CN102428093A

CN102428093A - 基于吉西他滨结构的前药及其合成方法及应用

Info

Publication number: CN102428093A
Application number: CN2010800179647A
Authority: CN
Inventors: 薛晓霞; 李刚; 孙昌俊; 李文保
Original assignee: Sanlugen Pharmatech Ltd
Current assignee: Sanlugen Pharmatech Ltd
Priority date: 2009-04-21
Filing date: 2010-03-25
Publication date: 2012-04-25
Also published as: EP2423215A4; US20120088908A1; WO2010121486A1; EP2423215A1; IL215792A0; US8653048B2; CA2759474A1; JP2012524113A; CN101525361A; CN101525361B

Abstract

本发明公开如式(I)所示的基于吉西他滨结构的前药及其合成方法和应用，其中a、b、c、d、E、Z、V基团定义如本申请说明书中所定义。本发明通过N⁴位修饰增加前药的溶解度、生物利用度以及器官特异性，所生成的前药化合物可以克服代谢快的问题，降低吉西他滨引发的肠毒性，使之在临床上能用于口服，以及能更好地改善抗肿瘤、抗癌、抗感染和防扩散能力，并能够特异性地作用于肝脏或结肠。合成方法步骤简单，适宜工业化生产。

Description

基于吉西他滨结构的前药及其合成方法及应用

技术领域

本发明属于核苷类药物领域，涉及基于吉西他滨结构的前药、其合成方法，以及治疗各种癌症及相关疾病有关的应用。

背景技术

据 WHO的统计数字显示， 2007年全球新确诊的肿瘤病人多达 1200万人，而过去几年来全球每年死于癌症的病人高达 700万人以上。这一数字已与死于急性心血管病的人数非常接近。癌症即将成为世界死亡人数最多的疾病。

核苷类药物，如阿糖胞苷、吉西他滨、地西他滨、氮杂胞苷、克拉屈滨、氟达拉滨、安妥明、奈拉滨、 6-氮尿苷及噻唑呋林等己被广泛用于治疗各种癌症。同时核苷类药物中有很多种处于临床研究阶段，如 4， -thio-f luoro-ara-C, 2' - deoxy - 2， -f luoromethylcytidine, 4， -thio-ara-C, 和 3， -ethynylcytidine (ECYD)。

盐酸吉西他滨（Gemcitabine Hydrochloride)，化学名为 2-脱氧- 2, 2-二氟胞苷盐酸盐，是美国 Eli Lilly公司研发的嘧啶核苷类似物， 1995年在澳大利亚、芬兰等国上市，商品名 Gemzar, 中文商品名为健择。盐酸吉西他滨是细胞周期特异性抗代谢类药物，主要作用于 DNA合成期的肿瘤细胞，即 S期细胞，在一定条件下，可以阻止 G1期向 S期的进展。吉西他滨作为一种前药在细胞内是脱氧胸苷激酶磷酸化的良好底物，在酶的作用下转化成下列代谢物：吉西他滨一磷酸盐（dFdCMP)、吉西他滨二磷酸盐（dFdCDP) 和吉西他滨三磷酸盐 ( dFdCTP), 其中 dFdCDP和 dFdCTP为活性产物。 dFdCDP抑制核糖核苷酸还原酶，从而减少 DNA合成修复所需的脱氧核苷酸的量。盐酸吉西他滨适应于非小细胞肺癌、胰腺癌、膀胱癌、乳腺癌及其他实体肿瘤的治疗。鉴于吉西他滨引发的肠毒性及其低生物利用度，在临床上吉西他滨仅能用于静注，而不能口服。

5-FU (5-氟脲嘧啶）是治疗晚期结直肠癌的基础药物，吉西他滨可促进 5- FU与其靶点（胸苷酸合成酶)结合，增强后者抑制 DNA合成的效应。结肠癌是结肠的恶性上皮性肿瘤。在欧洲、北美洲和澳大利亚是最常见的恶性肿瘤之一，结肠癌占癌症死亡原因的第 2位；非洲、亚洲和南美洲发病率较低，但随着生活方式的西化，其发病率也在增加。

然而，鉴于其在肝中会很快失活，盐酸吉西他滨还不能用以治疗肝癌。

肝癌是全球第三位癌症死亡原因。肝细胞癌的危险因素包括 HBV或 HCV。在世界范围内， HBV被认为引起了 60%-80%的肝细胞癌。长期以来缺乏有效的治疗药物，晚期肝癌至今还没有标准治疗方案。阿霉素据报道是使用最广泛的药物，但是只有 1项包括 60名患者的随机对照试验支持它的用处。阿霉素可以引起致死并发症的几率高达 25%。米托葸醌是经批准的肝细胞癌治疗用药,但却不认为是治疗肝细胞癌的特效药物。

2007年美国临床肿瘤学第 43届年会上发布的 Sorafenib--肝细胞癌用药评估方案（SHARP) 临床试验结果引起了轰动。该研究结果使 Sorafenib成为第一个被证实对晚期肝细胞癌能改善生存的药物，该研究结果有可能改写晚期肝癌一线标准治疗方案的历史。鉴于肝功能的特异性，核苷类药物在肝脏中会很快代谢成非活性成分而失活；到目前为止，还没有一种核苷类药物能用以治疗肝癌。美国 Metabasis 公司已研究出一种直接在肝中酶解的技术，即通过在肝中酶解环磷酸的前体药的方法，成功的用于非环状及一些环状抗病毒或抗肿瘤核苷类化合物的临床研究。其中阿糖胞苷前药正在进行临床抗肝癌评估 (US2005/0101775; Mark Erion et al. , J. Am. Chem. Soc. 2004, 126, 5154-5163)。然而， Metabasis公司的工作仅限于胞嘧啶 0⁵位上的环磷酸化。

肝靶向性的核苷类前药具有以下特点：

a)具有肝脏特异性，可以靶向治疗肝癌； b) 加快体内磷酸化控速步骤，增强作用效果； c) 改善吸收、渗透、稳定性等理化性质，改善 PK性能； d) 降低核苷类药物本身的副作用，并不产生附加的毒性。

然而，鉴于癌细胞普遍存在的抗药性，以及人们对新抗癌药物的迫切需要；从不同角度研究安全可靠的抗癌药物以改善人类健康仍然迫在眉睫。具有器官特异性的核苷类前药即为最有前景的新方法之一。

核苷类前药是减少抗癌药物副作用的最有前景的新方法。抗癌药物的前药到达作用器官后，在酶的作用下转化成有活性的化合物发挥疗效。人们已研究出卡培他滨和依诺他滨等前药来克服核苷类药物的不足。现在很多制药公司仍在积极的调查研究其它前药治疗癌症的方法 (G. Xu， H. L. McLeod, Clin. Cancer Res. , 2001, 7, 3314 - 3324 ; M. Rooseboora, J. N. M. Commandeur, N. P. E. Vermeulen, Pharmacol. Rev. , 2004, 56, 53—102 ; W. D. Wu, J. Sigmond, G. J. Peters, R. F. Borch, J. Med. Chem. 2007, 50, 3743—3746)。

专利 W02005025552和 W02006030217中，用羧酸酯基保护吉西他滨糖环 5' -0H，合成了一系列前药。其中既有单羧酸酯基，又有双羧酸酯基，通式为 ^V— °")^n_eCXHI")^m_D， V-(L)_n-COO-(L)_P-COO-(L)_m-D _? 式中 _D为具有活性的药物成分， n， m, p为 0或 1， L为 C_1-2。的碳链，优选的为 1-10，更优选的为 1-3， L为（CH₂) _q, q为 1-3或更大。 V为保护链的末端， V可以是代谢过程中可以断裂的基团或原子，范围很广。 Song等报道了用氨基酸酯基保护吉西他滨糖环 5' -OH (Song, X. et al. Mol Pharmaceutics 2004, 2， 157-167)。 Wu等报道了用磷酸胺基保护吉西他滨糖环 5' -0H ( W. D. Wu, J. Sigmond, G. J. Peters, R. F. Borch, J. Med. Chem. 2007, 50, 3743-3746)；新近，专利 W02009/053654中，用磷酸酯基保护吉西他滨糖环 5' - 0H。专利 W098/32762, W004/041203, 和 W02006098628及 US2007225248中则用饱和和不饱和羧酸酯同时保护 0³， 0⁵及 N⁴，并进行了生物学试验。

新近，美国 El i Lilly公司报道了用支链羧酸胺基保护的吉西他滨 N⁴前药， LY2334737 ( W02006/065525, W02007/149891, Bender, D. et al. J. Med. Chem. 2009, 52， 6958-6961)，已进入临床试验，但其肠毒性副作用仍未完全解决。

到目前为止，尚未发现用环状二元羧酸基（包括酯基，酰胺基，羧基等）保护吉西他滨 N⁴的专利或其他文献报道。发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一种基于吉西他滨结构的前药，及基于吉西他滨结构的前药的制备方法。本发明的吉西他滨作为核苷类抗癌药物前药的结构基础；一方面研发可以克服其在肺癌细胞或胰腺癌细胞中存在的抗药性问题，另一方面进一步通过 N⁴ 位修饰增加其溶解度，生物利用度以及器官特异性，所生成的前药化合物可以克服其代谢快的问题，降低吉西他滨引发的肠毒性并提高其生物利用度，使之在临床上能用于口服。

