CN103845372A - 具有抗肿瘤作用的救必应提取物及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及救必应为冬青科植物铁冬青Ilex roundda Thunb.的干燥树皮或根皮,具体涉及具有抗肿瘤作用的救必应提取物及其应用。本发明在救必应传统功效的研究基础上,制备其活性提取物,和现有技术相比,提出了救必应提取物可以对抗H22荷瘤小鼠的肿瘤增殖,且提高机体免疫力,增强抗氧化作用,表明该活性提取物对肿瘤增长具有明显的抑制作用。
Description
技术领域
本发明涉及药用植物铁冬青树皮(The bark of Ilex rotunda Thumb)——救必应,具体涉及具有抗肿瘤作用的救必应提取物及其应用。
背景技术
肿瘤是是世界范围内多发的疾病之一,大多数患者确诊时已属癌症晚期,目前治疗手段以手术化疗及放疗相结合的综合立体疗法,以期减少肿瘤的多药耐药的发生。目前抗肿瘤药物对正常癌细胞杀伤同时也破坏机体免疫功能,带来严重的副作用。
救必应为冬青科植物铁冬青Ilex roundda Thunb.的干燥树皮或根皮,味苦性寒,具清热解毒、消肿止痛、祛风利湿、跌打损伤等功效,始载于《岭南采药录》,为我国南方地区民间常用草药。常生于低中海拔的温湿肥沃的疏林中、海边溪旁或丘陵地带。又名白木香、羊不吃、观音柴等。救必应作为传统民间药,被广泛用于少数民族地区,其具显著的“清热解毒”作用。
救必应的现代药理学对其药理活性研究鲜有报道。到目前为止,未见以救必应为原料制备活性提取物的制备技术,也未见以救必应为主要组成组分应用抗肿瘤药品或保健品的报道。
发明内容
本发明的一个目的在于提供一种具有抗肿瘤作用的救必应提取物及其应用。
具有抗肿瘤作用的救必应提取物,其制备方法具有以下特征:具有抗肿瘤作用的救必应提取物,其制备方法具有以下特征:将救必应粉碎至细粉,乙醇提取3次,滤过,合并提取液,浓缩提取液至得浸膏;真空干燥,既得具有抗肿瘤作用的救必应提取物。
所述细粉为过80筛,所述乙醇提取为采用乙醇为溶剂超声辅助提取。
所述超声辅助提取为1/20的固液比,40KHz的工作频率,温度为40℃,时间30min。
本发明的又一个目的在于提供一种上述的方法制备得到的具有抗肿瘤作用的救必应提取物在制备抗肿瘤药物或抗肿瘤保健品中的应用。该提取物对H22荷瘤小鼠具有明显的抗肿瘤作用,具有提高机体免疫力的作用。
所述药物或保健品为片剂、注射剂、胶囊剂、颗粒剂、丸剂、薇丸、滴丸剂、汤剂、糖浆剂、合剂、煎膏剂或浸膏剂或其他药学上可接受的载体。
救必应提取物制成胶囊剂时把救必应提取物和载体乳糖或玉米淀粉混合均匀,整粒,然后装胶囊制成胶囊剂。
救必应制成片剂时,把救必应提取物和载体乳糖或玉米淀粉,需要时加入润滑剂硬脂酸镁,混合均匀,然后压片制成片剂。
救必应提取物制成颗粒剂时,把救必应提取物和稀释剂乳糖或玉米淀粉混合均匀,整粒,干燥,制成颗粒剂。
救必应提取物制成其他剂型时,可按药学常规方法制备得到,这里不一一赘述。
本发明的有益效果:本发明在救必应原有化学成分和传统功效的研究基础上,同时制备其活性提取物,和现有技术相比,提出了救必应提取物可以对抗H22荷瘤小鼠的肿瘤增殖,且提高机体免疫力,表明该活性提取物对肿瘤增长具有明显的抑制作用。因此,救必应提取物有望开发成为新一代安全有效,用于抗肿瘤的药物或保健品。
具体实施方式
