CN102416047A - 牡丹皮提取物及丹皮酚的医药用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及医药学领域,特别是涉及一种牡丹皮提取物和丹皮酚及其医药用途。本发明的牡丹皮提取物和丹皮酚可用于治疗肝纤维化。
Description
技术领域
本发明涉及医药学领域,特别是涉及一种牡丹皮提取物及丹皮酚的医药用途。
背景技术
牡丹皮为毛茛科多年生落叶小灌木植物牡丹Paeonia suffruticosa Andr.的干燥根皮,处方名丹皮、粉丹皮。味辛、苦,性凉。其具有清热凉血,活血散瘀的功效。牡丹皮的主要成分为丹皮酚(别名:芍药醇、牡丹酚)、芍药甙、氧化芍药甙等。
肝纤维化是指由各种致病因子所致肝内结缔组织异常增生,导致肝内弥漫性细胞外基质过度沉淀的病理过程。轻者称为肝纤维化,重者使肝小叶结构改建,假小叶及结节,成为肝硬化。
肝星状细胞(hepatic stellate cell,HSC)位于肝窦周间隙(Disse间隙)内,紧贴着肝窦内皮细胞(sinusoidalendothelialcells,SEC)和肝细胞。其形态不规则,胞体呈圆形或不规则形,常伸出数个星状胞突包绕着肝血窦。正常情况下肝星状细胞处于静止状态。当肝脏受到炎症或机械刺激等损伤时,肝星状细胞被激活,其表型由静止型转变为激活型。激活的肝星状细胞一方面通过增生和分泌以胶原为主的细胞外基质(ECM)参与肝纤维化的形成和肝内结构的重建,另一方面通过细胞收缩使肝窦内压升高。这两类变化最终奠定了肝纤维化、门静脉高压症发病的病理学基础。
牡丹皮主治温病热病热入营血之壮热、身发斑疹、舌红绛、阴虚发热、血热妄行之吐血等病症。丹皮酚具有镇静、降温、解热、镇痛、解痉等中枢抑制作用。但迄今未见牡丹皮及丹皮酚具有预防和治疗肝纤维化及肝硬化作用的相关报道。
发明内容
本发明的目的旨在提供丹皮酚及牡丹皮提取物的一种新的医药用途。
本发明的第一方面是提供了丹皮酚用于制备预防或者治疗肝纤维化的药物的用途。
本发明的第二方面是提供了一种牡丹皮提取物,其包含至少10%重量比的丹皮酚,且所述丹皮酚的含量小于100%。
在另一优选例中,所述丹皮酚的含量至少为50%。
在另一优选例中,所述丹皮酚的含量至少为70%。
在另一优选例中,所述牡丹皮提取物可由如下方法制得:牡丹皮粗粉加水煎煮,煎煮液冷却离心,去上清液,浓缩后通过ODS柱或大孔吸附树脂柱,再分别用水,30%乙醇,60%乙醇和95%乙醇进行梯度洗脱,收集洗脱液,浓缩干燥。
本发明的第三方面是提供了一种牡丹皮提取物用于制备预防或者治疗肝纤维化的药物的用途,其中所述牡丹皮提取物包含至少10%重量比的丹皮酚,且所述丹皮酚的含量小于100%。
在另一优选例中,所述丹皮酚的含量至少为50%。
在另一优选例中,所述丹皮酚的含量至少为70%。
在另一优选例中,所述牡丹皮提取物可由如下方法制得:牡丹皮粗粉加水煎煮,煎煮液冷却离心,去上清液,浓缩后通过ODS柱或大孔吸附树脂柱,再分别用水,30%乙醇,60%乙醇和95%乙醇进行梯度洗脱,收集洗脱液,浓缩干燥。
本发明各个方面的细节将在随后的章节中得以详尽描述。通过下文以及权利要求的描述,本发明的特点、目的和优势将更为明显。
附图说明
图1实施例8的各组肝组织天狼星红胶原染色示意图(×100)
N:正常组;M:模型组;
MDP-60-L:mdp-60低剂量组;MDP-60-M:mdp-60中剂量组;
MDP-60-H:mdp-60高剂量组;
DPF-L:丹皮酚低剂量组;DPF-M:丹皮酚中剂量组;
DPF-H:丹皮酚高剂量组;
NAC:N-乙酰半胱氨酸对照组。
具体实施方式
本发明的问世部分是基于这样一个意外发现:丹皮酚及牡丹皮提取物在体外和/或体内可显著抑制肝星状细胞增殖以及抗肝细胞损伤。因此,本发明的丹皮酚及牡丹皮提取物可用于制备预防或者治疗肝纤维化的药物。