本发明提供一种基于吉西他滨结构的前药，其结构通式如式（I ) 所示：

( I )

其中， a=0〜6的整数； b=0〜6的整数； c = l〜18的整数， d= l〜4的整数； E为 5— 6元环的烃基、含 1一 4个杂原子的 5— 6元环环垸基、芳基或杂芳基。所述杂原子选自 0、 1^或5。

环上的连接位置可以是化学上允许的任何相对位置。环上可以没有取代基，也可以有一个或多个取代基。取代基可以在环上化学上可以存在的任何位置。

Z选自 0、！^或5。

V选自氢、烃基、烷氧基、酯基、卤素、酰胺基、氨基或取代氨基。

优选的， E选自下列结构中的一种：

优选的， a=0或 1， b=0或 1， Z为 0或 N， c = 10- 16， d= l或 2; 优选的， V选自氢或烃基。

具有代表性的吉西他滨前药衍生物的合成路线如下-

本发明还提供所述的基于吉西他滨结构的前药的合成方法，包括下列步骤：

1) 将酸酐或酰氯与醇或胺按照酸酐或酰氯：醇或胺 =1: 1〜1： 1.5 摩尔比的比例直接混合或溶于有机溶剂中，在室温至反应物熔融温度反应 2〜8小时，得到相应的取代的酸；

2) 吉西他滨盐酸盐、步骤 1) 得到的取代的酸、六氟磷酸苯并三唑 -1-氧基三吡咯烷基磷和 4- 二甲氨基吡啶按照 1: (1〜2)： (0.9〜1.5)： (1〜3)摩尔比的比例溶于有机溶剂中, 室温搅拌 12〜24小时；

3) 将步骤 2) 的反应液倒入水中，萃取，分离出的有机相干燥、纯化后得到目的产物。优选的，步骤 1)所述的酸酐选自：邻苯二甲酸酐、高酞酸酐、 1， 2-环己烷二酸酐、 1，

2-环戊垸二酸酐、吡嗪二酸酐、吡啶二酸酑、噻吩二酸酐、呋喃二酸酐、吡咯二酸酐、 1， 2， 3， 6-四氢苯酐。

优选的，步骤 1)所述的醇选自：甲醇、正辛醇、正壬醇、正癸醇、正十一醇、月桂醇、正十四醇，正十六醇或正十八醇。

优选的，步骤 1) 所述的胺选自：正辛胺、正壬胺、正癸胺、正十一胺、正十二胺、正十四胺，正十六胺或正十八胺。

优选的，步骤 1)和 2)所述的有机溶剂选自： N，N-二甲基甲酰胺、 N，N-二甲基乙酰胺、四氢呋喃、二氧六环、二甲亚砜、环丁砜或吡啶。

优选的，步骤 1) 所述的酰氯是由二酸与 S0C1₂、 PC1₅、 PC1₃或 P0C1₃反应得到；所述的二酸选自：吡嗪- 2， 3-二羧酸、哒嗪 -3， 6-二羧酸、间苯二甲酸、 4,6-嘧啶二甲酸、 2，5- 吡啶二甲酸、 2, 3-吡啶二甲酸、 2， 2 -联苯二甲酸、 2, 6-吡啶二甲酸、 2， 5-噻吩二甲酸、 3， 4 - 吡啶二甲酸、 2, 4-吡啶二甲酸、 3, 5-吡唑二甲酸、邻苯二甲酸、对苯二甲酸、 2， 3-噻吩二甲酸、 3, 4-噻吩二甲酸、 2， 4-噻吩二甲酸、 3, 4-吡唑二甲酸、 1， 2-环己垸二羧酸、 1,3-环己烷二羧酸、 1,4-环己垸二羧酸、 1， 2-环戊垸二羧酸、 1， 3-环戊垸二羧酸、 1,4-环戊烷二羧酸、 2,3-吡咯二甲酸、 2,4- Pt咯二甲酸、 2， 5-吡咯二甲酸、 2， 3-呋喃二甲酸、 2， 4-呋喃二甲酸或 2, 5-呋喃二甲酸。

优选的，步骤 1) 的反应时间为 3〜4小时；

优选的，步骤 2) 中，吉西他滨盐酸盐、步骤 1) 得到的取代的酸、六氟磷酸苯并三唑 -1 -氧基三吡咯垸基磷和 4- 二甲氨基吡啶按照 1: (1.1〜1.3)： (1.1〜1.3)： (1.1〜1.3) 的摩尔比反应。

本发明还提供所述的基于吉西他滨结构的前药的应用，其特征是用于制备治疗肺癌、胰腺癌、胃癌、乳腺癌、结肠癌及肝癌的药物。本发明的有益效果萆- 本发明的器官特异性前药研究是在上述阿糖胞苷 0⁵位环磷酸化前药研究基础上，用抗肿瘤活性更好的吉西他滨作为核苷类抗癌药物前药的结构基础；一方面可以克服其在肺癌细胞或胰腺癌细胞中存在的抗药性问题，另一方面进一步通过在 N⁴位上取代不同的基团， N⁴位的取代基团包括含有芳香环及不同杂环的脂肪链，通过对 N⁴位修饰增加其溶解度，生物利用度以及器官特异性，所生成的前药化合物可以克服其代谢快的问题，降低吉西他滨引发的肠毒性并提高其生物利用度，使之在临床上能用于口服；同时，能更好地改善抗肿瘤、抗癌、抗感染和防扩散能力，并能够特异性地作用于肝脏或结肠。

本发明的合成方法，步骤简单、原料易得，产率高、成本低，适宜工业化生产。

本发明的基于吉西他滨结构的前药及其制备方法，包括他们的合成制备方法和筛选方法，尤其是治疗各种癌症及相关疾病有关的成分和方法的研究，也适用于其它带有胞嘧啶或其替代物或 5-氮杂胞嘧啶等核苷类抗肿瘤药物的前药。

本发明涵盖直接作用于特异性器官，比如肺，肝脏或结肠等，即具有器官特异性及相关的核苷类前药的设计合成、药学成分及使用方法。

进而，将本方法延伸到其他核苷类抗癌药物。因而，本研究不仅适用于吉西他滨，同时包括并不限于其他核苷类抗癌药物，比如氮杂胞苷、地西他滨、氮杂胞嘧啶、噻唑呋林、奈拉滨、 6-氮尿苷及其阿糖胞苷等，也适用于临床研究阶段的核苷类抗癌药物，比如 2 ' -deoxy-2 ' -fluoro -methylc, 4' -thio-aracitidine, 4， -thiof luoro-aracitidine, 3' -ethynylcytidine等。通过合理的设计合成出具有专一功能的核苷类前药，来克服吉西他滨引发的肠毒性并提高其生物利用度，使之在临床上能用于口服；同时来克服核苷类药物在肝中代谢过快而失去活性等问题，有可能开辟出治疗晚期肝癌和结肠癌的另一治疗方案。具体实施方式

以下利用实施例更具体地说明本发明，但本发明并不仅限于以下实施例。

吉西他滨盐酸盐，购自宁波市天衡制药有限公司；

六氟磷酸苯并三唑- 1-氧基三吡咯烷基磷，购自吉尔生化（上海）有限公司；

4-二甲氨基吡啶，购自吉尔生化（上海）有限公司。

实施例 1 : Ν⁴- (2-正十二垸氧基甲酰基苯甲酰基) - 2 ' -脱氧 -2' , 2 ' -二氟胞苷 (化合物 NO. 1 ) 将 5. 0 g邻苯二甲酸酐（34 mmol) , 7. 5 g月桂醇（40 腿 ol ) 和 240 mg 4-二甲氨基吡啶（2 mmol ) 混合，加热融熔，反应 4个小时，冷却到室温，定量得到 2-正十二烷氧基甲酰基苯甲酸。

将 700 mg吉西他滨盐酸盐（2. 34 mmol)， 1. 02 g 2-正十二垸氧基甲酰基苯甲酸（3. 04 mmol ) , 1. 34 g六氟磷酸苯并三唑 -1-氧基三吡咯垸基憐（2. 57 mmol ) 和 428 mg 4- 二甲氨基吡啶（3. 51 mmol ) 溶于 Ν, Ν-二甲基甲酰胺（10 mL) 中，室温下搅拌过夜。将反应液倒入水中，用乙酸乙酯萃取三次，分离出的有机相用无水硫酸钠千燥。在减压下蒸发除去溶剂后，其残余物在一个硅胶柱上纯化（展开剂：二氯甲垸 /甲醇 =30/1)，得到 362. 5 nlg N⁴- (2- 正十二垸氧基甲酰基苯甲酰基) -2' -脱氧 -2， ,2， -二氟胞苷。 LC (UV254)纯度 98%。 LC-MS m/z 580 [M + H]+ (分子式 C₂₉H₃₉F具 0₇，分子量 579)。化合物的结构式和表征数据见表 1 实施例 2:N⁴- (2-正十一垸氧基甲酰基苯甲酰基)- 2' -脱氧 -2，，2' -二氟胞苷 (化合物 NO.2) 用正十一醇代替实施例 1中的月桂醇，其它和实施例 1相同，得到标题化合物。LC(UV254) 纯度 95%。 LC- MS m/z 566 [M + H]+ (分子式 C₂₈H₃₇F 0₇，分子量 565)。