以下结合具体实施例对发明做出进一步说明,应理解这些实施例仅用于说明本发明而不限制本发明的范围,在阅读本发明后,本领域技术人员对本发明的各种等价形式的修改均落于本发明所附权利要求限定的范围。
实施例1
具有抗肿瘤作用的救必应提取物,其通过以下方法制备得到:
将救必应粉碎至细粉,乙醇提取3次,滤过,合并提取液,浓缩提取液至得浸膏;真空干燥,既得具有抗肿瘤作用的救必应提取物。
实施例2
具有抗肿瘤作用的救必应提取物,其通过以下方法制备得到:
将救必应粉碎至过80目的细粉,20倍量65%乙醇溶剂超声辅助提取提取3次,滤过,合并提取液,浓缩提取液至得浸膏;真空干燥,既得具有抗肿瘤作用的救必应提取物;所述超声辅助提取为40KHz的工作频率,温度为40℃,时间30min。
实施例3
救必应活性提取物抗肿瘤实验研究
1.实验材料与仪器设备
1.1实验材料及试剂
受试药:使用实施例1或实施例2制备的救必应提取物;阳性药:环磷酰胺,购于吉林省肿瘤医院;羧甲基纤维素钠(食品级);生理盐水等。组织固定液,来自北京化工厂;组织匀浆机,江苏省金坛市恒丰仪器制造有限公司;ALT和AST试剂盒,南京建成生物工程有限公司;TNF-α试剂盒,武汉华美生物工程有限公司;白介素12(IL-12)试剂盒,武汉华美生物工程有限公司;肿瘤坏死因子(TNF-α)试剂盒,武汉华美生物工程有限公司;小鼠维持饲料,吉林大学实验动物中心提供。
1.2实验动物
C57小鼠(22-25g),雄性,购于吉林大学实验动物中心,适应性饲养一周后,进行试验。
1.3仪器
镊子;剪刀;注射器;灌胃针等。电子分析天平(SHIMADZU-AUY220型,日本);全波长扫描酶标仪,美国Bio-tek公司。
2实验方法
2.1动物分组
C57小鼠腋下接种H22肿瘤造模成功后共分为6组,灌胃方式为灌胃,如下:对照组:生理盐水(CON)阳性药组:环磷酰胺组(CTX,腹腔注射)。受试药组:救必应低剂量组50mg/Kg(IRE-L),救必应中剂量组100mg/Kg(IRE-M),救必应高剂量组200mg/Kg(IRE-H)
2.2药物的配制
阳性药:环磷酰胺20mg/kg,生理盐水溶解,待腹腔注射;空白给药组(阴性对照组):注射用生理盐水,灌胃给药;受试药:灌胃(口服)给药。
2.3H22腹水瘤鼠的制备
取3只普通ICR小鼠,正常饲养1周,用于实验。于液氮罐中取冻存的H22细胞,37度复苏后,弃去细胞保存液,用生理盐水混悬,注射到3只ICR小鼠腹腔中,三天后每天称重,接种5-7天后,待腹部隆起,接种成功。
2.4肿瘤鼠的制备
取接种5-7天的ICR鼠腹水癌细胞,用生理盐水制成细胞个数为1×106/ml的细胞悬液,以每鼠0.1ml接种于小鼠右腋皮下肿瘤细胞移植以后,次日,肿瘤小鼠被随机分成不同的给药组,每组12只,开始给药试验。
对照组只给生理盐水。给药组救必应用生理盐水配置不同给药浓度,如救必应低剂量组50mg/Kg(IRE-L),救必应中剂量组100mg/Kg(IRE-M),救必应高剂量组200mg/Kg(IRE-H)等,灌胃方式给药,给药剂量为0.2ml/10g。阳性药环磷酰胺,用生理盐水配置,腹腔注射给药。
给药14天(2周)后,小鼠摘眼球取血处死,血清静置2小时,离心,取血清测各种生化指标。待测TNF-α(肿瘤坏死因子)和IL-2(白介素-2)含量。TNF-α和IL-2测定采用ELISA酶联免疫检测法,操作步骤按试剂盒给定说明书程序进行。
小心剥取瘤块、胸腺和脾脏,分别称重,计算数值。
