CN102391352A

CN102391352A - 救必应酸氨基酸衍生物及其在制备抗肿瘤的药物中的应用

Info

Publication number: CN102391352A
Application number: CN 201110351365
Authority: CN
Inventors: 赫玉芳; 南敏伦; 赵全成; 赵昱玮; 岳发贵
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2011-11-09
Filing date: 2011-11-09
Publication date: 2012-03-28
Anticipated expiration: 2031-11-09
Also published as: CN102391352B

Abstract

本发明公开了从中药救必应(Ilicis routundae cortex)中提取分离纯化得到救必应酸作为先导化合物，经相应的化学反应制备了一系列氨基酸衍生物，经药理实验证明，救必应酸的氨基酸衍生物具有体外抗肿瘤活性，对Hela，A375，HepG2，NCI-H446，SPC-A1均具有较强抑制作用，其救必应酸的氨基酸衍生物IV、IX对上述的肿瘤细胞的抑制作用优于母核化合物救必应酸。

Description

救必应酸氨基酸衍生物及其在制备抗肿瘤的药物中的应用

技术领域

本发明涉及一种从天然中药中获得的救必应酸的氨基酸衍生物制备方法，确切的说是一种以中药提取化学成分为先导化合物，制备一系列衍生物，以抗肿瘤活性为指标进行结构修饰，属于医药领域。

背景技术

救必应酸是从中药救必应(Ilicis rotundae cortex)中经提取、纯化、分离、碱降解而获得的一种五环三萜类化合物。我们的研究已经证明了救必应酸具有预防和治疗心脑血管疾病的药理活性(专利公开号：CN101856357A)，同时具有降血脂等药理作用(专利公开号：CN101849950A)。据文献报道一些五环三萜类化合物，如熊果酸、齐墩果酸等也具有较强的抗肿瘤活性(中国民族民间医药，2009年，12期，14-15)，同时文献报道，救必应酸有一定的抗肿瘤的生物活性，我们利用药物化学的原理，参考五环三萜化合物结构改造的经验，对救必应酸的28-COOH进行修饰。有研究表明，氨基酸是生命活动中最基本的物质，是生命代谢的物质基础，肿瘤细胞对氨基酸的需求远大于正常组织。将氨基酸引入抗肿瘤药物分子中，可以提高其对肿瘤细胞的选择性，缓解药物对正常细胞的毒性等。越来越多的药学工作者相继用氨基酸对各抗肿瘤药物进行结构修饰，并对其活性进行研究。部分抗肿瘤药物经氨基酸修饰后增加了对肿瘤细胞的靶向性，抗肿瘤活性有了明显提高，且其对机体正常细胞的毒害作用也有所降低。因此，本发明的目的在于对救必应酸化合物进行结构改造，制备一系列氨基酸衍生物，以期寻找对肿瘤细胞株生长有更强的抑制作用的新的五环三萜类衍生物。根据我国常见肿瘤发病疾病，选择了Hela，A375，HepG2，NCI-H446，SPC-A1等五种肿瘤细胞进行体外活性筛选，从而进行药效学评价。

在本发明完成之前，还没有文献报道救必应酸及救必应酸的氨基酸衍生物具有抑制肿瘤细胞生长的作用，也未发现救必应酸及救必应酸的氨基酸衍生物在制备抗肿瘤药物应用的报道。

发明内容

本发明在于提供一种以救必应酸为先导化合物合成一系列具有抗肿瘤作用的救必应酸的氨基酸衍生物。

本发明的目的是通过以下技术方案得以实现：

一种具有抗肿瘤活性的救必应酸的氨基酸衍生物(具体的取代基结构见表1)，其结构式如下：

其中：R₁为羟基或乙酰基；

R₂为取代氨基酸甲酯羟基或氨基酸或羟基；

如上所述的一种具有抗肿瘤活性的救必应酸衍生物由以下方法得到：

1、乙醇提取中药救必应(Ilicis routundae cortex)，经纯化、分离、碱降解而获得的化合物I(3β，19α，23-三羟基-乌苏烷型-12-烯-28-羧酸)，即救必应酸。