实施例 3:N⁴- (2-正十六垸氧基甲酰基苯甲酰基) -2' -脱氧 -2，，2' -二氟胞苷 (化合物 NO.3) 用正十六醇代替实施例 1 中的月桂醇， Ν,Ν-二甲基乙酰胺代替 N，N-二甲基甲酰胺，反应 6小时，其它和实施例 1相同，得到标题化合物。 LC (UV254) 纯度 96%。 LC-MS m/z 636 [M + H]⁺ (分子式 C₃₃H₄₇F 0₇，分子量 635)。

实施例 4: N⁴- (3-正十二烷氧基甲酰基吡嗪 -2-甲酰基 )-2' -脱氧 -2' ，2' -二氟胞苷（化合物 NO.4，后述代号为： SL-01)

将 504 mg吡嗪- 2， 3-二羧酸 (3.0醒 ol) 加入到 15 mL S0C1₂中，加 2滴 DMF，加热回流 5小时。旋去 S0C1₂，几乎定量得到 612 mg吡嗪 -2， 3-二酰氯。

将 612 mg吡嗪- 2， 3-二酰氯（3.0 mraol) 溶于 20 mL二氧六环中，冰浴下滴加 558 mg 月桂醇与 2 mL Et₃N的 5 mL二氧六环液，反应 4 h后，浓缩干固，剩余物溶于水中，调节 ra为 2-3，用乙酸乙酯萃取三次，分离出的有机相用无水硫酸钠干燥。在减压下蒸发除去溶剂后，几乎定量获得 3-正十二烷氧基甲酰基吡嗪 -2-甲酸。

将 500 mg吉西他滨盐酸盐（1.67 mraol), 674 mg 3_正十二烷氧基甲酰基吡嗪 -2-甲酸 (2.01 mmol), 955 mg六氟磷酸苯并三唑- 1-氧基三吡咯垸基磷（1.84 mmol) 和 244 mg 4- 二甲氨基吡啶（2.0 mmol) 溶于 Ν,Ν-二甲基甲酰胺（10 mL) 中，室温下搅拌过夜。将反应液倒入水中，用乙酸乙酯萃取三?欠，分离出的有机相用无水硫酸钠干燥。在减压下蒸发除去溶剂后，其残余物在一个硅胶柱上纯化 (展开剂：二氯甲垸 /甲醇 =40/1)，得到 225.7 mg N⁴- (3 - 正十二烷氧基甲酰基吡嗪 -2-甲酰基）-2' -脱氧 -2， ,2， -二氟胞苷（化合物 N0.4)。 LC (UV254) 纯度 98% LC-MS m/z 582 [M + H]+ (分子式 C₂₇H₃₇F₂N₅0₇，分子量 581)。化合物的结构式和表征数据见表 1。

实施例 5: N⁴-(3-正十一院氧基甲酰基吡嗪- 2-甲酰基 )-2' -脱氧 -2' ，2' -二氟胞苷（化合物 N0.5)

用正十一醇代替实施例 4中的月桂醇，四氢呋喃代替实施例 4中的二氧六环，其它和实施例 4相同，得到标题化合物。 LC (UV254) 纯度 97%。 LC-MS m/z 568 [M + H]⁺ (分子式 C₂₆H₃₅F₂N₅0₇，分子量 567)。化合物的结构式和表征数据见表 1。

实施例 6: N⁴-(3-正十垸氧基甲酰基苯甲酰基 )-2' -脱氧 -2，，2' -二氟胞苷（化合物 N0.6) 用间苯二甲酸代替实施例 4中吡嗪 -2， 3-二羧酸，环丁砜代替实施例 4中的二氧六环，用正癸醇代替实施例 4中的月桂醇，其它和实施例 4相同，得到标题化合物。 LC (UV254) 纯度 96%。 LC-MS m/z 552 [M + H]⁺ (分子式 C₂₇H₃₅F₂N₃0₇，分子量 551).

实施例 7:N⁴-(3-正十一垸氧基甲酰基苯甲酰基) -2' -脱氧 -2' ,2' -二氟胞苷 (化合物 NO.7) 用间苯二甲酸代替实施例 4中吡嗪 -2， 3-二羧酸，二甲亚砜代替实施例 4中的二氧六环，用正十一醇代替实施例 4中的月桂醇，其它和实施例 4相同，得到标题化合物。 LC (UV254) 纯度 88%。 LC-MS m/z 566 [M + H]⁺ (分子式 C₂₈H₃₇F₂N_:i0₇，分子量 565)。

实施例 8: N⁴- (5-正十二垸氧基甲酰基吡啶 -2-甲酰基 )-2' -脱氧 -2' ，2' -二氟胞苷（化合物 NO.8)

用 2, 5-吡啶甲酸代替实施例 4中吡嗪 -2， 3-二羧酸，反应 3小时，其它和实施例 4 相同，得到标题化合物。 LC (UV254) 纯度 97%。 LC-MS z?A581 [M + H]⁺ (分子式 C₂₈H₃₈F 0₇，分子量 580)。化合物的结构式和表征数据见表 1。

实施例 9: N⁴- (2-正十二垸氧基甲酰基吡啶- 5-甲酰基 )_2' -脱氧 -2，，2' -二氟胞苷（化合物 NO.9)

用 2， 5-吡啶二甲酸代替实施例 4中吡嗪 -2， 3-二羧酸，吡啶代替二氧六环，其它和实施例 4 相同，得到标题化合物。 LC (UV254) 纯度 94%。 LC- MS m/z 581 [M + H]⁺ (分子式 C₂₈H₃₈F₂N₄0₇，分子量 580)。化合物的结构式和表征数据见表 1。

实施例 10: N⁴-(5-正十一垸氧基甲酰基吡啶 -2-甲酰基 )-2' -脱氧 -2， ,2； -二氟胞苷（化合物 NO.10)

用 2， 5-吡啶二甲酸代替实施例 4中吡嗪 -2， 3-二羧酸，用正^ ^一醇代替实施例 4中的月桂醇，其它和实施例 4相同，得到标题化合物。 LC (UV254) 纯度 99%。 LC-MS m/z 567 [M + ΗΓ (分子式 C₂₇H₃₆F₂N₄0₇，分子量 566)。化合物的结构式和表征数据见表 1。

实施例 11: N⁴- (2-正十一烷氧基甲酰基吡啶 -5-甲酰基） -2' -脱氧 -2， ,2' -二氟胞苷（化合物 NO.11)

用 2,5-吡啶二甲酸代替实施例 4中吡嗪 -2， 3-二羧酸，用正十一醇代替实施例 4中的月桂醇，其它和实施例 4相同，得到标题化合物。 LC (UV254) 纯度 97%。 LC-MS m/z 567 [M + H]⁺ (分子式 C₂₇H₃₆F 0₇，分子量 566)。化合物的结构式和表征数据见表 1。

实施例 12: N⁴-(2-正十二烷氧基甲酰基吡啶 -3-甲酰基 )-2' -脱氧 -2，，2' -二氟胞苷（化合物 N0.12)

用 2,3-吡啶二甲酸代替实施例 4中吡嗪 -2， 3-二羧酸，其它和实施例 4相同，得到标题化合物。 LC (UV254)纯度 97%。 LC-MS z 581 [M + H]⁺ (分子式 C₂₈H₃₈F₂N₄0₇，分子量 580)。实施例 13: N⁴-(3-正十二垸氧基甲酰基吡啶- 2-甲酰基 )-2' -脱氧 -2， ,2' -二氟胞苷（化合物 N0.13)

用 2， 3-吡啶二甲酸代替实施例 4中吡嗪 -2， 3-二羧酸，其它和实施例 4相同，得到标题化合物。 LC (UV254) 纯'度 97%。 LC-MS m/z 581 [M + H]⁺ (分子式 C₂₈H₃₈F₂N₄0₇，分子量 580)。实施例 14: N⁴- (3-正十一烷氧基甲酰基吡啶 -2-甲酰基 )-2' -脱氧 -2' ,2' -二氟胞苷（化合物 N0.14)

用 2, 3-吡啶二甲酸代替实施例 4中吡嗪 -2， 3-二羧酸，用正十一醇代替实施例 4中的月桂醇，其它和实施例 4相同，得到标题化合物。 LC (UV254) 纯度 98%。 LC-MS m/z 567 [M + ΗΓ (分子式 C₂₇H₃₆F₂N₄0₇，分子量 566)。

实施例 15: N⁴-(2-正十一垸氧基甲酰基吡啶- 3-甲酰基) - 2' -脱氧 -2' ,2' -二氟胞苷（化合物 NO.15)

