CN110483608B

CN110483608B - 沙蟾毒精衍生物及其制备方法、包含该衍生物的组合物、及其用途

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Publication number: CN110483608B
Application number: CN201810462777.8A
Authority: CN
Inventors: 果德安; 吴婉莹; 栗世铀; 雷敏; 侯晋军; 金青浩; 周阳; 王贞
Original assignee: Shanghai Institute of Materia Medica of CAS
Current assignee: Shanghai Institute of Materia Medica of CAS
Priority date: 2018-05-15
Filing date: 2018-05-15
Publication date: 2022-03-08
Anticipated expiration: 2038-05-15
Also published as: CN110483608A

Abstract

本发明涉及下面通式I所示结构的沙蟾毒精衍生物或其药学上可接受的盐、其制备方法、包括该衍生物的药物组合物、及其用途。所述沙蟾毒精衍生物对KRAS突变的肿瘤细胞株具有较强的抑制活性，可用于制备KRAS突变的恶性肿瘤药物。

Description

沙蟾毒精衍生物及其制备方法、包含该衍生物的组合物、及其用途

技术领域

本发明涉及药物化学领域，具体地，本发明涉及一类新的沙蟾毒精衍生物、其制备方法、包括该衍生物的药物组合物、及其用途。所述沙蟾毒精衍生物对KRAS突变的肿瘤细胞株具有较强的抑制活性，可用于制备KRAS突变的恶性肿瘤药物。

背景技术

癌症即恶性肿瘤，是影响全球发病率和死亡率的主要原因。据世界卫生组织(WHO)统计，2012年世界有1400万新癌症病例，癌症死亡人数达820万。在我国，新诊断癌症病例为307万，占全球总数的21.8％，癌症死亡人数约220万，占到全球癌症死亡人数的26.9％。目前，全世界新增癌症病例依然呈现逐年递增的趋势。因此，癌症已经成为了全球最大的公共卫生问题，癌症的综合防治已经成为各国疾病防治战略的重要领域，各国均投入大量的人力、物力和财力，以开发抗肿瘤新药。

研究表明约30％的人类恶性肿瘤与RAS基因突变有关(RAS家族包括KRAS，NRAS，HRAS，其中以KRAS突变较为严重，也是目前恶性肿瘤中常见的突变基因之一)。KRAS作为RAS基因家族中的主要亚型，促发人类多种致死性肿瘤，如肺癌、结肠癌和胰腺癌等。然而，由于KRAS信号通路调控的复杂性以及KRAS突变肿瘤对临床药物的抵抗性，使得目前临床上仍无治疗KRAS突变肿瘤的有效药物和方法。因此，研究开发KRAS突变的恶性肿瘤的药物不仅具有重要的临床应用价值，而且对整个社会的公共卫生和健康也具有重大的现实意义。