进而,本发明提供了一种丹皮酚用于制备预防或者治疗肝纤维化的药物的用途。
本发明的另一方面是提供一种牡丹皮提取物,其包含至少10%重量比的丹皮酚,且所述丹皮酚的含量小于100%;其中,较优选地,所述丹皮酚的含量至少为50%;更优选地,所述丹皮酚的含量至少为70%。
本发明的另一方面是提供一种牡丹皮提取物用于制备预防或者治疗肝纤维化的药物的用途,其中所述提取物包含至少10%重量比的丹皮酚,且所述丹皮酚的含量小于100%。其中,较优选地,所述丹皮酚的含量至少为50%;更优选地,所述丹皮酚的含量至少为70%。
本发明还提供了一种药物组合物,包括治疗有效量的本发明的丹皮酚或牡丹皮提取物和可药用载体。“治疗有效量”是指能够达到治疗效果的丹皮酚或牡丹皮提取物的量。本领域的专业人员能够理解“治疗有效量”可以随着给药的方式、载体的使用以及可能和其他治疗剂合用等而有所不同。
本发明的丹皮酚可通过商业途径购买或者用本领域的常规方法从牡丹皮中提取获得。同样地,本发明的牡丹皮提取物亦可用本领域的常规方法制得,例如可将牡丹皮粗粉加水煎煮,煎煮液冷却离心,去上清液,浓缩后通过ODS柱或大孔吸附树脂柱,再分别用水,30%乙醇,60%乙醇和95%乙醇进行梯度洗脱,收集洗脱液,浓缩干燥制得。。
本发明的丹皮酚或者牡丹皮提取物可以单独使用或以药物组合物的形式使用。药物组合物包括作为活性成分的本发明的丹皮酚或牡丹皮提取物及可药用载体。较佳地,本发明的药物组合物含有0.1-99.9%重量百分比的作为活性成分的本发明的丹皮酚或者牡丹皮提取物。“可药用载体”不会破坏本发明的丹皮酚或牡丹皮提取物的药学活性,同时其有效用量,即能发挥药物载体作用时的用量对人体无毒。
所述可药用载体包括但不限于:软磷脂、硬脂酸铝、氧化铝、离子交换材料、自乳化药物传递系统、吐温或其他表面活化剂、血清蛋白、缓冲物质如磷酸盐、氨基乙酸、山梨酸、水、盐、电解质如硫酸盐精蛋白、磷酸氢二钠、磷酸氢钾、氯化钠、锌盐、硅酸镁、饱和脂肪酸部分甘油酯混合物等。
其他常用的药物辅料如粘合剂(如微晶纤维素)、填充剂(如淀粉、葡萄糖、无水乳糖和乳糖珠粒)、崩解剂(如交联PVP、交联羧甲基淀粉钠、交联羧甲基纤维素钠、低取代羟丙基纤维素)、润滑剂(如硬脂酸镁)以及吸收促进剂、吸附载体、香味剂、甜味剂、赋形剂、稀释剂、润湿剂等。
本发明的丹皮酚或牡丹皮提取物以及其药物组合物可按本领域常规方法制备并可以通过肠道或非肠道或局部途径给药。口服(肠道)制剂包括片剂、颗粒剂、悬浮液、胶囊、溶液等,非肠道给药制剂包括注射液等。局部给药制剂包括霜剂、贴剂、软膏剂、喷雾剂等。
本发明的丹皮酚或牡丹皮提取物及其药物组合物的给药途径可以为口服、舌下、经皮、经肌肉或皮下、皮肤粘膜、静脉、尿道、阴道等。
本发明的丹酚酸或牡丹皮提取物及其药物组合物的用量可根据给药途径、患者的年龄和体重、病症严重程度的不同而不同,其日剂量可以是0.001~100mg/kg,可以一次或多次给药。
以下结合具体实施例对本发明作进一步说明,但并不意味着本发明仅限于此。
实施例1:丹皮提取物ODS柱流份的制备
称取500g丹皮粗粉,加水煎煮2次,从沸腾计时,每次1小时,第一次10倍量水,第二次加8倍量水,煎煮完毕后,合并两次煎煮液,放冷3000rpm离心10分钟,去上清液,浓缩后得丹皮提取物,过Flash柱(填料为ODS,2kg),分别用水,30%乙醇,60%乙醇和95%乙醇洗脱约3个柱体积,收集洗脱液,依次得到mdp-0,mdp-30,mdp-60,mdp-95样品,浓缩至干,备用。
实施例2:丹皮提取物D101大孔树脂柱流份的制备
称取500g丹皮粗粉,加水煎煮2次,从沸腾计时,每次1小时,第一次10倍量水,第二次加8倍量水,煎煮完毕后,合并两次煎煮液,放冷3000rpm离心10分钟,去上清液,浓缩后得丹皮提取物,上D101大孔树脂柱,分别用水,30%乙醇,60%乙醇和95%乙醇洗脱约3个柱体积,收集洗脱液,依次得到mdp-D-0,mdp-D-30,mdp-D-60,mdp-D-95样品,浓缩至干,备用。