用 2,3-吡啶二甲酸代替实施例 4中吡嗪 -2， 3-二羧酸，用正十一醇代替实施例 4中的月桂醇，其它和实施例 4相同，得到标题化合物。 LC (UV254) 纯度 97%。 LC- MS Λ?Λ 567 [Μ + ΗΓ (分子式 C₂₇H₃₆F 0₇，分子量 566)。化合物的结构式和表征数据见表 1。

实施例 16: Ν⁴-( (2'-甲氧基甲酰基）联苯 -2-甲酰基 )-2' -脱氧 -2， ,2， -二氟胞苷（化合物 NO.16)

用 2， 2 -联苯二甲酸代替实施例 4中吡嗪 -2， 3-二羧酸，用甲醇代替实施例 4中的月桂醇，其它和实施例 4相同，得到标题化合物。 LC (UV254) 纯度 86%。 LC-MS 502 [M + H] +

(分子式 C₂₄H₂₁F具 0₇，分子量 501)。

实施例 17: N⁴-( (2'-正十二垸氧基甲酰基）联苯 -2-甲酰基 )-2' -脱氧 -2， ,2' -二氟胞苷

(化合物 NO.17)

用 2,2'-联苯二甲酸代替实施例 4中吡嗪 -2， 3-二羧酸，其它和实施例 4相同，得到标题化合物。 LC (UV254)纯度 98%。 LC-MS T? 656 [M + H]+ (分子式 C₃₅H«F₂N₃0₇，分子量 655)。实施例 18: N⁴-(6-正十二烷氧基甲酰基吡啶 -2-甲酰基 )-2' -脱氧 -2，，2' -二氟胞苷（化合物 NO.18)

用 2, 6-吡啶二甲酸代替实施例 4中吡嗪 -2， 3-二羧酸，其它和实施例 4相同，得到标题化合物。 LC (UV254)纯度 96%。 LC- MS/z?A581 [M + H]⁺ (分子式 C₂₈H₃₈F₂N₄0₇，分子量 580)。实施例 19: N⁴- (6-正十一烷氧基甲酰基吡啶- 2-甲酰基 )-2' -脱氧 -2' ，2' -二氟胞苷（化合物 N0.19)

用 2, 6-吡啶二甲酸代替实施例 4中吡嗪 -2， 3-二羧酸，用正十一醇代替实施例 4中的月桂醇，其它和实施例 4相同，得到标题化合物。 LC (UV254) 纯度 95%。 LC-MS 567 [Μ + Η]⁺ (分子式 C₂₇H₃₆F 0₇, 分子量 566)。

实施例 20: N⁴-(5-正十二烷氧基甲酰基噻吩 -2-甲酰基 )-2' -脱氧 -2' , 2' -二氟胞苷（化合物 N0.20)

用 2, 5-噻吩二甲酸代替实施例 4中吡嗪 -2， 3-二羧酸，其它和实施例 4相同，得到标题化合物。 LC (UV254)纯度 95%。 LC- MSy¾/z586 [M + H]+ (分子式 C₂₇H₃₇F₂N₃0₇S，分子量 585)。化合物的结构式和表征数据见表 1。

实施例 21: N⁴-(5-正十一烷氧基甲酰基噻吩 -2-甲酰基 )-2' -脱氧 -2' ,2' -二氟胞苷（化合物 N0.21)

用 2， 5-噻吩二甲酸代替实施例 4中吡嗪 -2， 3-二羧酸，用正 ^一醇代替实施例 4中的月桂醇，其它和实施例 4相同，得到标题化合物。 LC (UV254) 纯度 90%。 LC- MS 572 [M + H]+ (分子式 C₂₆H₃₅F₂N₃0₇S，分子量 571)。

实施例 22: N⁴- (4-正十一垸氧基甲酰基吡啶 -3-甲酰基 )-2' -脱氧 -2，，2' -二氟胞苷（化合物 NO.22)

用 3， 4-吡啶二甲酸代替实施例 4中吡嗪 -2， 3-二羧酸，用正十一醇代替实施例 4中的月桂醇，其它和实施例 4相同，得到标题化合物。 LC (UV254) 纯度 97%。 LC-MS /ζ?Λ 567 [M + ΗΓ (分子式 C₂₇H₃₆F 0₇，分子量 566)。化合物的结构式和表征数据见表 1。

实施例 23: N⁴-(3-正十一垸氧基甲酰基吡啶 -4-甲酰基 )-2' -脱氧 -2，，2' -二氟胞苷（化合物 NO.23)

用 3, 4-吡啶二甲酸代替实施例 4中吡嗪 -2， 3-二羧酸，用正 ""—醇代替实施例 4中的月桂醇，其它和实施例 4相同，得到标题化合物。 LC (UV254) 纯度 97%。 LC-MS m/z 567 [M + H]+ (分子式 C₂₇H₃₆F₂N₄0₇，分子量 566)。化合物的结构式和表征数据见表 1。

实施例 24: N⁴- (4-正十二垸氧基甲酰基吡啶 -3-甲酰基 )-2' -脱氧 -2' ，2' -二氟胞苷（化合物 NO.24)

用 3, 4-吡啶二甲酸代替实施例 4中吡嗪 -2， 3-二羧酸，其它和实施例 4相同，得到标题化合物。 LC (UV254)纯度 95%。 LC - MS/¾/z581 [M + H]+ (分子式 C₂₈H₃₈F 0₇，分子量 580)。实施例 25: N⁴-(3-正十二垸氧基甲酰基吡啶- 4-甲酰基)- 2， -脱氧 -2， ,2' -二氟胞苷（化合物 NO.25)

用 3, 4-吡啶二甲酸代替实施例 4中吡嗪 -2， 3-二羧酸，其它和实施例 4相同，得到标题化合物。 LC (UV254)纯度 95%。 LC- MS z7/z581 [M + H]⁺ (分子式 C₂₈H₃₈F 0₇，分子量 580)。实施例 26: N⁴-(4-正十二烷氧基甲酰基吡啶- 2-甲酰基)- 2' -脱氧 -2，，2' -二氟胞苷（化 '合物 NO.26 后述代号为： SL-02)

用 2, 4-吡啶二甲酸代替实施例 4中吡嗪 -2， 3-二羧酸，其它和实施例 4相同，得到标题化合物。 LC (UV254) 纯度 96%。 LC- MS m/z 581 [M + H]⁺ (分子式 C₂₈H₃₈F 0₇，分子量 580)。化合物的结构式和表征数据见表 1。

实施例 27: N⁴-(2-正十二垸氧基甲酰基吡啶- 4-甲酰基)- 2， -脱氧 -2，，2' -二氟胞苷（化合物 N0.27)

用 2， 4-吡啶二甲酸代替实施例 4中吡嗪 -2， 3-二羧酸，其它和实施例 4相同，得到标题化合物。 LC (UV254)纯度 86%。 LC-MS yz?/ 581 [M + H]⁺ (分子式 C₂₈H₃₈F 0₇，分子量 580)。实施例 28: N⁴-(4-正十一垸氧基甲酰基吡啶 -2-甲酰基) - 2' -脱氧 -2，，2' -二氟胞苷（化合物 N0.28)

用 2, 4-吡啶二甲酸代替实施例 4中吡嗪 -2， 3-二羧酸，用正十一醇代替实施例 4中的月桂醇，其它和实施例 4相同，得到标题化合物。 LC (UV254) 纯度 90%。 LC-MS 567 [Μ + Η]⁺ (分子式 C₂₇H₃₆F₂N₄(¾，分子量 566)。化合物的结构式和表征数据见表 1。

实施例 29: N⁴- (2-正十一垸氧基甲酰基吡啶 -4-甲酰基)- 2' -脱氧 -2，，2' -二氟胞苷（化合物 N0.29)

用 2， 4-吡啶二甲酸代替实施例 4中吡嗪 -2， 3-二羧酸，用正十一醇代替实施例 4中的月桂醇，其它和实施例 4相同，得到标题化合物。 LC (UV254) 纯度 901 LC-MS 567 [Μ + ΗΓ (分子式 C₂₇H₃₆F₂N₄0₇，分子量 566)。实施例 30: N⁴-(5-正十一垸氧基甲酰基吡唑 -3-甲酰基) - 2' -脱氧- 2' ,2' -二氟胞苷（化合物 NO.30)

用 3, 5-吡唑二甲酸代替实施例 4中吡嗪 -2， 3-二羧酸，用正 ^一醇代替实施例 4中的月桂醇，其它和实施例 4相同，得到标题化合物。 LC (UV254) 纯度 99%。 LC-MS m/z 556 [M + ΗΓ (分子式 C₂₅H₃₅F₂N₅0₇，分子量 555)。化合物的结构式和表征数据见表 1。

实施例 31: N⁴- (5-正十二烷氧基甲酰基吡唑 -3-甲酰基) - 2' -脱氧 -2，，2' -二氟胞苷（化合物 NO.31)

