验实施例2

小鼠全脑缺血实验

实验动物分组及给药方式同实施例21。末次给药1 h，迅速从小鼠双耳后颈部断头，依双盲法观察记录小鼠喘息次数和喘息时间。结果见Table 2。

脑细胞对缺血缺氧的耐受性极低，血流一旦阻断，6 s内神经元代谢即受影响，从而导致一系列脑损伤反应，引起神经元发生不可逆损害。本实验通过小鼠急性全脑缺血实验，观察小鼠断头后喘气次数和喘息时间。小鼠断头后，脑供血中断，由于脑组织内尚存有一定营养物质，其功能尚能保持一定时间，这反映在小鼠有规律的张嘴喘气上，当能量耗至一定程度，活动终止。实验结果表明双依达拉奉单钠盐高剂量能够显著延长小鼠喘气时间，即脑功能维持时间增加。

表 2. 双依达拉奉单钠盐对小鼠断头缺氧的影响(

±SE)

^* P<0.05，^** P<0.01，与空白对照组比较

实验实施例3

小鼠结扎双侧颈总动脉及迷走神经实验

实验动物分组及给药方式同实施例21。末次给药1 h，水合氯醛麻醉，分离并结扎双侧颈总动脉和迷走神经。观察小白鼠的存活时间(每分钟呼吸少于或等于5次为死亡)。当将带迷走神经的双侧颈总动脉一起结扎时，则迷走神经因受刺激引起血压下降，造成急性脑缺血。实验结果表明双依达拉奉单钠盐高剂量能够显著延长小鼠存活时间，中、低剂量组也有延长小鼠存活时间的趋势，但无显著性差异，结果见表 3。

表 3. 双依达拉奉单钠盐对小鼠结扎双侧颈总动脉和迷走神经存活时间的影响(±SE)

^* P<0.05，与空白对照组比较

实验实施例4

双依达拉奉单钠盐对大鼠急性不完全脑缺血模型的保护作用

① 双依达拉奉钠盐对大鼠急性不完全脑缺血模型脑水肿和脑指数的影响

将60只雄性Wistar大鼠按体重随机分为6组，每组10只，即假手术对照组、模型组、阳性药组(依达拉奉6 mg/kg) 双依达拉奉单钠盐受试药高(12 mg/kg)、中(6 mg/kg)、低(3 mg/kg)剂量组。各组动物每天1次腹腔注射给药，假手术对照组、模型组每天腹腔注射等容积生理盐水。于第7天末次给药1 h后，用10%水合氯醛300 mg/kg腹腔注射麻醉，用丝线双重结扎双侧颈总动脉造成急性实验性不完全脑缺血模型，假手术组不结扎动脉。结扎大鼠双侧颈总动脉6 h后，断头，开颅取脑，称脑湿重，计算脑指数(脑指数=脑重×100/体重)。然后在110 ^oC烤箱中烤至恒重，计算脑含水量%=(湿重−干重)/湿重×100%。结果见表 4。

表 4. 双依达拉奉单钠盐对脑含水量及脑指数的影响(

±SE)

^## P<0.01，与假手术组比较；^* P<0.05，^** P<0.01，与模型组比较

脑水肿是脑缺血的必然表现，缺血、缺氧可通过多种途径导致脑水肿。由表 3可见，与假手术组相比较，模型组脑含水量显著增加；与模型组相比较，双依达拉奉单钠盐三个剂量组和阳性药依达拉奉组脑含水量均显著降低(P<0.01)。与假手术组相比，模型组脑指数显著升高(P<0.01)；与模型组相比较，双依达拉奉单钠盐三个剂量组和阳性药依达拉奉组脑指数显著降低(P<0.05)。表明双依达拉奉单钠盐可在一定程度上改善脑缺血所致脑水肿。

② 双依达拉奉钠盐对大鼠急性不完全脑缺血损伤脑组织SOD、MDA及NO的作用

分组和给药方式同①。于第7天末次给药1 h后，用10%水合氯醛300 mg/kg腹腔注射麻醉，用丝线双重结扎双侧颈总动脉造成急性实验性不完全脑缺血模型，假手术组不结扎动脉。结扎大鼠双侧颈总动脉6 h后，断头取脑，用4 ^oC生理盐水制成10%的匀浆液。4 ^oC、3000 r/min离心10 min，取上清液按试剂盒使用说明测定SOD、MDA及NO。