2、化合物I与乙酸酐反应得3β，23-二乙酰基-19α-羟基-乌苏烷型-12-烯-28-羧酸化合物II。

其中R₁为乙酰基

3、化合物II与草酰氯在室温下反应，进一步在PH为8-9的碱性条件下与氨基酸甲酯反应得N-(3β，23-二乙酰基-19α-羟基-乌苏烷型-12-烯-28-酰胺)-氨基酸甲酯类化合物III-VI。

其中R₁为乙酰基，R₂为取代氨基酸甲酯

4、化合物III-VI在碱溶液中水解得N-(3β，19α，23-三羟基-乌苏烷型-12烯-28-酰胺)-氨基酸类化合物VII-X。

R₂为取代氨基酸

表1具体各化合物结构

以上所述的一种具有抗肿瘤活性的救必应酸衍生物，可用于制备治疗肿瘤疾病的药物。

本发明的特点为首次进行救必应酸新的氨基酸衍生物的合成、鉴定及其细胞毒作用。对所合成的化合物结构采用IR、NMR和MS测试技术进行了表征。采用氮唑盐还原法(MTT法)进行了Hela，A375，HepG2，NCI-H446，SPC-A1等五种肿瘤细胞的体外活性筛选实验。结果表明，合成的绝大多数新化合物对肿瘤细胞抑制作用，特别是化合物5和10对于上述五种细胞的抑制作用明显优于救必应酸，具有明显的技术进步。

救必应酸及氨基酸衍生物对肿瘤细胞的抑制作用，这些药理作用，通过以下药效学试验例得到证实。

细胞Hela，A375，HepG2，NCI-H446，SPC-A1等5种细胞系均购自吉林省肿瘤医院。

药品及试剂救必应酸及各衍生物为本实验室自制；四甲基偶氮唑盐(MTT)为Sigma公司产品；青霉素G钾盐为Sigma公司产品；硫酸链霉素Sigma公司产品；HEPES为Sigma公司产品；DMSO为Sigma公司产品；胰酶为Difco公司；新生牛血清(FBS)为北京元亨圣马生物技术研究所产品；RPMI-1640培养基为Hyclone公司产品。

仪器CK2TRC-3荧光倒置显微镜，日本OLYMPUS产品；D-63450-CO₂培养箱，德国Hera公司产品；FCANF129004酶标仪，澳大利亚TECAN公司产品。

实验方法MTT法6种人的肿瘤细胞株按常规方法培养传代，取对数生长期细胞用于实验。将细胞以1×10⁵个/mL浓度接种于96孔板(100μL/孔)，培养12h后，实验组加入救必应酸各衍生物(或5-氟尿嘧啶作为阳性对照组)，实验样品分别按照5μM，10μM，20μM，40μM进行实验，对照组为20μM。阴性对照组加入培养液，每组各设4个平行孔，并分别设空白孔(即只加入药液和培养液，不加细胞)以调零。将救必应各衍生物组培养44h，加入5mg/mLMTT20μL，继续培养4h，弃上清，每孔加入DMSO150μL，混匀，酶标仪(λ＝492nm)测定吸光度(A₄₉₂)，利用SPSS统计软件，计算细胞死亡率，求取IC₅₀。

实验结果

结果表明，经SPSS软件统计，救必应酸及衍生物对Hela，A375， HepG2，NCI-H446，SPC-A1等5种肿瘤细胞均有不同程度的抑制作用，救必应酸及氨基酸衍生物、5-FU对5种肿瘤细胞的IC₅₀值详见表2。从表2中可以看出，化合物I、IV、IX、X对肿瘤细胞的生长抑制作用较强。氨基酸衍生物对肿瘤细胞的抑制作用化合物IV、IX大于救必应酸。各化合物的IC₅₀均小于阳性对照药5-FU，说明各衍生物均具有很强的抑制肿瘤细胞的作用。

表3救必应酸各衍生物及5-FU对5种肿瘤细胞的IC₅₀(μM)