用 3, 5-吡唑二甲酸代替实施例 4中吡嗪 -2， 3-二羧酸，其它和实施例 4相同，得到标题化合物。 LC (UV254)纯度 98%。 LC- MS/??/z570 [ + H]⁺ (分子式 C₂₆H₃₇F 0₇，分子量 569)。实施例 32: N⁴-(2-正十一垸氧基羰甲基苯甲酰基) - 2， -脱氧 -2' ,2， -二氟胞苷（化合物 NO.32)

用高酞酸酐代替实施例 1中的邻苯二甲酸酐，用正十一醇代替实施例 1中的月桂醇，其它和实施例 1相同，得到标题化合物。 LC (UV254) 纯度 90%。 LC-MS »A580 [M + H]+ (分子式 C₂₉H₃₉F₂N₃0₇，分子量 579)。

实施例 33: N⁴- (2-正十一垸氧基甲酰基苯乙酰基) - 2' -脱氧 -2' ,2' -二氟胞苷（化合物 NO.33)

用高酞酸酐代替实施例 1中的邻苯二甲酸酐，用正十一醇代替实施例 1中的月桂醇，其它和实施例 1相同，得到标题化合物。 LC (UV254) 纯度 90%。 LC-MS m/z 580 [M + H]⁺ (分子式 C₂₉H₃₉F₂N₃0₇，分子量 579)。

实施例 34: N⁴-(2-正十二垸氧基羰甲基苯甲酰基)- 2' -脱氧 -2' ,2' -二氟胞苷（化合物 N0.34)

用高酞酸酐代替实施例 1中的邻苯二甲酸酐，其它和实施例 1相同，得到标题化合物。 LC (UV254) 纯度 93%。 LC-MS m/z 594 [M + H]+ (分子式 C₃。H₄₁F₂N₃0₇，分子量 593)。

实施例 35: N⁴-(2-正十二烷氧基甲酰基苯乙酰基) - 2, -脱氧 -2，，2' -二氟胞苷（化合物 N0.35)

用高酞酸酐代替实施例 1中的邻苯二甲酸酐，其它和实施例 1相同，得到标题化合物。 LC (UV254) 纯度 93%。 LC- MS m/z 594 [M + H]+ (分子式 C₃。H₄₁F₂N₃0₇，分子量 593)。

实施例 36: N⁴- (2-正十一垸氧基甲酰基环己垸甲酰基 )-2' -脱氧 -2' ,2' -二氟胞苷（化合物 N0.36)

用 1， 2-环己垸二酸酐代替实施例 1中的邻苯二甲酸酐，用正十一醇代替实施例 1中的月桂醇，其它和实施例 1相同，得到标题化合物。 LC (UV254) 纯度 95%。 LC-MS m/z 572 [M + ΗΓ (分子式 C₂₈H₄₃F₂N₃0₇，分子量 571)。

实施例 37: N⁴- (3-正十二垸胺基甲酰基吡嗪 -2-甲酰基) - 2, -脱氧 -2' ,2， -二氟胞苷（化合物 N0.37)

将 624 mg吡嗪 -2， 3-二羧酸（4.0 mmol) , 740 mg 1-十二胺（4.0隱 ol)， 2.6 g六氟磯酸苯并三唑 -1-氧基三吡咯烷基磷（4.8 mmol) 和 488 mg 4- 二甲氨基吡啶（0.4 mmol) 溶于 Ν, Ν-二甲基甲酰胺（10 mL) 中，室温下搅拌过夜。将反应液倒入水中，用乙酸乙酯萃取三次，分离出的有机相用无水硫酸钠干燥。在减压下蒸发除去溶剂后，其残余物在一个硅胶柱上纯化（展开剂：二氯甲烷 /甲醇 =30/1)，得到 650 mg 3-正十二垸胺基甲酰基吡嗪 -2- 甲酸。

将 200 mg吉西他滨盐酸盐（0.67 mmol) , 325 mg 3_正十二烷胺基甲酰基吡嗪 -2-甲酸 (1.01 mmol)， 327.6 mg六氟磷酸苯并三唑 -1-氧基三吡咯垸基磷（0.74 mmol) 和 98 mg 4- 二甲氨基吡啶（0.80 mmol) 溶于 Ν, Ν-二甲基甲酰胺（10 raL) 中，室温下搅拌过夜。将反应液倒入水中，用乙酸乙酯萃取三次，分离出的有机相用无水硫酸钠干燥。在减压下蒸发除去溶剂后，其残余物在一个硅胶柱上纯化（展开剂：二氯甲垸 /甲醇 =10/1 )，得到 290 mg N⁴-(3- 正十二烷胺基甲酰基吡嗪 -2-甲酰基) - 2, -脱氧 -2，，2' -二氟胞苷（化合物 NO.37)。 LC (UV254) 纯度 97%。 LC-MS m/z 581 [M + H]+ (分子式 C₂₇H₃₈F₂N₆0₆，分子量 580)。化合物的结构式和表征数据见表 1。

实施例 38: N⁴-(6-正十二垸氧基甲酰基哒 -3-甲酰基) - 2' -脱氧 -2' , 2' -二氟胞苷（化合物 N0.38)

用哒嗪 -3， 6-二羧酸代替实施例 4中吡嗪 -2， 3-二羧酸，其它和实施例 4相同，得到标题化合物。 LC (UV254)纯度 95%。 LC-MS ζ? 582 [Μ + Η]+ (分子式 C₂₇H₃₇F₂N₅0₇，分子量 581)。实施例 39: N⁴-(6-正十二烷氧基甲酰基嘧 -4-甲酰基)- 2， -脱氧 -2' , 2' -二氟胞苷（化合物 N0.39)

用 4, 6-嘧啶二甲酸代替实施例 4中吡嗪 -2， 3-二羧酸，其它和实施例 4相同，得到标题化合物。 LC (UV254) 纯度 96%。 LC- MS m/z 582 [M + H]⁺ (分子式 C₂₇H₃₇F₂N₅0₇，分子量 581)。

表 1 化合物的结构式和表征数据

567

581

药效试验

细胞分析方法：

前药化合物通过 MTT分析方法进行对不同肿瘤细胞的测试。

斗

1) 细胞株： NCI- Η4¾0， Α549, LOVO, HT- 29, MDA- MB-231, SGC7901, HepG2 或 BEL- 7402 细胞株。培养：贴壁生长，用 10%胎牛血清（Hyclone公司）的 D-MEM细胞培养基培养，常规培养初始细胞浓度在 3*10⁵/ml左右， 2-3天 1 : 3传代一次。实验前一天 1 : 2传代，实验时细胞浓度在 5-10*107ml之间。

2) 化合物的溶解与稀释：根据提供的药物重量和分子量，首先加入 DMS0100-200 μ1，然后加入 NS，使稀释后药物浓度为 5 mM (注意 DMS0终浓度不超过 10%)。

3) D- MEM或 RPMI 1640细胞培养基， Gibco公司

4) 胎牛血清， Hyclone公司

5) 细胞消化液， 0, 25%Trypsin + 0. 02%EDTA

6) MTT液， MTT干粉 (Sigma) , 用 PBS充分溶解配成 5 rag/ml , 0. 22 μπι微孔滤膜过滤后分装， - 20°C保存。

7) PBS缓冲液；

8) 10%酸化 SDS， 0. 01N HC1

9) 离心管、吸管等（BD公司）， 96孔板（Costar 公司）

步骤：

1) 细胞接种：传代后 24小时的细胞，生长状态良好。常规收获细胞，用新鲜培养液调整细胞浓度为 2xl0⁵/ml (贴壁细胞） -3xl0⁵/ml (悬浮细胞）。贴壁细胞接种 100 μΐ/ 孔， 37°C、 5%C0₂孵箱中培养 24h后弃去旧培养液，加入新鲜培养液 95μ1/孔。悬浮细胞直接接种 95μ1/孔。

2) 药物处理：每一药物设 9个浓度梯度，每一浓度设 3个复孔，药物空白对照组设 5 个复孔。每次试验同时做对照。加入药物的终浓度依次为 0. 25、 0. 125、 0. 0625、 0. 03125、 0. 016、 0. 008, 0. 004, 0. 002 mM, 对照组加入 5 μΐ生理盐水。

3) 细胞培养与检测：加入药物后， 37°C、 5%∞₂孵箱中培养 72h，然后每孔加入 MTT 10 μ1，继续培养 4h，每孔加 100 μΐ 10%SDS (含 0. 01N HC1 ) 溶解， 24h后用 Bio_rad 680 型 ELISA读数仪测定各孔吸光度 (A), 检测波长为 570 nm、参考波长为 630 nm。计算：首先平均各复孔的吸光度（去除过于悬殊的数据），计算每种细胞每个药物浓度下的抑制率（IR)， IR (%) = (1- U A„) X 100%, ^为实验孔平均吸光度， A。为药物空白对照孔平均吸光度。用 EXCEL软件，绘制药物浓度效应曲线，选择合理的计算方法计算 50%细胞存活的药物浓度（IC₅。）。

