CN101016327A - 一类蟾蜍甾烯化合物及其制法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一类蟾蜍甾烯化合物即3－表－远华蟾毒精(3－epi－telocinobufagin)及其衍生物，经核磁鉴定和检索为一类新的化合物，具有明显的抑制癌细胞生长的活性。本发明还提供了利用植物悬浮细胞系建立了生物转化获得3－表－远华蟾毒精的方法，有助于转化产物的高效合成，且成本较低，可广泛应用于大规模制备。
Description
技术领域
本发明属药物化学及其制备技术领域，具体涉及一类甾烯类化合物。本发明还涉及该类甾烯化合物的合成方法和应用。
背景技术
蟾蜍甾烯是一类C-17位连接六元不饱和内酯环(α-吡喃酮环)的甾体化合物。天然的蟾蜍甾烯A/B环为顺式或反式稠合，B/C环均为反式，但与一般甾体不同的是，其C/D环为顺式稠合。除C-3位大多有羟基外，蟾蜍甾烯往往在5 β-，6β-，11α-，12α-/β-，14β-，16β-及19-位有含氧取代(多为羟基或乙酰氧基)，有的则在14β，15β-位形成三元氧环。19-位有的氧化为醛基，有的C-19缺如。分子中的双键以Δ4，5最为常见，此外亦有Δ14，15，Δ3，4及Δ6，7等。C-12有的为羰基取代，C-3及C-11上的羰基亦可见到。
自1933年从海葱中分离出第一个蟾蜍甾烯以来，至今从天然界得到的此类化合物已接近300种。由于此类化合物，尤其是蟾毒灵(bufalin)在抗肿瘤和强心等方面的应用价值，使得人们不断发现和探索新的此类化合物。
蟾蜍甾烯广泛地分布于蟾蜍属动物(Bufo spp.)体内，目前已从此属动物体表腺体分泌的浆液、外皮、血浆、卵巢、胆汁、大脑及其它组织中分离到此类化合物，其中以浆液及外皮中含量最高。此外，蟾蜍甾烯在蛇类的浆液及节肢动物中也有少量存在。
蟾蜍甾烯在植物界的分布主要集中于少数几个科，如Hyacinthaceae、毛茛科(Ranunculaceae)、景天科(Crassulaceae)等，其中以Urginea属植物的研究最为深入。
蟾蜍甾烯类化合物具有强心、局部麻醉、抗休克、抗病毒等多种活性，是中药蟾酥的主要有效成分。近年来发现此类化合物具有显著的抗肿瘤活性，国内外学者对其抑瘤作用及相关机制作了大量的研究，尤以蟾毒灵(bufalin)报道最多。蟾蜍甾烯类化合物对肿瘤细胞的抑制，以蟾毒灵的活性最为显著。其抗肿瘤机制目前尚不完全清楚，主要是通过诱导细胞凋亡，促进细胞分化。
蟾蜍甾烯类化合物的抗肿瘤活性呈现明显的构效关系。Kamano等测试了80种天然蟾蜍甾烯及其化学合成衍生物对肝癌细胞PLC/PRF/5的体外抑制作用。结果表明C-17位α-吡喃酮环，3β-OH，14β-OH(或14β，15β-三元氧环)及C/D环顺式稠合等结构基团是此类化合物抗肿瘤活性所必需的。19-位甲基氧化为醛基一般使活性增强；14-位为β-OH的蟾蜍甾烯比14β，15β-位形成三元氧环的作用更强，其中hellebrigenin及bufalin在所有受试化合物中活性最强。华蟾毒精是所有含14β，15β-三元氧环的化合物中活性最强的。此类化合物19-位氧化为醛基时活性增强，而为羟甲基则活性减弱；16-位引入乙酰氧基使活性显著增强，而引入羟基或其它酯基则降低活性。17-位连接五元不饱和内酯环的洋地黄毒苷元(digitoxigenin)也呈现出较强的活性，但此类化合物的作用比相应的蟾蜍甾烯弱一些。蟾蜍甾烯17-位内酯环打开则基本丧失细胞毒活性。总的看来，天然蟾蜍甾烯比化学合成的衍生物活性更强，且对耐药细胞株亦表现出明显的抑制作用。Kamano等还根据生物测定的结果，采用比较分子场分析(CoMFA)，建立了蟾蜍甾烯类化合物的3D-QSAR模型，可用于此类化合物细胞毒活性的预测。蟾蜍甾烯所表现出的抗肿瘤活性构效关系与其表面麻醉及抗病毒活性具有一定的相似性，而强心活性的构效关系目前仅见强心甾烯(17-位为五元内酯环)的报道，对蟾蜍甾烯则研究不多。