为了支持本发明，举例说明本发明中化合物的制备过程，但并不意味这本发明就限于此，具体实施方法如下。

具体实施方式

实施例1：化合物I的制备

药材用70％的乙醇回流提取3次，每次2小时，合并提取液，加提取液体积2％药用活性碳，过滤，滤液浓缩至每1ml含1g药材；加1mol/l的氢氧化钠溶液2倍量，100℃水解4小时，放冷，用盐酸调PH值为3，滤过，弃去水解液，滤饼用去离子水洗至中性，再用85％的乙醇加热至沸，加入药液体积的1％的药用活性炭，趁热滤过，滤液减压浓缩回收至无醇味、加水至每1ml含1g药材，放置，过滤，水洗，干燥，再重结晶2次，得化合物I。收率为3.2％，含量为96.4％。白色粉末，熔点：272.0-273.5℃；红外(KBr)cm^-1：3570，3417，2933，2878，1689，1460，1388，1046 and 933；核磁¹H NMR(400MHz，C₅D₅N)δ：5.50(1H，m，H-12)，4.84(1H，m，H-3)，4.07(1H，m，H-23a)，3.60(1H，d，J＝10.3Hz，H-23b)，2.97(1H，br s，H-18)，1.57(3H，s，CH₃-25)，1.32(3H，s，CH₃-27)，1.02(3H，s，CH₃-29)，1.00(3H，d，J＝6.64Hz，CH₃-30)，0.95(3H，s，CH₃-26)，0.88(3H，s，CH₃-24)；¹³C NMR(100MHz，C₅D₅N)δ：180.8(C-28)，140.1(C-13)，128.2(C-12)，73.7(C-3)，72.8(C-19)，68.2(C-23)，54.8(C-18)，48.8(C-5)，48.4(C-9)，47.9(C-17)，43.0(C-20)，42.5(C-14)，42.3(C-8)，40.5(C-1)，39.0(C-4)，38.6(C-22)，37.3(C-10)，33.4(C-7)，29.5(C-15)，27.8(C-21)，27.2(C-29)，27.0(C-2)，26.5(C-16)，24.8(C-27)，24.2(C-11)，18.9(C-6)，17.4(C-25)，16.9(C-26)，16.1(C-30)，13.2(C-24).ESI-MS m/z：487.4[M-H]^-.

实施例2：化合物II的制备

化合物I取5g，加吡啶200ml，醋酸酐100ml，80℃下搅拌，以 TLC检测反应终点，反应完毕，回收反应溶剂，加水至250ml，用稀盐酸调PH为5，滤过，滤饼用水洗至无色，用乙酸乙酯250ml溶解，用水洗涤2次，每次100ml，再用10％碳酸钠洗涤3次，每次100ml，再用1mol/l的盐酸100ml洗涤1次，最后用水洗涤2次，每次100ml，回收乙酸乙酯也至干，加乙醇300ml加热溶解，加1g活性炭，搅拌均匀，滤过，滤液回收乙醇至50ml，放置，析晶，过滤，得化合物II。产率为：83.6％。白色粉末，熔点156.5-158.5℃；红外(KBr)cm^-1：3597，3443，2955，2873，1727，1704，1472，1370，1036and 924；核磁¹H NMR(400MHz，C₅D₅N)δ：5.47(1H，m，H-12)，4.97(1H，m，H-3)，4.89(1H，m，H-23a)，3.89(1H，brs，H-23b)，2.93(1H，br s，H-18)，1.91(3H，s，CH3-1′)，1.86(3H，s，CH3-1″)，1.63(3H，s，CH₃-25)，1.32(3H，s，CH₃-27)，0.97(3H，s，CH₃-29)，1.00(3H，d，J＝6.64Hz，CH₃-30)，0.76(3H，s，CH₃-26)，0.71(3H，s，CH₃-24)；¹³C NMR(100MHz，C₅D₅N)δ：180.8(C-28)，140.1(C-13)，127.9(C-12)，74.8(C-3)，72.8(C-19)，66.8(C-23)，54.7(C-18)，48.5(C-5)，48.4(C-9)，47.9(C-17)，42.5(C-20)，42.2(C-14)，41.0(C-8)，40.4(C-1)，38.6(C-4)，38.0(C-22)，37.0(C-10)，33.2(C-7)，29.4(C-15)，27.2(C-21)，27.0(C-29)，26.5(C-2)，24.6(C-16)，24.0(C-27)，23.5(C-11)，18.5(C-6)，17.3(C-25)，16.9(C-26)，16.0(C-30)，13.3(C-24)，170.7(C-1′)，21.2(C-2′)，170.6(C-1″)，20.8(C-2″)。ESI-MS m/z：573.1[M+H]+.HR-ESI-MS实验值573.3804，计算值573.3791，C34H53O7([M+H]+)。