实施例3:丹皮提取物及不同流份中丹皮酚的含量测定
分别取丹皮提取物及不同流份(按实施例1和2制备)的样品粉末适量,约0.5g,置具塞锥形瓶中,加甲醇20ml,精密称定重量,超声提取30分钟,冷却,补足损失的重量,滤过取续滤液,进高效液相色谱仪分析。选择C18反相色谱柱,流动相为甲醇∶水(60∶40),检测波长为274nm。分别测定各样品中的含量,结果如下:
表1丹皮提取物及不同流份中丹皮酚的含量测定
实施例4:丹皮提取物过ODS反相柱后不同流份对大鼠肝星状细胞增殖的影响
大鼠肝星状细胞(T6细胞),以3000个/孔种于96孔板,长至亚单层后,以0.1μmol/l ANG-II诱导其增殖,取丹皮提取物ODS柱流份样品进行实验,实验组分为正常组、模型组、mdp提取物、mdp-95、mdp-60、mdp-30和mdp-0等7个大组,另外,各给药组再分别以高低二个浓度(2.5、5μg/ml)进行给药,每个组5个复孔进行实验,与HL-7702细胞孵育24h,孵育结束后,再以MTT法检测细胞增殖情况,测定各给药值的OD值,再分别与模型组比较,并计算它们的抑制率,抑制率=(1-ODsample/ODamg)×100%(ODsample:为样品的OD值;ODang:为ANG-II刺激对照组OD值)。
实验结果表明,以ANG-II作用后,肝细胞增殖作用明显,与正常组比较有非常显著差异(P<0.01)。而给予丹皮提取物及经ODS柱后的流份,mdp-D-60的2.5μg/ml能非常显著抑制星状细胞的增殖作用(P<0.01)。而mdp-30、mdp-60和mdp-95高低两个剂量组均能非常显著抑制星状细胞的增殖作用(P<0.01),抑制率均超过40%,实验结果见表2。表明这些部分具有潜在的抗纤维化作用。
表2丹皮提取物ODS反相柱后不同流份对大鼠肝星状细胞增殖的影响
注:##与空白组比较有非常显著差异,P<0.01;*与模型组比较有常显著差异,P<0.05;**与模型组比较有常显著差异,P<0.01。
实施例5:丹皮提取物过D101大孔树脂柱后不同流份对大鼠肝星状细胞增殖的影响
大鼠肝星状细胞(T6细胞),以3000个/孔种于96孔板,长至亚单层后,以0.1μmol/l ANG-II诱导其增殖,取丹皮提取物过D101大孔树脂柱后流份样品进行实验,实验组分为正常组、模型组、mdp提取物、mdp-95、mdp-60、mdp-30和mdp-0等7个大组,另外,各给药组再分别以高低二个浓度(2.5、5μg/ml)进行给药,每个组5个复孔进行实验,与HL-7702细胞孵育24h,孵育结束后,再以MTT法检测细胞增殖情况,测定各给药值的OD值,再分别与模型组比较并计算它们的抑制率,抑制率=(1-ODsample/ODang)×100%(ODsample:为样品的OD值;ODang:为ANG-II刺激对照组OD值)。
实验结果表明,以ANG-II作用后,肝细胞增殖作用明显,与正常组比较有非常显著差异(P<0.01)。而mdp-30、mdp-60和mdp-95高低二个剂量组均能非常显著抑制星状细胞的增殖作用(P<0.01),抑制率均超过20%,实验结果见表3。以上数据表明,丹皮提取物过ODS柱后以mdp-30、mdp-60和mdp-95有明显的抑制星状细胞增殖的作用,表明这些部分具有潜在的抗纤维化作用。
表3丹皮提取物过D101大孔树脂柱后不同流份对大鼠肝星状细胞增殖的影响
注:##与空白组比较有非常显著差异,P<0.01;*与模型组比较有常显著差异,P<0.05;**与模型组比较有常显著差异,P<0.01
实施例6:丹皮提取物过ODS反相柱后不同流份对肝细胞损伤的影响