③ 双依达拉奉钠盐对大鼠急性不完全脑缺血损伤的脑组织形态学观察

分组和给药方式同①。于第7天末次给药1 h后，用10%水合氯醛300 mg/kg腹腔注射麻醉，用丝线双重结扎双侧颈总动脉造成急性实验性不完全脑缺血模型，假手术组不结扎动脉。结扎大鼠双侧颈总动脉6 h后，断头取脑，脑组织经4%甲醛溶液固定后，冠状切取大脑，常规脱水，石蜡包埋制片，HE染色，光镜下观察病理改变，结果见表 5。

表 5. 双依达拉奉单钠盐对大鼠急性不完全脑缺血SOD、MDA及NO的影响(

±SE)

^## P<0.01, 与假手术组比较；^* P<0.05, ^** P<0.01,与模型组比较

MDA作为自由基引发的脂质过氧化反应的代谢产物，其含量多少直接反应自由基损伤程度。结果表明：与假手术组比较，模型组的MDA含量显著升高(P<0.01)；与模型组比较，依达拉奉阳性对照组和双依达拉奉单钠盐高、中剂量组均能降低模型组的MDA含量(P<0.01)。

SOD是体内非常重要的氧自由基清除剂，对于保护细胞不受毒性氧自由基损伤有重要作用。结果表明：与假手术组比较，模型组SOD的含量显著降低(P<0.01)。与模型组比较，依达拉奉阳性对照组和双依达拉奉单钠盐高、中剂量组均能显著升高模型组的SOD含量(P<0.01, P<0.01和P<0.05)。

NO是兼有第二信使功能和细胞毒性作用的气体物质。实验结果表明，与假手术组比较，模型组的NO含量显著升高(P<0.01)，说明大鼠脑缺血后神经细胞产生大量的NO，导致神经毒性作用；与模型组比较，依达拉奉阳性对照组和双依达拉奉单钠盐高、中剂量组均能降低模型组的NO含量(P<0.05)。

上述结果提示，双依达拉奉单钠盐保护脑缺血的机制可能与其减少缺血性脑组织NO的生成，减轻NO介导的神经毒性作用，提高自由基清除酶的活性，抑制脂质过氧化反应，从而对缺血性的脑组织损伤起保护性作用有关。

双依达拉奉单钠盐对颈总动脉双侧结扎大鼠脑组织病理切片(HE染色, ×200)病理结果显示，假手术对照组大鼠脑组织神经细胞正常，核膜清楚。模型组大鼠的脑组织发生明显的病理性改变，神经细胞减少，整个胞体变小，染色明显浅，并有严重损伤的坏死中心区，血管扩张，周围间隙扩大。依达拉奉阳性对照组和双依达拉奉单钠盐三个剂量组的脑细胞水肿程度减轻，且中、高剂量组效果较好。

综上所述，双依达拉奉单钠盐对脑缺氧、缺血、脑水肿具有明显的保护作用。可改善脑能量代谢障碍，降低脑能耗，提高小鼠耐缺氧能力，这些作用可能和抑制脂质过氧化反应和提高机体抗氧化能力有关。

Claims

1.一种双依达拉奉的制备方法，其特征在于：

是在空气或氧气氛围下，在特定溶剂中，苯肼与乙酰乙酸酯MeCOCH₂COOR反应先生成依达拉奉，再氧化二聚化直接生成双依达拉奉；

所述特定溶剂为水、醇性溶剂或醚性溶剂；醇性溶剂包括甲醇、乙醇、正丙醇或异丙醇，醚性溶剂包括1,4-二氧六环、1,2-二甲氧基乙烷或四氢呋喃，或上述溶剂的任意组合。