强心苷(cardiac glycosides)是存在于植物中具有强心作用的甾体苷类化合物，系由具有甾核的强心苷元(cardiac aglycones)和糖缩合所产生的一类苷，是临床上治疗心力衰竭的重要药物。用于充血性心力衰竭及节律障碍等症的治疗。强心苷主要存在于百合科、萝摩科、十字花科、卫矛科、豆科、桑科、毛莨科、梧桐科、大戟科、玄参科、夹竹桃科等十几个科几百种植物中，特别以玄参科、夹竹桃科植物最普遍。植物界存在强心甙种类很多，至今已达数百种，但用于临床的不过二三十种，常用的不过六七种，如西地兰、地高辛、毛地黄毒苷等。现代药理证实，强心苷可特异性结合钠钾ATP酶，具有调节细胞钠钾离子平衡、血管收缩和心肌收缩等重要生理功能。除此之外，研究发现强心苷还具有选择性抑制肿瘤细胞增殖的作用【Kupchan S.M.,Hemingway R.J.,Doskotch R.W.Tumorinhibitors.IV.Apocannoside and cymarin,the cytotoxic principles of apocynumcannabinum L.J.Med.Chem.7,803-804(1964).】。研究证实，强心苷在低于治疗心力衰竭的有效血药浓度就对多种恶性肿瘤具有选择性地诱导肿瘤细胞坏死的活性【Yeh J.Y.,HuangW.J.,Kan S.F.,Wang P.S.Inhibitory effects of digitalis on the proliferationof androgen dependent and independent prostate cancer cells.J.Urology,166,1937-1942(2001)；Lopez-Lazaro M.,PastorN.,Azrak S.S.,Ayuso M.J.,Austin C.A.,Cortes F.Digitoxin inhibits the growth of cancer cell lines at concentrationscommonly found in cardiac patients.J.Nat.Prod.68,1642-1645(2005).】。因此，在近二十年来，强心苷的抗肿瘤作用机制、化学成分的提取分离、全合成、结构改造与构效关系以及临床研究都收到了世界各国学者的广泛关注。现已有大量研究文献以及综述报道了相关研究进展【Melero,C.P.；Medarde,M.；Feliciano,A.S.,A short review oncardiotonic steroids and their aminoguanidine analogues.Molecules 2000,5(1),51-81.；Chen,J.Q.；Contreras,R.G.；Wang,R.；Fernandez,S.V.；Shoshani,L.；Russo,I.H.；Cereijido,M.；Russo,J.,Sodium/potasium ATPase(Na⁺,K⁺-ATPase)and ouabain/related cardiac glycosides:a new paradigm for development of anti-breastcancer drugs Breast Cancer Res Tr 2006,96(1),1-15.；Mijatovic,T.；Lefranc,F.；Quaquebeke,E.V.；Vynckt,F.V.；Darro,F.；Kiss,R.,UNBS1450:A new hemi-syntheticcardenolide with promising anti-cancer activity.Drug DevelopRes 2007,68,164-173.】。

蟾酥是中国传统的名贵中药，药用历史悠久，现已有多种中药制剂用于肿瘤的辅助治疗。从蟾酥中提取分离得到的沙蟾毒精(Arenobufagin)，结构式如下所示，属强心苷类化合物，研究表明沙蟾毒精对KRAS突变的肿瘤细胞具有显著的抑制活性。

但是沙蟾毒精毒性大，治疗窗口比较窄，溶解度低，理化性质不理想，因此，设计、合成新型的蟾毒配基类似物，进行抗肿瘤构效关系研究，发现新的具有高活性、低毒性以及良好理化性质的沙蟾毒精衍生物具有重要意义。

发明内容

本发明的一个目的是提供一类沙蟾毒精衍生物或其药学上可接受的盐。所述沙蟾毒精衍生物对KRAS突变的肿瘤细胞株具有较强的抑制活性，可用于制备KRAS突变的恶性肿瘤药物。

本发明的再一目的为提供制备上述沙蟾毒精衍生物的方法。

本发明的再一目的为提供包含治疗有效量的选自根据本发明的沙蟾毒精衍生物和其药学上可接受的盐中的一种或多种作为活性成分的药物组合物。所述药物组合物可以进一步包含药学上可接受的载体。

本发明的再一目的为提供上述沙蟾毒精衍生物或其药学上可接受的盐、或者包含该衍生物的药物组合物在制备用于治疗恶性肿瘤，尤其是治疗KRAS突变的恶性肿瘤的药物中的用途。

本发明的再一目的为提供一种药物组合物，其包含治疗有效量的选自根据本发明的沙蟾毒精衍生物和其药学上可接受的盐中的一种或多种作为活性成分以及其他药学上可接受的治疗剂，特别是其他抗肿瘤药物。所述药物组合物可以进一步包含药学上可接受的载体。

本发明的再一目的为提供一种治疗恶性肿瘤的方法，所述方法包括向具有该需要的患者给药治疗有效量的选自根据本发明的沙蟾毒精衍生物和其药学上可接受的盐中的一种或多种，或根据本发明的包含治疗有效量的选自根据本发明的沙蟾毒精衍生物和其药学上可接受的盐中的一种或多种作为活性成分的药物组合物。