正常人肝细胞(HL-7702细胞),以3000个/孔种于96孔板,长至亚单层后,取丹皮提取物ODS柱流份样品进行实验,实验组分为正常组、模型组、mdp提取物、mdp-95、mdp-60、mdp-30和mdp-0等7个大组,另外,各给药组再分别以高中低三个浓度(2.5、10、50μg/ml)进行给药,每个组5个复孔进行实验,与HL-7702细胞孵育24h,孵育结束后,再以3.2mmol/l H2O2作用1.5h诱导细胞损伤,CCK-8方法测定各给药值的OD值,再分别与模型组比较,并计算其活力增加率,活力增加率=(1-OD样品/OD模型)×100%(OD样品:样品组OD值,OD模型:模型组OD值)。
实验结果表明,以3.2mmol/l H2O2作用后,肝细胞损伤明显,与正常组比较有显著差异(P<0.01),约有65.16%的细胞损伤,表明损伤模型适合实验研究。而给予丹皮提取物及过ODS柱的流份后,mdp-60的2.5μg/ml,mdp-0的50μg/ml和10μg/ml均能显著拮抗H2O2对肝细胞的损伤作用(P<0.05)。而mdp-30高中低三个剂量组均能非常显著拮抗H2O2对肝细胞的损伤作用(P<0.01),与模型组比较能提高活力分别为11.76%,13.72%和15.69%,实验结果见表4。以上数据表明,丹皮提取物过ODS柱后以30%乙醇洗脱出的流份拮抗H2O2对肝细胞的损伤效果最好,表明该部分是其主要的保肝活性部分。
表4丹皮提取物过ODS柱后不同流份对肝细胞损伤的影响
注:##与空白组比较有非常显著差异,P<0.01;*与模型组比较有常显著差异,P<0.05;**与模型组比较有常显著差异,P<0.01
实施例7:丹皮提取物过D101大孔树脂柱后不同流份对肝细胞损伤的影响
正常人肝细胞(HL-7702细胞),以3000个/孔种于96孔板,长至亚单层后,取丹皮提取物D101大孔树脂柱流份样品进行实验,实验组分为正常组、模型组、mdp-D-0,mdp-D-30,mdp-D-60和mdp-D-95等6个大组,其中,各给药组再分别以高中低三个浓度(2.5、10、50μg/ml)进行给药,每个组5个复孔进行实验,与HL-7702细胞孵育24h,孵育结束后,再以3.2mmol/l H2O2作用1.5h诱导细胞损伤,CCK-8方法测定各给药值的OD值,再分别与模型组比较,并计算其活力增加率,活力增加率=(1-OD样品/OD模型)×100%(OD样品:样品组OD值,OD模型:模型组OD值)。
实验结果表明,以3.2mmol/l H2O2作用后,肝细胞损伤明显,与正常组比较有显著差异(P<0.01),约有63.89%的细胞损伤,表明损失模型适合实验研究。而给予丹皮提取物及D101大孔树脂柱流份后,mdp-D-60的2.5μg/ml能非常显著拮抗H2O2对肝细胞的损伤作用(P<0.01)。mdp-D-30高中低三个剂量组均能非常显著拮抗H2O2对肝细胞的损伤作用(P<0.01),与模型组比较能提高活力分别为4.00%,6.00%和14%,实验结果见表5。以上数据表明,丹皮提取物过D101大孔树脂柱后以30%乙醇洗脱出的流份拮抗H2O2对肝细胞的损伤效果较好,表明该部分是其主要的保肝活性部分。
表5丹皮提取物过D101大孔树脂柱后不同流份对肝细胞损伤的影响
注:##与空白组比较有非常显著差异,P<0.01;*与模型组比较有常显著差异,P<0.05;**与模型组比较有常显著差异,P<0.01
实施例8:丹皮提取物ODS柱流份mdp-60及其活性成分丹皮酚体内实验研究
运用DMN诱导的大鼠肝纤维化模型,以不同剂量的丹皮提取物ODS柱流份mdp-60(按实施例1制备)及其活性成分丹皮酚用于治疗肝纤维化及肝硬化疾病。
材料和方法:
动物:wistar雄性大鼠,清洁级,体重(160±10)g。