2.如权利要求1所述的双依达拉奉的制备方法，其特征在于：所用原料乙酰乙酸酯中R为甲基、乙基、正丙基、异丙基或苄基。

3.如权利要求1所述的双依达拉奉的制备方法，其特征在于：在空气或氧气氛围中加入氧化剂能够促进该反应进行，氧化剂包括1,2-苯二醌、1,4-苯二醌和过氧化氢。

4.如权利要求1所述的双依达拉奉的制备方法，其特征在于：在氧气氛围中、于回流状态下，将摩尔比为1.00 mol的乙酰乙酸乙酯116.1 g -130.1 g或摩尔比为1.00 mol的乙酰乙酸甲酯116.1 g快速滴加至摩尔比为1.05 mol的苯肼113.5 g与无水乙醇150 mL的混和液中，边滴加边搅拌，很快析出固体；加毕，继续搅拌回流反应6 h-8 h，趁热抽滤，分别用50 mL无水乙醇洗3次，滤饼经干燥，得淡黄色粉末状固体，为双依达拉奉粗品；以无水乙醇1500 mL重结晶，并以活性炭脱色，得白色粉末状固体197.1 g -229.7 g，即得双依达拉奉，收率为56.9%-66.3%。

5.根据权利要求4所述的一种双依达拉奉的制备方法，其特征在于：采用该法制备的双依达拉奉与无机碱或有机碱于溶剂中成盐制成双依达拉奉单盐，其投料摩尔比为双依达拉奉：碱=1.0:0.5~1.0，优选摩尔比为0.9~1.0；溶剂为水、甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、正丁醇、异丁醇、1,4-二氧六环、1,2-二甲氧基乙烷、四氢呋喃、乙醚、异丙醚、丙酮、丁酮、乙腈或丙腈，或上述溶剂的任意组合。

6.根据权利要求4所述的一种双依达拉奉的制备方法，其特征在于：采用该法制备的双依达拉奉与无机碱或有机碱于溶剂中成盐制成双依达拉奉双盐，其投料摩尔比为双依达拉奉：碱=1.0:1.5~3.0，优选摩尔比为1.8~2.0。

7.根据权利要求5所述的一种双依达拉奉的制备方法，其特征是用该法制备得的双依达拉奉制备成双依达拉奉单盐的方法是：在室温、搅拌下，取用该法制备的摩尔比为0.10 mol的双依达拉奉34.6 g，分散于无水甲醇200 mL、异丙醇200 mL或蒸馏水200 mL中，缓慢滴入摩尔比为0.10mol的含28.5%甲醇钠的甲醇溶液19.0 g或摩尔比为0.10mol的2.0 mol/L氢氧化钠水溶液50.0 mL，反应液逐渐澄清，过滤除去机械杂质，滤液升温至回流，搅拌下缓慢向其中滴加四氢呋喃200 mL或1,2-二甲氧基乙烷200 mL，逐渐析出固体，自然降至室温；过滤，分别用四氢呋喃50 mL洗涤滤饼两次或1,2-二甲氧基乙烷200 mL洗涤滤饼，干燥得白色粉末状固体24.6 g-27.6 g，即得双依达拉奉单盐，收率66.9%-75.0%。

8.根据权利要求6所述的一种双依达拉奉的制备方法，其特征是用该法制成的双依达拉奉制备双依达拉奉双盐的方法是：在室温、搅拌下，取用该法制备的摩尔比为0.10 mol的双依达拉奉34.6 g，分散于无水甲醇200 mL、无水乙醇200 mL或异丙醇200 mL中，缓慢滴入摩尔比为0.20mol的含28.5%甲醇钠的甲醇溶液38.0 g，反应液逐渐澄清，过滤除去机械杂质；滤液升温至回流，搅拌下缓慢向其中滴加四氢呋喃200 mL，逐渐析出固体，自然降至室温；过滤，分别用四氢呋喃50 mL洗涤滤饼两次，干燥得白色粉末状固体28.7 g-30.6 g，即得双依达拉奉双盐，收率73.5 g-78.3%。

9.根据权利要求5或6所述的一种双依达拉奉的制备方法，其特征在于用该法制成的双依达拉奉，再制得双依达拉奉药用盐能作为自由基清除剂，临床可用于预防和治疗脑梗死。