实施例3：化合物III的制备

取化合物II 1.5g溶解于25二氯甲烷中，置冰水浴中边搅拌边缓缓加入2ml草酰氯，在冰水浴中搅拌反应1小时，置室温中反应24小时，停止反应，减压浓缩(30℃)，分三次加入二氯甲烷各50ml，减压浓缩得浅黄色固体，用90ml二氯甲烷溶解，作为备用液。将甘氨酸甲酯盐酸盐1.5g分散于60ml二氯甲烷中，并加入三乙胺6ml，冰水浴中缓缓加入上述备用液，完毕后，继续冰水浴中反应30分钟，然后置室温反应12小时。反应完毕后依次用2.5％盐酸溶液、水、饱和氯化钠溶液洗脱3次，每次50ml，二氯甲烷液加入足量的无水硫酸钠脱水，过滤，滤液浓缩，干燥。得浅黄色固体。用95％乙醇400ml加热溶解，加入活性炭0.5g，搅拌，过滤，滤液回收乙醇，放置析晶，过滤，干燥，得白色固体，利用硅胶柱层析分离，以石油醚(30-60℃)-乙酸乙酯(5∶2)为展开剂洗脱，合并相同组分，回收溶剂，干燥的化合物III。产率为：56.94％，白色晶体。熔点198～200℃；红外(KBr)cm^-1：3411，2972，2925，2882，1741，1727，1651，1520，1474，1444，1386，1370，1250，1049，1028and 1004；核磁¹H NMR(400MHz，C₅D₅N)δ：8.07(1H，brs，-NH)，5.44(1H，m，H-12)，4.93(1H，m，H-3)，4.25(1H，m，H-2″′a)，4.10(1H，m，H-2″′b)，3.93(1H，d，J＝11.6Hz，H-23a)，3.87(1H，d，J＝11.6Hz，H-23b)，3.51(3H，s，1″′-OCH₃)，2.82(1H，br s，H-18)，1.91(3H，s，CH₃-2′)，1.86(3H，s，CH₃-2″)，1.60(3H，s，CH₃-25)，1.27(3H，s，CH₃-27)，0.87(3H，s，CH₃-29)，0.95(3H，d，J＝6.64Hz，CH₃-30)，0.82(3H，s，CH₃-26)，0.74(3H，s，CH₃-24)；¹³C NMR(100MHz，C₅D₅N)δ： 178.7(C-28)，140.0(C-13)，128.1(C-12)，74.8(C-3)，73.1(C-19)，65.7(C-23)，54.4(C-18)，48.5(C-5)，48.1(C-9)，47.9(C-17)，42.3(C-20)，42.1(C-14)，41.0(C-8)，40.4(C-1)，38.9(C-4)，38.0(C-22)，37.1(C-10)，33.2(C-7)，28.9(C-15)，27.2(C-21)，27.1(C-29)，26.2(C-2)，24.6(C-16)，24.0(C-27)，23.5(C-11)，18.5(C-6)，17.1(C-25)，16.9(C-26)，16.0(C-30)，13.3(C-24)，170.7(C-1′)，21.2(C-2′)，170.5(C-1″)，20.8(C-2″)，171.6(C-1″′)，51.8(1″′-OCH₃)，42.0(C-2″′).ESI-MS m/z：644.4[M+H]⁺.HR-ESI-MS实验值644.4122，计算值644.4157，C₃₇H₅₈NO₈([M+H]⁺)。