表 2化合物对八种人体细胞株的药效 IC50 (mM)

a: IC50>0. 2 mM

b : 未测

Gem为吉西他滨，作为对照

A549为一种人体肺癌细胞株 NCI-H460为一种人体肺癌细胞株

HT29为一种人体结肠癌细胞株

L0V0为一种人体结肠癌细胞株

Bel7402为一种人体肝癌细胞株

HepG2为一种人体肝癌细胞株

SGC7901为一种人体胃癌细胞株

MDA-MB-231为一种人体乳腺癌细胞株

药代动力学实验

一、实验材料

1. 主要仪器

CX-250超声波清洗器（北京医疗设备二厂）； LC-10ATVP-0DS高效液相色谱仪（日本岛津）； SPD-10A VP 紫外检测器（日本岛津）； 80-2 型离心沉淀机（国华仪器有限公司） TGL-16G-A高速冷冻离心机（上海安亭科学仪器厂）； GL- 8813旋涡混合器（江苏海门其林医用仪器厂）

2. 动物

昆明小白鼠（25± lg，山东大学实验动物中心提供，雌雄各半）

二、方法与结果

1. 体外稳定性考察：

1. 1 人工肠液中吉西他滨和两种前药稳定性考察

分别将吉西他滨和两种前药溶于人工肠液中，分别于 0、 1、 2、 4、 6、 8、 12、 24 h取样，按 HPLC含量测定方法测定药物浓度，考察吉西他滨和两种前药在人工肠液中的稳定性。结果见表 3。：

表 3吉西他滨， SL-01和 SL-02在人工肠液中的稳定性结果

人工肠液

时间

吉西他滨降解百分率％

Omin 643704. 938 0 288987. 906 251093. 500 lh 465528. 594 27. 67 231129. 797 246642. 203

2h 410685. 313 36. 2 196319. 828 260214. 703

4h 257604. 125 59. 98 245622. 906 262169. 906

6h 197106. 406 69. 37 247957. 219 266558. 938

8h 149816. 906 76. 72 239958. 297 272841. 656 12h 9873. 897 98. 46 247782. 500 250558. 797

24h 5571. 352 99. 13 256782. 600 240246. 594 结果：由上表可知吉西他滨在人工肠液中降解， SL-01 和 SL- 02在人工肠液中稳定。

1. 2PBS (pH=7. 4)中稳定性考察

分别将吉西他滨溶于 PBS (pH=7. 4)中，分别于 0、 1、 2、 4、 6、 8、 12、 24 h取样，按 HPLC含量测定方法测定药物浓度，考察吉西他滨在 PBS (pH=7. 4)中的稳定性。结果见表 4。

表 4 吉西他滨， SL- 01和 SL-02在 PBS (pH=7. 4)中的稳定性结果

PBS (pH=7. 4)

时间

吉西他滨 SL-01 SL-02

Omin 657583. 875 399795. 688 289882. 063 lh 646932. 375 379856. 688 274649. 094

2h 651326. 375 397725 284440. 094

4h 647537. 813 373725. 406 284744. 625

6h 618724 360109. 813 299753. 813

8h 635026. 875 362068. 688 282661. 406

12h 600425. 125 386125. 688 297430. 75

24h 603669. 813 387541. 688 290547 结果：由上表可知吉西他滨， SL-01和 SL-02在 PBS (pH=7. 4)中稳定。

2.吉西他滨及两种前药在血浆中的稳定性

2. 1血浆样品的处理

精密吸取血浆样品 200 μ 1到 EDTA处理且含 2. 5 μ 1四氢尿苷溶液 tetrahydrouridine (THU， 10 mg/ml , 胞苷脱胺酶的抑制剂，防止吉西他滨代谢为脱氧尿嘧啶核苷）离心管中，再往血桨样品中加入 1 ml异丙醇涡旋 30 s , 静置 5 min, 再加入 2. 5 ml的乙酸乙酯并涡旋处理， 4000 rpm离心 15 min, 取上清在氮气流下吹干。用 200 μ 1流动相复溶后 HPLC进样 20 μ 1。

2. 2吉西他滨和前药在血浆中的稳定性

分别将吉西他滨， SL-01和 SL- 02标准溶液定量稀释于血浆中，分别于 0、 1、 2、 4、 6、 8、 12、 24 h取样，按标准方法处理，进样 20 μ ΐ记录色谱图峰面积，确定药物浓度，考察吉西他滨， SL- 01和 SL-02在血浆中的稳定性。结果见表 5。

表 5 吉西他滨， SL- 01和 SL-02血浆定性试验血桨

时间

吉西他滨 SL-01及降解百分率％ SL-02及降解百分率％

Omin 562562. 938 336275. 344 0 260988. 766 0 lh 592859. 625 326948. 219 2. 77 231176. 578 11. 42

2h 466418. 094 261917. 094 22. 11 188092. 719 27. 93

4h 483743. 594 178242. 781 46. 99 139849. 094 46. 42

6h 552648. 313 59465. 750 82. 31 87365. 656 66. 53

8h 540059. 125 43894. 633 89. 64 84379. 297 67. 67

12h 544300. 688 12894. 514 96. 17 44450. 098 82. 97 结果：由上表可知吉西他滨在血浆中稳定， SL- 01和 SL-02在血浆中降解。

3 动物实验

3. 1吉西他滨

精密称取吉西他滨适量，配制含吉西他滨的水溶液 6. 25 mg/ml的对照品溶液。将上述溶液以 0. 22 μ m滤膜过滤除菌。

取昆明种健康小鼠 120只，随机分为 2组，第 1组为吉西他滨口服给药组（通过灌胃给药），第 2组为吉西他滨尾静脉注射组，每个时间点平行设定 5只。给药剂量 50 mg/kg (相当于每只小鼠给药 0. 2 ml ) ,给药前禁食 12h，自由饮水，给药后分别于 5min、 15min、 30min、 45min、 1、 2、 4、 6、 8、 12、 24、 48h于眼底静脉丛取血，加入经肝素钠润洗过并且含有 2. 5 μ 1四氢尿苷（THU， 10 mg/ml)的离心管中， 4000 r/min离心 15min取上层血浆，加入 1 ml 异丙醇涡旋 30s，静置 5min, 再加入 2. 5 ml的乙酸乙酯并涡旋处理， 4000 rpm离心 15min，取上清在氮气流下吹干。用 200 μ 1流动相复溶后 HPLC进样 20 μ 1，记录色谱图和峰面积。计算吉西他滨血药浓度，：绘制吉西他滨的平均药一时曲线。结果见表 6。

表 6 吉西他滨药代动力学参数

参数静脉给药组口服给药组

MRT o-t (h) 1. 07 1. 28

T_l/2 (h) 0. 97 0. 83

L (h) 0. 083 0. 50

AUC₀-_t ( μ g/ml *h) 11. 30 4. 02

绝对生物利用度 35. 57% 注：绝对生物利用 / AUC_iv

3. 2 SL-01及 SL-02药代学

精密称取 SL-01及 SL- 02样品 125 mg，置于 10 ml容量瓶中，加水（含 0. 1%的吐温 -80 ) 至刻度，混匀，得 SL-01及 SL- 02混悬液。

取昆明种健康小鼠 100只，随机分为 2组，第 1组为 SL- 01给药组，第 2组为 SL- 02给药组，每个时间点平行设定 5只。 SL-01及 SL-02样品均采用灌胃给药方式，给药剂量 100 mg/kg (相当于每只小鼠给药 0. 2 ml)。给药前禁食 12h，自由饮水，给药后分别于 5min 15min 30min 45min 1 2 4 6 8 12h 于眼底静脉丛取血，加入经肝素钠润洗过并且含有 2. 5 μ 1四氢尿苷 (THU, 10 mg/ml)的离心管中， 4000r/min离心 15min取上层血浆，加入 1 ml异丙醇涡旋 30s，静置 5min，再加入 2. 5 ml的乙酸乙酯并涡旋处理， 4000rpm离心 15min，取上清在氮气流下吹干。用 200 μ 1流动相复溶后 HPLC进样 20 μ 1，记录色谱图和峰面积，计算 SL-01及 SL- 02血药浓度，绘制 SL- 01及 SL-02的平均药一时曲线。结果见表 7和表 8

表 7 SL-01药代动力学参数

SL-01中生成吉西 SL-01降解和生成参数 SL-01给药组

他滨吉西他滨之和

C ( u g/ml) 4. 37 4. 48 6. 82

MRT o-t (h) 0. 36 3. 43 2. 51

T_1/2 (h) 0. 519 8. 67 8. 671

T_max (h) 0. 250 0. 083 0. 083

SL-01相对吉西他滨绝对生物利用度 33. 8%

SL-01相对吉西他滨相对生物利用度 95. 15%

注： SL- 01相对吉西他滨绝对生物利用度= AUC _SL—_{1 MW¾}成吉赚和 X D_iv / (AUC 職 X Dsl- 1)

SL-01相对吉西他滨相对生物利用度= AUC 降解和生成吉西他之和 X D_SL— i/ (AUC 吉西他滨 D_orai吉)