在本发明的第一方面，提供了一类具有下面通式I所示的沙蟾毒精衍生物，或其药学上可接受的盐，

其中：

R为选自如下结构基团：

在本发明中，

表示取代基从该处连接至式I所示的衍生物的主体部分；

R₁、R₂、R₃和R₄各自独立地选自氢、C₁-C₆直链或支链烷基、C₃-C₇环烷基；优选自氢、C₁-C₄直链或支链烷基、C₄-C₇环烷基；最优选为氢、甲基或乙基；

n₁为0、1、2或3；

n₂为0、1、2或3；

n₃为0、1、2或3；

R₅选自氢、C₁-C₆直链或支链烷基、C₃-C₇环烷基；优选自氢、C₁-C₄直链或支链烷基、C₄-C₇环烷基；最优选为氢；

n₄为0、1、2或3；

R₆选自氢、C₁-C₆直链或支链烷基、C₃-C₇环烷基；优选自氢、C₁-C₄直链或支链烷基、C₄-C₇环烷基；最优选为氢或甲基；

在本发明中，术语“C₁-C₆烷基”是指主链上具有1至6个碳原子的直链或支链烷基，非限制性地包括甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、已基等；优选为异丙基、丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基。

在本发明中，术语“C₃-C₇环烷基”是指在环上具有3至7个碳原子的环状烷基，非限制性地包括环丙基、环丁基、环戊基、环己基或环庚基；优选为环戊基、环己基和环庚基。

本发明中的术语“药学上可接受的盐”是指与磷酸、硫酸、盐酸等无机酸，或醋酸、酒石酸、柠檬酸、苹果酸等有机酸，或天冬氨酸、谷氨酸等酸性氨基酸形成的盐，或与上述酸成酯或酰胺后再与无机碱形成的盐，如钠、钾、钙、铝盐和铵盐。

本发明中，所述通式I所示的沙蟾毒精衍生物优选自下列化合物中：

在本发明的第二方面，还提供了一种制备本发明的沙蟾毒精衍生物的方法，所述方法包括以下步骤：

(1)如反应式1所示，将化合物沙蟾毒精与氯甲酸对硝基苯酯经酯化反应得到中间体化合物A；

其中，R的定义和优选与前述式I中相同，

(2)将中间体化合物A与胺R-H经取代反应得到通式I化合物。

其中，步骤(1)所述酯化反应的具体条件是本领域技术人员的常规选择，优选地，可以在碱和有机溶剂存在下进行；所述碱选自三乙胺、二异丙基乙基胺、吡啶(Py)或4-(N,N-二甲基)氨基吡啶(DMAP)等中的一种或多种；所述有机溶剂选自二氯甲烷(DCM)等；反应优选在室温下进行，反应时间为2-5h。

其中，步骤(2)所述取代反应的具体条件是本领域技术人员的常规选择，优选地，可以在室温条件下，在碱和有机溶剂存在下进行；所述碱选自三乙胺、碳酸钾、吡啶等中的一种或多种；所述有机溶剂选自二氯甲烷等；反应时间为1-3h。

利用本发明所得的沙蟾毒精衍生物或其药学上可接受的盐可给药于人，可以口服、直肠、肠胃外(静脉内、肌肉内或皮下)、局部给药(粉剂、软膏剂或滴剂)。

用于口服给药的固体剂型包括胶囊剂、片剂、丸剂、散剂和颗粒剂。在这些固体剂型中，通式(I)所示的沙蟾毒精衍生物与至少一种常规惰性赋形剂(或载体)混合，如柠檬酸钠或磷酸二钙，或与下述成分中的一种或多种混合：(a)填料或增容剂，例如，淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和硅酸；(b)粘合剂，例如，羟甲基纤维素、藻酸盐、明胶、聚乙烯基吡咯烷酮、蔗糖和阿拉伯胶；(c)保湿剂，例如，甘油；(d)崩解剂，例如，琼脂、碳酸钙、马铃薯淀粉或木薯淀粉、藻酸、某些复合硅酸盐、和碳酸钠；(e)缓溶剂，例如石蜡；(f)吸收加速剂，例如，季胺化合物；(g)润湿剂，例如鲸蜡醇和单硬脂酸甘油酯；(h)吸附剂，例如，高岭土；和(i)润滑剂，例如，滑石、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、十二烷基硫酸钠。胶囊剂、片剂和丸剂中，剂型也可包含缓冲剂。