实施例4：化合物V的制备

取化合物II 1.5g溶解于25二氯甲烷中，置冰水浴中边搅拌边缓缓加入2ml草酰氯，在冰水浴中搅拌反应1小时，置室温中反应24小时，停止反应，减压浓缩(30℃)，分三次加入二氯甲烷各50ml，减压浓缩得浅黄色固体，用90ml二氯甲烷溶解，作为备用液。将色氨酸甲酯盐酸盐2g分散于60ml二氯甲烷中，并加入三乙胺6ml，冰水浴中缓缓加入上述备用液，完毕后，继续冰水浴中反应30分钟，然后置室温反应12小时。反应完毕后依次用2.5％盐酸溶液、水、饱和氯化钠溶液洗脱3次，每次50ml，二氯甲烷液加入足量的无水硫酸钠脱水，过滤，滤液浓缩，干燥。得浅黄色固体。用95％乙醇400ml加热溶解，加入活性炭0.5g，搅拌，过滤，滤液回收乙醇，放置析晶，过滤，干燥，得白色固体，利用硅胶柱层析分离，以石油醚(30-60℃)-乙酸乙酯(5∶2)为展开剂洗脱，合并相同组分，回收溶剂，干燥的化合物V。产率为52.46％，白色晶体。熔点243～245℃；红外(KBr)cm^-1：3410， 3372，2966，2952，2878，1730，1651，1519，1460，1444，1368，1250，1019and 742；核磁¹H NMR(400MHz，C₅D₅N)δ：11.9(1H，s，indo1e-NH)，7.98(1H，brs，amide-NH)，7.48(1H，brs，H-7″″)，7.46(1H，s，H-2″″)，7.35(1H，m，H-4″″)，7.16(2H，m，H-5″″and H-6″″)，5.33(1H，m，H-12)，5.11(1H，m，H-2″′)，4.91(1H，m，H-3)，3.90(2H，m，H-23)，3.64(3H，s，1″′-OCH₃)，3.35(2H，m，H-3″′)，2.77(1H，br s，H-18)，1.96(3H，s，CH₃-2′)，1.85(3H，s，CH₃-2″)，1.50(3H，s，CH₃-25)，1.20(3H，s，CH₃-27)，0.91(3H，d，J＝6.64Hz，CH₃-30)，0.75(3H，s，CH₃-29)，0.70(3H，s，CH₃-26)，0.29(3H，s，CH₃-24)；¹³C NMR(100MHz，C₅D₅N)δ：178.2(C-28)，139.7(C-13)，137.9(C-9″″)，128.5(C-8″″)，128.1(C-12)，124.5(C-2″″)，122.3(C-5″″)，119.6(C-6″″)，119.1(C-4″″)，112.4(C-7″″)，110.9(C-1″″)，74.8(C-3)，73.0(C-19)，65.8(C-23)，54.1(C-18)，48.4(C-5)，47.9(C-9)，47.8(C-17)，42.3(C-20)，41.9(C-14)，41.0(C-8)，40.1(C-1)，38.6(C-4)，38.0(C-22)，37.0(C-10)，32.8(C-7)，28.6(C-15)，27.2(C-21)，27.1(C-29)，26.2(C-2)，24.5(C-16)，23.9(C-27)，23.5(C-11)，18.6(C-6)，16.8(C-25)，16.2(C-26)，15.9(C-30)，13.4(C-24)，170.7(C-1′)，21.2(C-2′)，170.6(C-1″)，20.8(C-2″)，174.0(C-1″′)，28.2(C-3″′)，54.7(C-2″′)，52.1(1″′-OCH₃).ESI-MS m/z：773.5[M+H]⁺.HR-ESI-MS实验值773.4715，计算值773.4735，C₄₆H₆₅N₂O₈([M+H]⁺)。