D: 给药剂量；

表 8 SL- 02药代动力学参数

参数 SL - 02中生成吉西他

滨

C ( μ g/ml) 1. 29

T_1/2(h) 2.73

T_max (h) 0.083

AUC„_-t ( μ g/ml *h) 2.73

SL-02相对吉西他滨生绝对物利

12.07%

用度

SL - 02相对吉西他滨生相对物利

33.9%

用度

注： SL-02相对吉西他滨绝对生物利用度= AUC_SL-₂謹和生成_§麵和 XD_SLV (AUC吉麵 XD_iv吉） SL-02相对吉西他滨相对生物利用度= AUC _{SL 2}降解和生成吉西他滨之和 XD_SL— ₂/ (AUC吉西髓 XD_oral吉） D: 给药剂量

4 吉西他滨， SL-01及 SL-02在肝微粒体酶中代谢

4.1肝 S9的制备

取出小鼠肝脏，用冰冻生理盐水冲洗，滤纸吸干，用剪刀将肝脏剪成小块，用冰冷的 PBS(pH=7.4)溶液洗涤 2-3次，直至洗出液呈无色或淡黄色。用剪刀将肝脏小块剪碎，加约 4倍肝重的 PBS(pH=7.4)溶液在冰浴中勾浆。匀衆过程始终在冰浴中进行，以免酶活性的降低。将匀浆液转移至具塞离心管中，将匀浆液转入离心管中离心 20πΰη

(4000r/min), 取上清液离心 20min (12000r/min) , 所得的离心上清液即为 S9组份。

4.2 酶代谢实验

取肝微粒体 S9 组份，与药物溶液混合，混合液 1800μ 1于试管中，放入 37 V水浴中预孵育 5 min, 加入 200μ 1浓度为 10 mmol/L的 NADPH溶液启动反应。反应体系终体积为 2 ml, 于 0、 10、 20、 40min、 lh、 2h、 4h、 6h、 12h时取 200μ 1 孵育体系溶液，立即加入 lml冰冷异丙醇涡旋 30s，静置 5min，再加入 2.5 ml的乙酸乙酯并涡旋处理， 4000rpm 离心 15min, 取上清在氮气流下吹干。用 200μ 1 流动相复溶后 HPLC进样 20 μ 1，记录色谱图和峰面积。结果见表 9。

表 9 吉西他滨， SL- 01及 SL- 02在肝微粒体酶中代谢

肝 S9组分中降解情况

时间吉西他滨降解百分 SL-01及降解百分率％ SL-02及降解百分率％率％

Omin 104493.3 0 179613.3 0 197862.4 0 lh 100684. 3 3. 64 172893. 5 3. 74 111791. 7 43. 50

2h 45804. 8 56. 16 142419. 3 20. 71 80866. 7 59. 13

4h 29235. 3 72. 02 64632. 59 64. 02 99798. 8 49. 56

6h 15103. 03 85. 55 27009. 4 84. 96 43707. 2 77. 91

12h 5092. 7 95. 13 18730. 51 89. 57 17514. 94 91. 15

SL-01静注对癌细胞生长抑制的动物实验

1.化合物溶解与稀释：将吉西他滨盐酸盐（506. 6 mg) 和 SL-01粉末 (482. 4 mg)分别用生理盐水（NS) 和 DMSO (SIGMA) 溶解，两者最高浓度分别为 10 mg/ml和 240 mg/ml。药物稀释用 Grephor EL、 EtOH和 NS，具体方法见表 10。每只小鼠按 20 g体重、给药体积 0. 1 ml计算，则 SL-01 剂量 5、 10 和 20 mg/ g需配制的药物浓度分别为 1、 2、 4mg/ml ₀ 分装后的药物 -2CTC保存。

表 10

2.细胞株及培养： NCI-H460肺癌细胞株， HepG2肝癌细胞株，或 HT29结肠癌细胞株，贴壁生长，用 10%胎牛血清（Hyclone公司）的 D-MEM培养基（Gibco公司）常规培养， 2-3天 1 : 3传代一次。传代培养至 25个 10cm培养皿时，收集细胞。

3 实验方法：

3. 1 癌裸鼠移植瘤模型的建立：收集生长良好的 NCI-H460细胞， HT29细胞，或 HepG2细胞 (25个 10cm培养皿），用无血清 DMEM调细胞浓度为 1. 5 X 10Vml。用 lml注射器将 200 μ 1 细胞悬液接种于 6周龄雄性 BALB/C裸小鼠右侧背部皮下。

3. 2 动物分组与治疗：当肿瘤体积达 300 mm³时，将裸小鼠随机分为 5组，每组 3-4只。（1) 对照组 (control ) , (2) 阳性对照吉西他滨 (GEM) 组（10 mg/Kg) , (3) SL-01 低剂量组（5 mg/Kg) ， (4) SL- 01中剂量组（10 mg/Kg)， (5) SL- 01高剂量组（20 mg/Kg)。治疗开始为第 1天 (d0)，每 3天尾静脉注射相应药物，每只小鼠给药体积根据体重进行相应调整，共计四次 (d0、 d3、 d6、 d9)给药。给药开始时及给药后每 3d用游标卡尺测量肿瘤长短径线，计算肿瘤体积 V (V=l/2ab²， a: 肿瘤长径， b_: 肿瘤短径）。以时间为横轴，肿瘤体积为纵轴绘制生长曲线。当对照组肿瘤体积约 3000 mm³时中止实验，摘眼球取血后颈椎脱曰法处死各组裸鼠，剥离瘤块称重，计算生长抑制率。肿瘤生长抑制率(％) = ( 1-治疗组平均瘤重 /对照组平均瘤重） X 100%o

实验结果：

4. 1 无论从肿瘤生长曲线还是从瘤重来看， SL-01与吉西他滨均对 NCI- H460裸鼠移植瘤生长有抑制作用。但与吉西他滨相比，检测药物 SL- 01的抑制作用偏弱， SL- 01高剂量组 (20 mg/Kg)组的抑制效果与 GEM (10 mg/Kg)相近。从体重减轻程度评价药物毒性来看，阳性对照 GEM在试验结束时的体重减轻率为 14%，而 SL-01高剂量组（20 mg/Kg)组的体重减轻率仅为 7%，毒性低于 GEM。

4. 2 SL-01对 HepG2肝癌细胞株裸鼠移植瘤生长的低、中、高剂量组剂量为 10、 20 和 40 mg/Kg o 从肿瘤生长曲线或从瘤重来看， SL-01与吉西他滨对 HepG2裸鼠移植瘤生长抑制作用均不明显。 SL-01高剂量组 (40 mg/Kg)组与 GEM组的抑制率相近。从体重减轻程度评价药物毒性来看，阳性对照 GEM在试验结束时的体重减轻率为 9%，而 SL- 01低（10 mg/Kg)、中（20 mg/Kg)、高剂量组（40 mg/Kg)组的体重减轻率分别为 11. 6%、 14%和3. 5%。

4. 3 从相对体积来源的肿瘤生长曲线看， GEM和 SL- 01中（20 mg/Kg)、高剂量 (40 mg/Kg) 对 HT29裸鼠移植瘤生长均有一定程度抑制作用，实验结束时的抑制率分别为 15%、23%和 7%。

SL-01的抑制效应略优于同等剂量 GEM。从体重减轻程度评价药物毒性来看，阳性对照 GEM 与 SL-01均未表现出显著毒性， GEM (20 mg/Kg)与等剂量 SL- 01 (20 mg/Kg)组的体重减轻率 (%)在 dl7分别为 4%和 8¾。

口服 SL-01对癌细胞生长抑制的动物实验

一、实验材料

1. SL-01 , 白色粉末制品，不溶于水，试验时以 2. 5%淀粉制成混悬制剂，灌胃给药；吉西他滨，白色粉末制品，易溶于水，试验时以生理盐水溶解并以微孔滤膜过滤后尾静脉给药。阳性对照药物：呋喃氟脲嘧啶 (FT- 207)，口服给药制剂，齐鲁制药有限公司生产。

2. 实验动物： Balb/c裸鼠（雌性） 50只， 4-5周龄，购自北京大学医学部实验动物科学部，动物生产许可证编号： SCXK (京） 2006-0008。

3. 肿瘤细胞、培养基及各种溶液： H460细胞，人肺癌细胞，购自中国科学院上海细胞库。

RPMI-1640培养基，购自美国 invitrogen公司。

胎牛血清，购自中美合作兰州民海生物工程有限公司。

其他试剂： 0. 02%EDTA-0. 25%胰酶溶液， PBS, 生理盐水

4. 实验器材：细胞培养箱，超净工作台，离心机，大 /小鼠层流架，游标卡尺，手术器械，注射器，灌胃针，高压灭菌锅等。

二、实验方法

1. 肿瘤细胞培养：将 H460细胞株用含 10%胎牛血清的 RPMI-1640培养液培养生长于 37°C 5% C0₂培养箱中，常规培养传代。

2. 裸鼠接种肿瘤细胞方法：细胞在培养瓶中生长至约 80瓶后，收集细胞。消化前，细胞先以 PBS洗两遍，每瓶加入消化液 1. 5 ml。显微镜下观察，细胞脱落后终止消化，收集细胞悬液置 50ml离心管中，离心并用 PBS清洗两遍。计数，然后用约 10 ml生理盐水混悬，获得接种裸鼠的肿瘤细胞悬液。每只裸鼠左前肢腋下接种 1 X 1070. 2 ml 细胞。接种后观察肿瘤生长情况。