固体剂型如片剂、糖丸、胶囊剂、丸剂和颗粒剂可采用包衣和壳材制备，如肠衣和其它本领域公知的材料。它们可包含不透明剂，并且，这种组合物中通式(I)所示的沙蟾毒精衍生物的释放可以以延迟的方式在消化道内的某一部分中释放。可采用的包埋组分的实例是聚合物质和蜡类物质。必要时，通式(I)所示的沙蟾毒精衍生物也可与上述赋形剂中的一种或多种形成微胶囊形式。

用于口服给药的液体剂型包括药学上可接受的乳液、溶液、悬浮液、糖浆或酊剂。除了通式(I)所示的沙蟾毒精衍生物外，液体剂型可包含本领域中常规采用的惰性稀释剂，如水或其它溶剂，增溶剂和乳化剂，例知，乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、丙二醇、1,3-丁二醇、二甲基甲酰胺以及油，特别是棉籽油、花生油、玉米胚油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油或这些物质的混合物等。除了这些惰性稀释剂外，上述组合物也可包含助剂，如润湿剂、乳化剂和悬浮剂、甜味剂、矫味剂和香料。

除了通式(I)所示的沙蟾毒精衍生物外，悬浮液可包含悬浮剂，例如，乙氧基化异十八烷醇、聚氧乙烯山梨醇和脱水山梨醇酯、微晶纤维素、甲醇铝和琼脂或这些物质的混合物等。

用于肠胃外注射的组合物可包含生理上可接受的无菌含水或无水溶液、分散液、悬浮液或乳液，和用于重新溶解成无菌的可注射溶液或分散液的无菌粉末。适宜的含水和非水载体、稀释剂、溶剂或赋形剂包括水、乙醇、多元醇及其适宜的混合物。

用于局部给药的本发明化合物的剂型包括软膏剂、散剂、喷射剂和吸入剂。通式(I)所示的沙蟾毒精衍生物在无菌条件下与生理上可接受的载体及任何防腐剂、缓冲剂，或必要时可能需要的推进剂一起混合。

因此，在本发明的第三方面，还提供了一种药物组合物，它含有治疗有效量的选自根据本发明沙蟾毒精衍生物和其药学上可接受的盐中的一种或多种作为活性成分，以及任选的药学上可接受的载体；所述药学上可接受的载体包括赋形剂、佐剂、辅料或稀释剂。

在本发明第四方面，提供了根据本发明的沙蟾毒精衍生物或其药学上可接受的盐、和包含该衍生物的药物组合物在制备用于治疗恶性肿瘤的药物中的用途。

因此，在本发明的第五方面，提供了一种药物组合物，其包含治疗有效量的选自根据本发明的沙蟾毒精衍生物和其药学上可接受的盐中的一种或多种作为活性成分以及其他药学上可接受的治疗剂，特别是其他抗肿瘤药物。所述药物组合物任选可以进一步包含药学上可接受的载体；所述药学上可接受的载体包括赋形剂、佐剂、辅料或稀释剂。

在本发明的第六方面，提供了一种治疗恶性肿瘤的方法，所述方法包括向具有该需要的患者给药治疗有效量的选自根据本发明的沙蟾毒精衍生物和其药学上可接受的盐中的一种或多种，或根据本发明的包含治疗有效量的选自根据本发明的沙蟾毒精衍生物和其药学上可接受的盐中的一种或多种作为活性成分的药物组合物。其包括给具有该需要的患者给药治疗有效量的选自根据本发明的沙蟾毒精衍生物和其药学上可接受的盐中的一种或多种，或根据本发明的包含治疗有效量的选自根据本发明的沙蟾毒精衍生物和其药学上可接受的盐中的一种或多种作为活性成分的药物组合物。本发明所述的化合物或其药学上可接受的盐可以单独给药，或者与其他药学上可接受的治疗剂联合给药，特别是与其它抗肿瘤病药物组合。所述治疗剂包括但不限于：作用于DNA化学结构的药物抗肿瘤药如顺铂，影响核酸合成的抗肿瘤药物如甲氨蝶呤(MTX)、5-氟尿嘧啶(5FU)等，影响核酸转录的抗肿瘤药物如阿霉素、表阿霉素、阿克拉霉素、光辉霉素等，作用于微管蛋白合成的抗肿瘤药物如紫杉醇、长春瑞滨等，芳香化酶抑制剂如氨鲁米特、兰特隆、来曲唑、瑞宁德等，细胞信号通路抑制剂如表皮生长因子受体抑制剂伊马替尼(Imatinib)、吉非替尼(Gefitinib)、埃罗替尼(Erlotinib)、拉帕替尼(Lapatinib)等。待组合的各成分可同时或顺序地给予，以单一制剂形式或以不同制剂的形式给予。所述组合不仅包括本发明的化合物和一种其它活性剂的组合，而且包括本发明的化合物和两种或更多种其它活性剂的组合。