实施例5：化合物VII的制备

将化合物III 0.5g置于4％氢氧化钠含60％甲醇的碱性溶液30ml中，回流水解6-8小时，放冷，加入水50ml，用稀盐酸调PH值为5，过滤，滤饼用水洗至中性，干燥，得化合物VII。产率为83.33％，白色粉末。熔点224～226℃；红外(KBr)cm^-1：3451，3369，2932，2876，1634，1611，1525，1460，1367，1046 and 932；核磁¹H NMR(400MHz，C₅D₅N)δ：7.74(1H，brs，-NH)，5.53(1H，brs，H-12)，5.01(1H，m，H-3)，4.43(1H，m，H-1″′a)，4.28(1H，m，H-1″′b)，4.07(2H，m，H-23)，3.77(2H，m，H-2″′)，2.80(1H，br s，H-18)，1.55(3H，s，CH₃-25)，1.28(3H，s，CH₃-27)，0.97(3H，s，CH₃-29)，0.96(3H，d，J＝6.64Hz，CH₃-30)，0.97(3H，s，CH₃-26)，0.91(3H，s，CH₃-24)；¹³C NMR(100MHz，C₅D₅N)δ：178.6(C-28)，140.1(C-13)，128.6(C-12)，73.7(C-3)，73.1(C-19)，68.2(C-23)，54.8(C-18)，48.8(C-5)，48.1(C-9)，48.0(C-17)，43.0(C-20)，42.6(C-14)，42.4(C-8)，40.6(C-1)，39.0(C-4)，39.0(C-22)，37.3(C-10)，33.3(C-7)，29.0(C-15)，27.8(C-21)，27.3(C-29)，27.2(C-2)，26.4(C-16)，24.8(C-27)，24.2(C-11)，18.9(C-6)，17.1(C-25)，16.9(C-26)，16.2(C-30)，13.2(C-24)，173.5(C-1″′)，42.3(C-2″′)。ESI-MS m/z：546.3[M+H]⁺。HR-ESI-MS实验值546.3711。计算值：546.3795，C₃₂H₅₂NO₆([M+H]⁺)。

实施例6：化合物IX的制备：

将化合物V 0.5g置于4％氢氧化钠含60％甲醇的碱性溶液30ml中，回流水解6-8小时，放冷，加入水50ml，用稀盐酸调PH值为5，过滤，滤饼用水洗至中性，干燥，得化合物IX。产率为88.17％，白色粉末。熔点257～258℃；红外(KBr)cm^-1：3463，3411，2930，2879，2862，1728，1658，1499，1457，1444，1387，1357，1242，1042and 743；核磁¹H NMR(400MHz，C₅D₅N)δ：11.9(1H，s，indole-NH)，7.98(1H，brs，amide-NH)，7.48(1H，brs，H-7″″)，7.46(1H，s，H-2″″)，7.35(1H，m，H-4″″)，7.16(2H，m，H-5″″and H-6″″)，5.33(1H，m，H-12)，5.11(1H，m，H-2″′)，4.91(1H，m，H-3)，3.90(2H，m，H-23)，3.64(3H，s，1″′-0CH₃)，3.35(2H，m，H-3″′)，2.77(1H，br s，H-18)，1.96(3H，s，CH₃-2′)，1.85(3H，s，CH₃-2″)，1.50(3H，s，CH₃-25)，1.20(3H，s，CH₃-27)，0.91(3H，d，J＝6.64Hz，CH₃-30)，0.75(3H，s，CH₃-29)，0.70(3H，s，CH₃-26)，0.29(3H，s，CH₃-24)；¹³C NMR(100MHz，C₅D₅N)δ：178.2(C-28)，139.7(C-13)，137.8(C-9″″)，129.0(C-8″″)，128.7(C-12)，124.6(C-2″″)，121.9(C-5″″)，119.6(C-6″″)，119.4(C-4″″)，112.3(C-7″″)，111.6(C-1″″)，73.9(C-3)，73.0(C-19)，68.3(C-23)，54.6(C-18)，48.8(C-5)，48.0(C-9)，47.9(C-17)，43.0(C-20)，42.3(C-14)，42.1(C-8)，40.4(C-1)，39.0(C-4)，38.9(C-22)，37.3(C-10)，33.1(C-7)，28.8(C-15)，27.8(C-21)，27.2(C-29)，27.2(C-2)，26.4(C-16)，24.7(C-27)，24.2(C-11)，18.9(C-6)，16.9(C-25)，16.7(C-26)，16.1(C-30)，13.2(C-24)，175.8(C-1″′)，28.1(C-3″′)，55.0(C-2″′)。ESI-MSm/z：675.3[M+H]⁺。HR-ESI-MS实验值：675.4295，计算值：675.4373，C₄₁H₅₉N₂O₆([M+H]⁺)。

Claims

1.一种救必应酸衍生物，其结构特征为：

其中：R₁为羟基或乙酰基，R₂为取代氨基酸甲酯或氨基酸或羟基。

2.根据权利要求1所述的救必应酸氨基衍生物在抑制肿瘤细胞生长及其在制备抗肿瘤的药物中的应用。