2.5数据统计处理
C57小鼠肿瘤抑制率的计算:抑制率=(对照组平均瘤重-给药组平均瘤重)/对照组平均瘤重×100%。
胸腺指数为每克体重胸腺的毫克数,脾指数为每克体重中脾脏的毫克数,所有的数据均进行均值和方差处理,参数值用均值±标准差(Mean±SD)表示,组间比较采用了T检验,p<0.05为有显著性差异。给药组间差异显著性比较,显著性差异*p<0.05。
3.实验结果
3.1对C57小鼠体重的影响
试验开始后,隔日计算小鼠体重变化,确定给药剂量,从统计结果我们可以看出给药组与空白对照组体重相比无显著性差异(P>0.05)。空白对照组、环磷酰胺给药组组、救必应高剂量组体重呈下降趋势,而其各组增加明显,但各组之间没有显著性差异(P>0.05)。一般来说,小鼠肿瘤模型造模成功后,各组对体重无显著影响。
3.2对C57小鼠H22荷瘤的抑制作用
统计结果见表5-2。从统计结果中我们可以看出,与阴性对照组相比,阳性组(CTX)与其具有显著性差异(p<0.01),给药14天后,显著抑制肿瘤的增值,受试药中救必应IRE-L组,抑制肿瘤增长不明显,高剂量IRE-H和中剂量IRE-M组抑制肿瘤增殖明显,均具有显著性差异(p<0.01),各组抑制率见下表。
各组的抑瘤率统计结果
Tab Statistical results of anti-tumor rate for each group
组别 | 剂量(mg/kg/d) | 瘤重(g) | 抑瘤率(%) |
对照组(CON) | — | 0.66±0.22 | - |
阳性药组(CTX) | 20 | 0.31±0.10* | 53.2 |
救必应低剂量(IRE-L) | 50 | 0.56±0.19 | 15.1 |
救必应中剂量(IRE-M) | 100 | 0.48±0.12 * | 27.3 |
救必应高剂量(IRE-H) | 200 | 0.38±0.17 * | 42.4 |
注:与对照组(阴性)相比,“*”P≤0.05
3.3对小鼠免疫器官指数的影响
胸腺和脾脏是重要的免疫器官,其脏器指数可在一定程度上反映机体免疫功能的强弱。胸腺的主要功能是产生T淋巴细胞和分泌胸腺素,主要参与细胞免疫;脾脏中有丰富的淋巴细胞和巨噬细胞,但B淋巴细胞比例较大,因此与体液免疫关系更为密切。
脾脏是重要的免疫器官,正常肿瘤患者脾脏功能受到影响,给药后可以部分改善脾功能。本部分实验,给药14天后,取脾脏,观察给药后,是否对其有影响。结果表明:给药14天后,阳性药环磷酰胺组肝指数升高,给药组救必应高剂量组可以显著降低肿瘤小鼠的肝指数,与化学药相比,中药救必应对肝脏具有保护作用。
同时,本实验亦观察小鼠胸腺指数,观察给药14天后,给药组是否影响胸腺指数。结果表明:给药14天后,阳性药组胸腺指数下降明显,但经过给药14天治疗后,救必应高剂量组可以显著升高小鼠胸腺指数,提供肿瘤小鼠免疫力,救必应中剂量组合低剂量组对胸腺指数无影响。
3.4对小鼠肝功能的影响
AST(谷草转氨酶)和ALT(谷丙转氨酶)是反映肝功能的重要酶类,肝功能受到损伤,二者升高。我们注意到环磷酰胺对H22荷瘤小鼠肝功能具有显著影响,给药组可以显著降低小鼠肝指数,那么,给药组是否亦对荷瘤小鼠的ALT和AST具有影响值得关注。结果表明:给药14天后,对照组肝脏ALT和AST含量明显升高,CTX组对二者无影响,而救必应给药组可以显著降低肝脏中ALT和AST的影响。但,救必应对血清中二种酶的活性无影响。结果如下。