在本发明中，所述恶性肿瘤非限制性地包括肺癌、结肠癌、胰腺癌、肝癌、乳腺癌、胃癌、食道癌、直肠癌、血癌等；优选为肺癌、结肠癌、胰腺癌等。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步阐述，但不限制本发明。本发明的实验操作具有通用性，不限于发明中提到的化合物。

下述制备例中，¹H-NMR用Varian MercuryAMX300型仪测定。MS用VG ZAB-HS或VG-7070型以及Esquire 3000plus-01005测定。所有溶剂在使用前均经过重新蒸馏，所使用的无水溶剂均是按标准方法干燥处理获得。除说明外，所有反应均是在氩气保护下进行并用TLC跟踪，后处理时均经饱和食盐水洗和无水硫酸镁干燥过程。产品的纯化除说明外均使用硅胶(200-300目)的柱色谱法，所使用的硅胶包括200-300目，GF₂₅₄为青岛海洋化工厂或烟台缘博硅胶公司生产。蟾酥用乙醇提取，浓缩后经柱层析后得到沙蟾毒精。

制备实施例1沙蟾毒精-3-N-(2-甲氨基乙基)氨基甲酸酯(化合物1)

在50mL圆底烧瓶中，将氯甲酸对硝基苯酯(1.206g，6mmol)溶于10mL无水二氯甲烷中，加入干燥吡啶(0.67mL)，立刻出现白色沉淀，氮气保护条件下滴加沙蟾毒精(2mmol)的二氯甲烷溶液(10mL),在室温下搅拌6小时，反应完毕后用水洗涤两次，无水硫酸钠干燥后，减压浓缩经硅胶柱层析(v:v＝90:10，石油醚/丙酮)得到中间体A。在10mL圆底烧瓶中，将中间体A溶于3mL二氯甲烷中，加入三乙胺(35μL)，加入N-甲基乙二胺(6mmol)，在室温下搅拌2小时，反应完毕后用饱和碳酸钠溶液洗涤一次，反复用水洗涤直至溶液澄清，无水硫酸钠干燥后，减压浓缩经硅胶柱层析，石油醚/丙酮/氨水(v:v:v＝50:50:0.5)，得到化合物1，产率为66％。¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ7.72(dd,J＝9.8,2.6Hz,1H),7.39(d,J＝2.6Hz,1H),6.28(d,J＝9.8Hz,1H),4.99(s,1H),4.33(dd,J＝11.0,2.4Hz,1H),4.10(dd,J＝10.8,2.4Hz,1H),3.89–3.79(m,1H),3.38–3.27(m,2H),2.94(s,3H),2.89–2.80(m,2H),2.46(d,J＝13.3Hz,1H),2.16–1.25(m,15H),1.18(s,3H),0.92(s,3H)；ESI-MS(m/z)517.3[M+1]⁺。

制备实施例2沙蟾毒精-3-N-(2-乙氨基乙基)氨基甲酸酯(化合物2)