目前，尚未见以蟾毒成分为底物应用生物合成的方法获得3-表-远华蟾毒精等一类新的蟾蜍甾烯化合物的报道。经美国化学学会数据库、英国皇家化学学会数据库和相关文献等的检索证明本发明所提供的化合物为一类新的蟾蜍甾烯化合物。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一类羟基化蟾蜍甾烯化合物及制备方法和应用，以克服现有蟾蜍甾烯化合物水溶性低和体外实验中抗肿瘤细胞活性较低、现有的蟾毒灵生物转化方法的合成效率低的缺陷。
技术方案
本发明的技术方案之一为提供一类蟾蜍甾烯化合物，其特征在于，具有如下结构通式：
其中，R1-R8可独立地选自H、羟基、葡萄糖基、乙酰基、醛基、甲基、酮基、卤素、氰基、硝基、巯基、取代或未取代烷基或烯基，以及上述基团的不同键接或组合。
上述的蟾蜍甾烯化合物优选为，所说的R1-R8均为H，即所说的蟾蜍甾烯化合物为3-表-远华蟾毒精，结构式为：
此蟾蜍甾烯化合物在常温下为固体粉末，熔点为190-191℃。其高分辨质谱结果为m/z403.3853[M+H]+和m/z 425.3712[M+Na]+，得到3-表-远华蟾毒精的分子式为C24H34O5
本发明的技术方案之二为提供上述的蟾蜍甾烯化合物的制备方法，包括以下步骤：
A)将蟾毒底物和长春花悬浮细胞共培养；
B)利用高压液相层析或萃取/硅胶层析方法分离纯化获得产物。
上述的蟾蜍甾烯化合物的制备方法的优选方案之一为，所说的步骤A)前有一个蟾毒底物提取分离的反应，包括如下步骤：
a)蟾酥浸膏溶解成匀浆样品；
b)过硅胶柱，分段收集获得远华蟾毒精作为蟾毒底物。
上述的蟾蜍甾烯化合物的制备方法的优选方案之二为，所说的步骤A)中共培养的培养基为MS+NAA0.1-1.0mg/L+6-BA0.1-1.0mg/L。
本发明的技术方案之三为提供上述的蟾蜍甾烯化合物在制备强心、局部麻醉、抗休克、抗病毒、抗肿瘤药物中的应用，即所述的各个化合物与赋形剂一起制成水溶性注射针剂、固体片剂、胶囊或者口服液、或者各个化合物与抛射剂一起装在具有特制阀门系统的耐压严封容器中制成气雾剂。
优选将上述的3-表-远华蟾毒精制成水溶性注射针剂。
有益效果
1.所合成的3-表-远华蟾毒精等化合物，是一类新型结构的蟾蜍甾烯化合物。
2.利用植物悬浮细胞系建立了生物转化获得3-表-远华蟾毒精的方法。
3.通过核磁鉴定和检索3-表-远华蟾毒精为一新的化合物。
4.3-表-远华蟾毒精具明显的抑制癌细胞生长的活性。
5.生物转化方法的改进，比如基因克隆与转化的方法，有助于3-表-远华蟾毒精更加高效合成。
6.生物转化方法成本较低，可广泛应用于大规模制备。
如本文所用，术语“蟾毒底物”是指蟾酥浸膏样品在经过实施例3所述的分离过程后获得的含蟾毒灵、脂蟾毒配基以及华蟾毒精等成分的混合底物。这个“蟾毒底物”与桔梗悬浮细胞液共培养获得一系列3-表-远华蟾毒精及其衍生物等的新型结构的蟾蜍甾烯化合物。
如本文所用，术语“转化产物”是指蟾毒底物经过生物转化后，经分离纯化获得的一类蟾蜍甾烯化合物的混合物，具有相应的生物活性。
附图说明
图1是3-表-远华蟾毒精即3-epi-telocinobufagin结构图。
图2是3-表-远华蟾毒精1HNMR(核磁共振氢谱)(DMSO(二甲基亚砜)，500MHz)
图3是3-表-远华蟾毒精13CNMR(核磁共振碳谱)(DMSO，500MHz)
图4是3-表-远华蟾毒精DEPT(结构碳的类型)(DMSO，500MHz)
图5是3-表-远华蟾毒精1H-1H COSY(氢氢相关)(DMSO，500MHz)
图6是3-表-远华蟾毒精HMBC(碳氢相关)(DMSO，500MHz)
图7是3-表-远华蟾毒精HMQC(碳氢远程相关)(DMSO，500MHz)
图8、9是3-表-远华蟾毒精HRESIMS(质谱图)。高分辨质谱结果为m/z 403.3853[M+H]+和m/z 425.3712[M+Na]+，3-表-远华蟾毒精的分子式为C24H34O5
图10是3-表-远华蟾毒精IR(红外图谱)