3.5对小鼠IL-12和TNF-α的影响
白细胞介素12(IL-12)被认为是细胞免疫应答过程中的关键调节因子,具有明显的抗肿瘤活性,已成为肿瘤免疫治疗及综合治疗中的热点。大量动物实验表明,IL-12不仅能抑制肿瘤的生长,而且能抑制肿瘤的转移,延长荷瘤动物的生存时间。
TNF-α(肿瘤坏死因子-α),该物质表达升高,可以有效杀死癌细胞作用。本部分重点探讨H22荷瘤小鼠对IL-12和TNF-α的表达影响。
结果表明:救必应中剂量和高剂量可以有效升高IL-12的含量,具有显著意义。
4.结论
4.1基于前文获得的救必应提取物,本章重点探讨了其体内抗肿瘤作用。H22肿瘤是常见的移植瘤模型,其造模成本低,容易操作。本文利用C57小鼠制备该模型,稳定性好,组间差异小,利于药用筛选。
4.2给药14天后观察发现:各给药组对小鼠体重基本无影响,救必应高中剂量组可以显著抑制肿瘤增长,具有显著的抑瘤率;免疫学指标结果表明:救必应可以显著升高胸腺指数,降低肝指数,对免疫器官具有一定的保护作用。
4.3通过检测肝脏中ALT和AST含量,进一步明确,救必应提取物可以改善荷瘤小鼠的肝功能,与免疫组织指数结果相一致,验证中药抗肿瘤主要通过增强免疫力而发挥作用。
4.4利用酶联免疫试剂盒测试血清中IL-12和TNF的含量,结果亦证明给药一定时间后,救必应提取物可以显著增加IL-12的表达,升高TNF含量,杀伤肿瘤细胞。
实施例8
所述药物或保健品为片剂、注射剂、胶囊剂、颗粒剂、丸剂、薇丸、滴丸剂、汤剂、糖浆剂、合剂、煎膏剂或浸膏剂或其他药学上可接受的载体。
实施例9
救必应提取物制成胶囊剂时把救必应提取物和载体乳糖或玉米淀粉混合均匀,整粒,然后装胶囊制成胶囊剂。
实施例10
救必应制成片剂时,把救必应提取物和载体乳糖或玉米淀粉,需要时加入润滑剂硬脂酸镁,混合均匀,然后压片制成片剂。
实施例11
救必应提取物制成颗粒剂时,把救必应提取物和稀释剂乳糖或玉米淀粉混合均匀,整粒,干燥,制成颗粒剂。
救必应提取物制成其他剂型时,可按药学常规方法制备得到,这里不一一赘述。
Claims (5)
1.具有抗肿瘤作用的救必应提取物,其制备方法具有以下特征:将救必应草粉碎至细粉,乙醇提取3次,滤过,合并提取液,浓缩提取液至得浸膏;真空干燥,既得具有抗肿瘤作用的救必应提取物。
2.如权利要求1所述的具有抗肿瘤作用的铜锤玉带草提取物,其特征在于:所述细粉为过80筛,所述乙醇提取为采用乙醇为溶剂超声辅助提取。
3.如权利要求1所述的具有抗肿瘤作用的铜锤玉带草提取物,其特征在于:所述超声辅助提取为1/20的固液比,40KHz的工作频率,温度为40℃,时间30min。
4.如权利要求1-3中任一项所述的方法制备得到的具有抗肿瘤作用的铜锤玉带草提取物在制备抗肿瘤药物或抗肿瘤保健品中的应用。
5.如权利要求4所述的应用,其特征在于,所述药物或保健品为片剂、注射剂、胶囊剂、颗粒剂、丸剂、薇丸、滴丸剂、汤剂、糖浆剂、合剂、煎膏剂或浸膏剂或其他药学上可接受的载体。
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许睿: "救必应化学成分研究及抗肿瘤活性成分初步筛选", 《中国博士学位论文全文数据库 医药卫生科技辑》 * |
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