反应操作如化合物1的制备，原料用N-乙基乙二胺代替N-甲基乙二胺；硅胶柱层析洗脱液：石油醚/丙酮/氨水(v:v:v＝50:50:0.5)，产率为63％。¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ7.71(dd,J＝9.8,2.6Hz,1H),7.39(d,J＝2.6Hz,1H),6.29(d,J＝9.8Hz,1H),4.97(s,1H),4.32(dd,J＝11.3,2.4Hz,1H),4.10(dd,J＝9.6,7.4Hz,1H),3.82(d,J＝3.1Hz,1H),3.38–3.20(m,2H),2.93–2.82(m,2H),2.81–2.74(m,2H),2.41(d,J＝13.3Hz,1H),2.15–1.29(m,15H),1.25(t,J＝7.1Hz,3H),1.18(s,3H),0.92(s,3H)；ESI-MS(m/z)531.3[M+1]⁺。

制备实施例3沙蟾毒精-3-N-(2-二甲氨基乙基)氨基甲酸酯(化合物3)

反应操作如化合物1的制备，原料用N,N-二甲基乙二胺代替N-甲基乙二胺；硅胶柱层析洗脱液：石油醚/丙酮/氨水(v:v:v＝50:50:0.5)，产率为61％。¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ7.71(dd,J＝9.8,2.6Hz,1H),7.39(d,J＝2.6Hz,1H),6.29(d,J＝9.8Hz,1H),4.97(s,1H),4.32(d,J＝11.1Hz,1H),4.11(d,J＝9.3,2.2Hz,1H),3.36–3.21(m,2H),2.50–2.44(m,2H),2.40(d,J＝16.3Hz,1H),2.29(s,6H),2.25–1.21(m,15H)1.18(s,3H),0.92(s,3H)；ESI-MS(m/z)531.3[M+1]⁺。

制备实施例4沙蟾毒精-3-N-(2-乙氨基乙基)-N-乙基-氨基甲酸酯(化合物4)

反应操作如化合物1的制备，原料用N,N’-二乙基乙二胺代替N-甲基乙二胺；硅胶柱层析洗脱液：石油醚/丙酮/氨水(v:v:v＝50:50:0.5)，产率为66％。¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ7.71(dd,J＝9.7,2.6Hz,1H),7.39(d,J＝2.6Hz,1H),6.29(d,J＝9.7Hz,1H),4.99(s,1H),4.33(d,J＝11.1Hz,1H),4.10(dd,J＝8.4,2.9Hz,1H),3.83(s,1H),3.50–3.27(m,4H),3.05–2.67(s,5H),2.48(d,J＝13.9Hz,1H),2.11–1.11(m,21H)1.19(s,3H),0.92(s,3H)；ESI-MS(m/z)559.3[M+1]⁺。

制备实施例5沙蟾毒精-3-N-(2-甲氨基丙基)氨基甲酸酯(化合物5)

反应操作如化合物1的制备，原料用N,N-二甲基丙二胺代替N-甲基乙二胺；硅胶柱层析洗脱液：石油醚/丙酮/氨水(v:v:v＝50:50:0.5)，产率为60％。¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ7.72(dd,J＝9.8,2.4Hz,1H),7.39(d,J＝2.4Hz,1H),6.28(d,J＝9.8Hz,1H),4.94(s,1H),4.32(dd,J＝11.2,2.8Hz,1H),4.10(dd,J＝9.5,7.0Hz,1H),3.83(d,J＝3.4Hz,1H),3.30–3.11(m,2H),2.40(d,J＝14.6Hz,1H),2.33(t,J＝6.9Hz,3H),2.21(s,6H),2.11–1.25(m,17H)1.17(s,3H),0.91(s,3H)。ESI-MS(m/z)545.3[M+1]⁺。

制备实施例6沙蟾毒精-3-N-(哌啶-4-基)氨基甲酸酯(化合物6)

反应操作如化合物1的制备，原料用4-氨基哌啶代替N-甲基乙二胺；硅胶柱层析洗脱液：石油醚/丙酮/氨水(v:v:v＝50:50:0.5)，产率为70％。¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ7.71(dd,J＝9.7,2.6Hz,1H),7.39(d,J＝2.6Hz,1H),629(d,J＝9.7Hz,1H),4.98(s,1H),4.33(d,J＝11.1Hz,1H),4.11–4.09(m,2H),3.83(s,1H),2.96–2.74(m,3H),2.45(d,J＝13.8Hz,1H),2.11–1.02(m,22H),1.19(s,3H),0.92(s,3H)；ESI-MS(m/z)543.3[M+1]⁺。

制备实施例7沙蟾毒精-3-N-(2-哌嗪基)氨基甲酸酯(化合物7)

反应操作如化合物1的制备，原料用哌嗪代替N-甲基乙二胺；硅胶柱层析洗脱液：石油醚/丙酮/氨水(v:v:v＝50:50:0.5)，产率为65％。¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ7.71(dd,J＝9.6,2.6Hz,1H),7.39(d,J＝2.6Hz,1H),6.29(d,J＝9.6Hz,1H),5.01(s,1H),4.33(d,J＝11.1Hz,1H),4.10(dd,J＝8.1,1.7Hz,1H),3.83(s,1H),3.50–3.41(m,4H),2.84(t,J＝5.0Hz,4H),2.77–2.70(m,2H),2.46(d,J＝13.5Hz,1H),2.11–1,11(m,17H)1.19(s,3H),0.92(s,3H)；ESI-MS(m/z)529.3[M+1]⁺。制备实施例8沙蟾毒精-3-N-(1-高哌嗪基)氨基甲酸酯(化合物8)

反应操作如化合物1的制备，原料用高哌嗪代替N-甲基乙二胺；硅胶柱层析洗脱液：石油醚/丙酮/氨水(v:v:v＝50:50:0.5)，产率为62％。¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ7.71(dd,J＝9.8,2.6Hz,1H),7.39(d,J＝2.6Hz,1H),6.29(d,J＝9.8Hz,1H),5.02(s,1H),4.32(d,J＝11.1Hz,1H),4.12(dd,J＝7.6,2.2Hz,1H),3.83(s,1H),3.68–3.51(m,4H),3.12–2.99(m,4H),2.48(d,J＝13.8Hz,1H),2.11–1.24(m,17H),1.18(s,3H),0.92(s,3H)；ESI-MS(m/z)543.3[M+1]⁺。

制备实施例9沙蟾毒精-3-N-(1-甲氨哌嗪-4-基)氨基甲酸酯(化合物9)

反应操作如化合物1的制备，原料用N-甲基哌嗪代替N-甲基乙二胺；硅胶柱层析洗脱液：石油醚/丙酮/氨水(v:v:v＝50:50:0.5)，产率为78％。¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ7.72(dd,J＝9.7,2.6Hz,1H),7.39(d,J＝2.6Hz,1H),6.28(d,J＝9.7Hz,1H),4.99(s,1H),4.32(dd,J＝11.2,3.5Hz,1H),4.10(dd,J＝9.6,6.9Hz,1H),3.83(d,J＝3.6Hz,1H),3.52–3.48(m,4H),2.45(d,J＝13.8Hz,1H),2.43–2.34(m,4H),2.30(s,3H),2.11–1.27(m,15H),1.18(s,3H),0.91(s,3H).ESI-MS(m/z)543.3[M+1]⁺。

试验实施例

试验实施例1体外抗肿瘤活性实验

(1)试验材料

A-549人非小细胞性肺癌细胞株，HCT-116人结肠癌细胞株，Calu-6人退行性癌细胞株，PANC-1人胰腺癌细胞株，SW620人结肠癌细胞株，NSCLC人非小细胞性肺癌细胞株，以上细胞株均为KRAS突变的细胞株，来自北京基因组研究所。

待测化合物1～9由制备实施例1～9得到，纯度由HPLC-UV检测98％以上，结构由NMR确证。阳性对照为沙蟾毒精，阴性对照为0.25％DMSO。待测化合物，阳性对照和阴性对照分别用培养基稀释，浓度梯度为300μΜ,100μΜ,10μΜ,3μΜ,1μΜ,0.1μΜ,0.01μΜ。

(2)实验方法

Lumi-Glow^TM细胞活力增值检测实验

根据细胞生长速率，将处于对数生长期的肿瘤细胞以90μL/孔接种于96孔培养板，贴壁生长24小时再加待测化合物，阳性对照或阴性对照10μL/孔。每个浓度设三复孔。肿瘤细胞在37℃、5％CO₂条件下培养48小时。将待测细胞在室温平衡20min；实验前将Lumi-Glow^TM细胞活力检测试剂平衡至室温，轻摇混匀试剂，加50μL试剂到100μL96孔板细胞中，用加样枪上下混匀细胞；将细胞在室温避光孵育10-15分钟；在Luminescence读板仪上记录发光信号。