分组与给药:102只大鼠随机分正常组(6只)及造模组(96只)。造模组每周连续3天腹腔注射0.5%DMN 2ml/kg,4周后造模组大鼠死亡2只,造模组余94只大鼠随机按分为8组:模型组、N-乙酰半胱氨酸对照组(NAC)、mdp-60低剂量组(MDP-60-L)、mdp-60中剂量组(MDP-60-M)、mdp-60高剂量组(MDP-60-H)、丹皮酚低剂量组(DPF-L)、丹皮酚中剂量组(DPF-M)与丹皮酚高剂量组(DPF-H),每组11-12只。分别按10ml·Kg-1体重灌胃,每周6次,共2周;正常组前4周腹腔注射生理盐水,后2周用饮用水灌胃。治疗2周后,剩余81只大鼠以2%戊巴比妥钠按2ml/kg剂量腹腔注射麻醉,下腔静脉采血,离心分离血清,取肝组织备检。
表6大鼠分组及给药情况一览表
药效指标:大鼠死亡率、血清肝功能与肝组织羟脯氨酸(Hyp)含量(Jamall氏法);
数据均采用SPSS 12.0软件包进行统计分析。计量资料以x±s表示,采用单因素方差分析;等级资料采用Ridit分析。P<0.05为差异具有统计学意义。
结果显示:6周末模型组大鼠死亡4只(死亡率36.4%),大鼠体重明显减轻,腹水形成;血清ALT活性(665.3±73.7IU/L)与肝组织Hyp含量(248.6±41.9μg/g肝组织),较正常组血清ALT活性(45.0±3.9IU/L)与肝组织Hyp含量(89.7±13.2μg/g肝组织)显著升高(均P<0.01);模型组血清Alb含量(30.3±2.3g/L)较正常组Alb含量(35.9±1.4g/L)明显降低(P<0.01);病理观察肝组织纤维化程度重,提示模型成功。mdp-60与丹皮酚的低、中、高剂量组的肝组织Hyp含量与血清ALT均显著低于模型组,而Alb含量显著高于模型组,作用类似于阳性对照药N-乙酰半胱氨酸,且各治疗组见疗效无统计学差异(见表7)。
结果证实:低、中、高剂量组mdp-60与丹皮酚对DMN诱导的大鼠肝纤维化、肝损伤具有显著的治疗作用。
注:与模型组比较,*p<0.05,**p<0.01;与扶正化瘀胶囊比较,#p<0.05,##p<0.01
N:正常组;M:模型组;MDP-60-L:mdp-60低剂量组;MDP-60-L:mdp-60中剂量组;MDP-60-L:mdp-60高剂量组;DPF-L:丹皮酚低剂量组;DPF-M:丹皮酚中剂量组;DPF-H:丹皮酚高剂量组;NAC:N-乙酰半胱氨酸对照组。
本发明所涉及的多个方面已做如上阐述。然而,应理解的是,在不偏离本发明精神之前提下,本领域专业人员可对其进行等同改变和修饰,所述改变和修饰同样落入本申请所附权利要求的覆盖范围。
Claims (9)
1.丹皮酚用于制备预防或者治疗肝纤维化的药物。
2.一种牡丹皮提取物,其特征在于,它包含至少10%重量比的丹皮酚,且所述丹皮酚的含量小于100%。
3.权利要求2的牡丹皮提取物,其中所述丹皮酚的含量至少为50%。
4.权利要求2的牡丹皮提取物,其中所述丹皮酚的含量至少为70%。
5.权利要求2~4的任一牡丹皮提取物,其特征在于,它可由如下方法制得:牡丹皮粗粉加水煎煮,煎煮液冷却离心,去上清液,浓缩后通过ODS柱或大孔吸附树脂柱,再分别用水,30%乙醇,60%乙醇和95%乙醇进行梯度洗脱,收集洗脱液,浓缩干燥。
6.牡丹皮提取物用于制备预防或者治疗肝纤维化的药物,所述提取物包含至少10%重量比的丹皮酚,且所述丹皮酚的含量小于100%。
7.权利要求6的用途,其中所述丹皮酚的含量至少为50%。
8.权利要求6的用途,其中所述丹皮酚的含量至少为70%。
9.权利要求6~8的任一用途,其特征在于,所述牡丹皮提取物可由如下方法制得:牡丹皮粗粉加水煎煮,煎煮液冷却离心,去上清液,浓缩后通过ODS柱或大孔吸附树脂柱,再分别用水,30%乙醇,60%乙醇和95%乙醇进行梯度洗脱,收集洗脱液,浓缩干燥。
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