3. 试验设计、给药方法及调整剂量的说明：裸鼠接种肿瘤细胞 5天后，将裸鼠随机分组，分别为阴性对照组 6只、阳性对照组 6只、 SL-01中剂量组 6只， SL-01低剂量组 6只和吉西他滨对照组 6只。

表 11 SL-01治疗裸鼠给药方案

组别动物数剂量给药次数 /曰给药途径阴性对照（蒸馏水） 6 0. 2ml/只 /次 1次 /每 3天 ύ¾&

m

呋喃氟脲嘧啶 120mg/kg 6 0. 2ml/只 /次 ύ¾

1 X 14次 m

SL-01中剂量 60mg/kg 6 0. 2ml/只 /次 1次 /每 3天 m

SL-01低剂量 30mg/kg 6 0. 2ml/只 /次 1次 /每 3天 m

吉西他滨 30mg/kg 6 0. 2ml/只 /次 1次 /每 3天静脉注射

4. 药物疗效评价方案：给药前及给药后每周称体重，同时测量肿瘤的长径 (a)和短径 (b)，根据肿瘤体积的计算公式为 V= (aX b²) /2。给药三周后，将裸鼠处死，取肿瘤，称重。药物对肿瘤的抑制率计算公式为：抑制率％= (W - W) /W X 100%。其中， W。为阴性对照组肿瘤的重量， W为给药组肿瘤的重量。

三、实验结果：试验周期 30天，其中给药时间 22天，给药 7次，结果如下- 1. 药物对肿瘤体积的影响：于给药后第 7、 14、 18、 22天分别测量各组裸鼠肿瘤体积，见表 12。

表 12 不同时间点裸鼠肿瘤体积平均值

肿瘤体积均值（mm³)

|J量时间

阴性吉西他滨 FT-207 SL-01中 SL-014

(天）

对照组对照组对照组剂量组剂量组

7 799.8 700.7 756.7 739.6 761.3

14 1259.3 759.7 1347.0 823.4 840.9

18 1505.9 804.5 1526.3 870.2 950.5

22 1727.1 868.0 1779.4 905.3 1092.0

2. 药物对裸鼠体重的影响：吉西他滨静脉给药组、 SL-01中剂量组和小剂量组均明显降低动物体重，表 13，其中吉西他滨治疗组体重下降 20.9%， SL- 01中剂量组和 SL-01小剂量组体重下降分别为 14.8和 14.3%。

表 13 不同时间点裸鼠体重平均值

裸鼠体重平均值（g)

阴性阳性吉西他滨 SL-01中 SL-01小

对照组对照组组剂量组剂量组

0 19.3 19.3 19.1 19.5 19.6

7 20.3 19.5 19.0 19.1 19.3

14 22.2 19.8 18.6 19.6 19.9

22 23.0 19.7 18.2 19.6 19.7

3. 药物对肿瘤重量的影响：试验结束，处死动物，取出肿瘤称重，结果见表 14。

表 14 实验结束时各组裸鼠肿瘤重量

肿瘤重量 (g)

裸鼠编号：阴性阳性吉西他滨 SL-01中 SL-01小

对照组对照组组剂量组剂量组

1 2.36 1.82 1.56 1.82 1.41

2 1.89 1.61 1.2 1.5 1.82

3 1.76 1.45 0.4 0.51 1.25

4 2.1 1.01 0.61 0.88 0.8

5 2.32 0.76 0.7 0.41 0.45

6 1.92 0.92 0.88 0.6 0.63

平均值 2.05 1.26 0.89 0.95 1.06 抑制率 —— 38.5% 56.6% 53.7% 48.3% 经 t检验，阳性对照组、吉西他滨组、 SL-01中剂量组和 SL-01小剂量组与阴性对照组比较有显著性意义。

Claims

权利要求

1. 一种基吉西他滨结构的前药，其结构通式如式（I ) 所示:

( I )

其中， a=0〜6的整数； b=0〜6的整数； c= l〜18的整数， d= l〜4的整数； E为 5— 6元环的烃基、含 1一 4个杂原子的 5— 6元环环烷基、芳基或杂芳基，所述杂原子选自 0、 N或 S;

Z选自 0、 N或 S;

V选自氢、烃基、垸氧基、酯基、卤素、酰胺基、氨基或代氨基。
2. 如权利要求 1所述的基于吉西他滨结构的前药，其特征是， E选自下列结构中的一
3. 如权利要求 2所述的基于吉西他滨结构的前药，其特征是， E选自下列结构中的一种：
4. 如权利要求 1所述的基于吉西他滨结构的前药，其特征是， a=0或 1， b=0或 1， Z为 0或 N， c=10〜16， d=l或 2; V选自氢或烃基。
5. 如权利要求 1所述的基于吉西他滨结构的前药的合成方法，包括下列步骤：

1)将酸酐或酰氯与醇或胺按照酸酐或酰氯：醇或胺 =1: 1〜1： 1.5摩尔比的比例直接混合或溶于有机溶剂中，在室温至反应物熔融温度反应 2〜8小时，得到相应的取代的酸；

2) 吉西他滨盐酸盐、步骤 1) 得到的取代的酸、六氟磷酸苯并三唑 -1-氧基三吡咯烷基磷和 4-二甲氨基吡啶按照 1: (1〜2)： (0.9〜1.5) ： (1〜3) 摩尔比的比例溶于有机溶剂中，室温搅拌 12〜24小时；

3) 步骤 2) 的将反应液倒入水中，萃取，分离出的有机相干燥、纯化后得到目的产物。
6. 如权利要求 5所述的基于吉西他滨结构的前药的合成方法，其特征是，步骤 1) 所述的酸酐选自：邻苯二甲酸酐、高酞酸酐、 1， 2-环己垸二酸酐、 1， 2-环戊烷二酸酐、吡嗪二酸酐、吡啶二酸酐、噻吩二酸酐、呋喃二酸酐、吡咯二酸酐、 1， 2， 3， 6-四氢苯酐。
7. 如权利要 5所述的基于吉西他滨结构的前药的合成方法，其特征是，歩骤 1) 所述的醇选自：正辛醇、正壬醇、正癸醇、正十一醇、月桂醇、正十四醇，正十六醇或正十八醇；步骤 1) 所述的胺选自：正辛胺、正壬胺、正癸胺、正十一胺、正十二胺、正十四胺，正十六胺或正十八胺。
8. 如权利要求 5所述的基于吉西他滨结构的前药的合成方法，其特征是，步骤 1) 所述的酰氯是由二酸与 S0C1₂、 PC1₅、 PC1₃或 POCl₃反应得到；所述的二酸选自：吡嗪 -2， 3- 二羧酸、哒嗪 -3， 6-二羧酸、间苯二甲酸、 4,6-嘧啶二甲酸、 2, 5-吡啶二甲酸、 2, 3-吡啶二甲酸、 2， 2'-联苯二甲酸、 2, 6-吡啶二甲酸、 2,5-噻吩二甲酸、 3， 4-吡啶二甲酸、 2, 4-吡啶二甲酸、 3,5-吡唑二甲酸、邻苯二甲酸、对苯二甲酸、 2， 3-噻吩二甲酸、 3, 4-噻吩二甲酸、 2, 4-噻吩二甲酸、 3， 4-吡唑二甲酸、 1,2-环己烷二羧酸、 1， 3-环己垸二羧酸、 1,4-环己垸二羧酸、 1,2-环戊垸二羧酸、 1,3-环戊垸二羧酸、 1， 4-环戊垸二羧酸、 2,3-吡咯二甲酸、 2,4- 吡咯二甲酸、 2， 5-吡咯二甲酸、 2, 3-呋喃二甲酸、 2， 4-呋喃二甲酸或 2, 5-呋喃二甲酸。
9. 如权利要求 5所述的基于吉西他滨结构的前药的合成方法，其特征是，步骤 1) 的反应时间为 3〜4小时；步骤 2) 中，吉西他滨盐酸盐、步骤 1)得到的取代的酸、六氟磷酸苯并三唑 -1-氧基三吡咯烷基磷和 4-二甲氨基吡啶按照 1: (1.1-1.3)： (1.1-1.3)： (1.1-1.3) 的摩尔比反应；步骤 1) 和 2) 所述的有机溶剂选自： Ν,Ν-二甲基甲酰胺、 Ν,Ν-二甲基乙酰胺、四氢呋喃、二氧六环、二甲亚砜、环丁砜或吡啶。
10.如权利要求 1所述的基于吉西他滨结构的前药的应用，其特征是用于制备治疗肺癌、胰腺癌、乳腺癌、结肠癌、胃癌及肝癌的药物，该药物可以在临床上用于静注，及口服。