按以下列公式计算肿瘤细胞生长的抑制率：

抑制率％＝(样品吸光值-空白吸光值)]/(阴性对照吸光值-空白吸光值)×100％

药物作用浓度：30μΜ,10μΜ,3μΜ,1μΜ,0.1μΜ,0.01μΜ,0.001μΜ。

实验数据用GraphPadPrism 7拟合出IC₅₀。

将制备的部分沙蟾毒精衍生物首先在人源A549肿瘤细胞株上进行细胞增殖抑制活性的评价，结果见表1。

表1、沙蟾毒精衍生物对人源A549肿瘤细胞株的细胞增殖抑制活性

化合物	IC<sub>50</sub>(nM)(48h)	化合物	IC<sub>50</sub>(nM)(48h)
				沙蟾毒精	11.68±0.77	1	4.50±0.35
2	2.86±0.21	3	5.76±0.62
				5	5.28±0.46	6	1.36±0.11
7	6.66±0.82	8	6.74±0.58

通过对沙蟾毒精衍生物抑制人源A549肿瘤细胞株的细胞增殖活性评价，发现本发明大部分沙蟾毒精衍生物抑制人源A549肿瘤细胞株的细胞增殖活性强于沙蟾毒精，其中化合物2和6的活性比沙蟾毒精分别提高了4倍和9倍。

在以上评价的基础上，我们又选取了活性较强的2和6，对它们对多株人源肿瘤细胞株的细胞增殖抑制活性进行评价，结果见表2。

表2、沙蟾毒精、化合物2和6对人源肿瘤细胞株的细胞增殖抑制活性

以上实验数据表明，与沙蟾毒精相比，沙蟾毒精衍生物2和6对所选的KRAS突变的人源肿瘤细胞株的细胞增殖抑制活性都有明显地提高。

Claims

1.一类具有通式I所示的沙蟾毒精衍生物，或其药学上可接受的盐，其中

所述通式I所示的沙蟾毒精衍生物选自下列化合物中：

。

2.一种制备权利要求1所述的具有通式I所示的沙蟾毒精衍生物或其药学上可接受的盐的方法，其特征在于，包括如下步骤：

其中，R的定义与相应权利要求中式I中相同，

(2)将中间体化合物A与胺R-H经取代反应得到通式I化合物。

3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤(1)所述酯化反应在碱和有机溶剂存在下进行；所述碱选自三乙胺、二异丙基乙基胺、吡啶或4-(N,N-二甲基)氨基吡啶中的一种或多种；所述有机溶剂为二氯甲烷；反应在室温下进行，反应时间为2-5h。

4.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤(2)所述取代反应在室温条件下，在碱和有机溶剂存在下进行；所述碱选自三乙胺、碳酸钾、吡啶中的一种或多种；所述有机溶剂为二氯甲烷；反应时间为1-3h。

5.一种药物组合物，其含有治疗有效量的选自权利要求1所述的具有通式I所示的沙蟾毒精衍生物和其药学上可接受的盐中的一种或多种作为活性成分，以及任选的药学上可接受的载体。

6.权利要求1所述的具有通式I所示的沙蟾毒精衍生物或其药学上可接受的盐，或者权利要求5所述的药物组合物在制备用于治疗KRAS突变的恶性肿瘤的药物中的用途。

7.如权利要求6所述的用途，其特征在于：所述KRAS突变的恶性肿瘤包括KRAS突变的：肺癌、结肠癌、胰腺癌、肝癌、乳腺癌、胃癌、食道癌、直肠癌、血癌。

8.如权利要求6所述的用途，其特征在于：所述KRAS突变的恶性肿瘤包括KRAS突变的：肺癌、结肠癌、胰腺癌。

9.一种药物组合物，其包含治疗有效量的选自权利要求1所述的具有通式I所示的沙蟾毒精衍生物和其药学上可接受的盐中的一种或多种作为活性成分以及其他药学上可接受的治疗剂。