图11是集落形成法测3-表-远华蟾毒精对白血病HL-60细胞系的抑制效果比较。图中，纵坐标表示集落形成数；横坐标1为空白对照；2为10μL/mL甲醇对照；3、4分别为3-表远华蟾毒精溶于10μL/mL甲醇中，浓度为0.5 mg/L、0.05mg/L。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。所使用的细胞系：长春花悬浮细胞系，来自于北京大学药学院生药学生物技术研究室；白血病HL-60细胞系，来自于上海师范大学细胞工程研究室。
实施例1
悬浮细胞系的建立：长春花外植体→愈伤组织的诱导→悬浮细胞。
在无菌工作台上，取下长春花幼叶组织，70％乙醇清洗，0.1％升汞灭菌。接于NAA0.5-1mg/L，6-BA0.3-0.8mg/L激素的MS培养基上，半个月后陆续诱导出愈伤组织。诱导出的愈伤组织经多次转接筛选，挑选外观形态良好的愈伤细胞固体放大培养，在细胞生长达到最优状态时，转接于(MS+NAA0.5mg/L+6-BA0.5mg/L+蔗糖3％，pH5.8)液体培养液，进行悬浮培养。
实施例2
悬浮培养系建立：细胞系于固体培养基上转接15天后，据外观形态将继代良好的愈伤组织约50克，转接于悬浮培养液(MS+NAA0.5mg/L+6-BA0.5mg/L+蔗糖3％，pH5.8)，于25℃、100r/min震荡悬浮培养20天。细胞系均匀分散后，放大培养：以100毫升的细胞悬浮液转接于300毫升的新鲜培养液，继续震荡培养15天。然后分装，每10天转接一次。分批放大与分装，用于蟾毒底物转化。
实施例3
蟾毒底物提取分离：蟾酥浸膏经水溶解成匀浆样品10升，用氯仿萃取(10L×4次)，氯仿提取物溶于少量的氯仿丙酮中，与3倍量的硅胶混和，除去溶剂，待完全干燥后，装入硅胶柱。硅胶柱直径4.5cm，长60cm。硅胶pH 5.3粒度为100-200目。洗脱，洗脱液为不同梯度的丙酮-环己烷(1∶5)洗脱液。分段收集，得流份5-10得脂蟾毒配基、流份11-13得华蟾毒精、流份14-15得华蟾毒精和蟾毒灵、流份16-20得蟾毒灵、流份33-35得蟾毒它灵。流份36-42得远华蟾毒精。还可以进一步分离流份14-15中的少量的华蟾毒精和蟾毒灵。
实施例4
生物转化方法：
预实验：长春花细胞悬浮培养液中加入含远华蟾毒精的混合蟾毒底物，在25℃，12小时光照条件下共培养，乙酸乙酯萃取，浓缩，溶于少量的丙酮。石油醚：丙酮为展开剂，10％硫酸醇120℃显色，TLC(硅胶G，0.3％CMC-Na粘合剂)薄层层析分析结果。
转化产物放大：将15mg/mL的含远华蟾毒精的混合蟾毒底物投入长春花悬浮细胞液，培养基为MS+NAA0.5mg/L+6-BA0.5mg/L+蔗糖3％，pH5.8。在25℃、12小时光或暗培养条件下共培养，乙酸乙酯萃取，浓缩，合并回收。
转化产物分离、制备方法同实施例3。回收浸膏与硅胶拌样，层析硅胶(200-300目)分离。丙酮-环己烷梯度洗脱，薄层分析后，合并流份，凝胶过滤。
HPLC制备：流速2mL/min、检测波长298nm、甲醇：水流动相转化产物。
实施例5
集落形成法细胞毒活性的测定：HL-60细胞系培养在含20％胎牛血清的RPMI1640培养基中，调整细胞密度每毫升1000细胞，种植于细胞培养孔板中，转化产物溶于10μL/mL甲醇中，按照空白、甲醇、3-表-远华蟾毒精设置。3-表-远华蟾毒精浓度为0.5mg/L、0.05mg/L加入HL-60细胞系，于CO2培养箱中培养5天，显微镜下测形成集落数。
3-表-远华蟾毒精对白血病HL-60细胞系抑制实验结果见表1所示，表2的方差分析表明3-表-远华蟾毒精具有明显的细胞抑制活性。
表1 集落形成法测3-表-远华蟾毒精对白血病HL-60细胞系抑制结果
方差分析：单因素方差分析
SUMMARY
| 处理 | 观测数 | 求和 | 平均 | 方差 |
| 1234 | 4444 | 736826197546 | 184206.549.25136.5 | 34.666672163252.91672091.667 |
方差分析
| 差异源 | SS | df | MS | F | P-value | F crit |
| 组间组内总计 | 58160.1913626.7571786.94 | 31215 | 19386.731135.563 | 17.07236 | 0.000126 | 3.490295 |
实施例6
转化产物经高压液相制备(甲醇：水流动相)、检测无杂质时，将少许转化产物3-表-远华蟾毒精溶于DMSO中，在500MHz核磁共振仪测得如下结果：
表33-表远华蟾毒13C NMR和1H NMR
| C | 3-表远华蟾毒精 | H | 3-表远华蟾毒精 |
| 123456789101112131415161718192021222324/// | 24.9t/28.3t/65.9d41.9t/73.0s32.0t/23.5d/40.5d38.2d16.1s21.1t/40.0t47.8s83.4s30.1t/29.5t/49.9d16.5q16.1q122.6s149.1d147.3d114.1d161.4s/// | 123456789111215161718192122233-OH5-OH14-OH | 1.371.301.381.203.72 brs1.781.33/1.531.241.271.051.451.56/1.851.111.42//1.95 d(7.5)1.602.071.622.450.74(3H，s)0.58(3H，s)/7.50 d (2.0)7.9 dd(12，2.0)6.27 d(9.5)/4.24 d(5.5)3.87 s4.14 s |
Claims (10)
1.一类蟾蜍甾烯化合物，其特征在于，具有如下结构通式：
其中，R1-R8可独立地选自H、羟基、葡萄糖基、乙酰基、醛基、甲基、酮基、卤素、氰基、硝基、巯基、取代或未取代烷基或烯基，以及上述基团的不同键接或组合。
2.根据权利要求1所述的蟾蜍甾烯化合物，其特征在于，所说的R1-R8均为H，即所说的蟾蜍甾烯化合物为3-表-远华蟾毒精，结构式为：
3.根据权利要求2所述的蟾蜍甾烯化合物，其特征在于，在常温下为固体粉末。
4.根据权利要求2所述的蟾蜍甾烯化合物，其特征在于，熔点为190-191℃。
5.根据权利要求2所述的蟾蜍甾烯化合物，其特征在于，其高分辨质谱结果为m/z403.3853[M+H]+和m/z 425.3712[M+Na]+，且3-表-远华蟾毒精的分子式为C24H34O5.
6.权利要求1所述的蟾蜍甾烯化合物的制备方法，包括以下步骤：
A)将蟾毒底物和长春花悬浮细胞共培养；
B)利用高压液相层析或萃取/硅胶层析方法分离纯化获得产物。
7.根据权利要求6所述的蟾蜍甾烯化合物的制备方法，其特征在于，所说的步骤A)前有一个蟾毒底物提取分离的反应，包括如下步骤：
a)蟾酥浸膏溶解成匀浆样品；
b)过硅胶柱，分段收集获得远华蟾毒精作为蟾毒底物。
8.根据权利要求6所述的蟾蜍甾烯化合物的制备方法，其特征在于，所说的步骤A)中共培养的培养基为MS+NAA0.1-1.0mg/L+6-BA0.1-1.0mg/L。
9.权利要求1所述的蟾蜍甾烯化合物在制备强心、局部麻醉、抗休克、抗病毒、抗肿瘤药物中的应用，其特征在于，所述的各个化合物与赋形剂一起制成水溶性注射针剂、固体片剂、胶囊或者口服液、或者各个化合物与抛射剂一起装在具有特制阀门系统的耐压严封容器中制成气雾剂。
10.根据权利要求9所述的蟾蜍甾烯化合物在制备强心、局部麻醉、抗休克、抗病毒、抗肿瘤药物中的应用，其特征在于，将上述的3-表-远华蟾毒精制成水溶性注射针剂。
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| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C12 | Rejection of a patent application after its publication | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |