CN102127142A

CN102127142A - 救必应酸衍生物及其在制备抗肿瘤的药物中的应用

Info

Publication number: CN102127142A
Application number: CN 201010607515
Authority: CN
Inventors: 赫玉芳; 赵全成; 南敏伦; 王化录; 马吉胜; 赵昱玮; 王莲萍
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2010-12-28
Filing date: 2010-12-28
Publication date: 2011-07-20
Anticipated expiration: 2030-12-28
Also published as: CN102127142B

Abstract

本发明公开了从中药救必应(Ilicis routundae cortex)中提取分离纯化得到救必应酸作为先导化合物，经相应的化学反应制备了一系列衍生物，经药理实验证明，救必应酸衍生物具有抗肿瘤活性，对前列腺癌细胞、肺癌细胞、肝癌细胞、宫颈癌细胞、胃癌细胞具有抑制作用，衍生物对上述的肿瘤细胞的抑制作用优于母核化合物救必应酸。

Description

救必应酸衍生物及其在制备抗肿瘤的药物中的应用

技术领域

本发明涉及一种从天然中药中获得的救必应酸的衍生物制备方法，确切的说是一种以中药提取化学成分为先导化合物，制备一系列衍生物，以抗肿瘤活性为指标进行结构修饰，属于医药领域。

背景技术

救必应酸是从中药救必应(Ilicis routundae cortex)中经提取、纯化、分离、碱降解而获得的一种五环三萜类化合物。我们的研究已经证明了救必应酸具有预防和治疗心脑血管疾病的药理活性(专利公开号：CN101856357A)，同时具有降血脂等药理作用(专利公开号：CN101849950A)。据文献报道一些五环三萜类化合物，如熊果酸、齐墩果酸等也具有较强的抗肿瘤活性(中国民族民间医药，2009年，12期，14-15)，因此，本发明的目的在于对救必应酸化合物进行结构改造，制备一系列衍生物，以期寻找对肿瘤细胞株生长有更强的抑制作用的新的五环三萜类衍生物。根据我国常见肿瘤发病疾病，选择了前列腺癌、肺癌、肝癌、宫颈癌、胃癌等肿瘤细胞，进行抗肿瘤活性实验，从而进行药效学评价。

在本发明完成之前，还没有文献报道救必应酸及救必应酸的衍生物具有抑制肿瘤细胞生长的作用，也未发现救必应酸及救必应酸的衍生物在制备抗肿瘤药物应用的报道。

发明内容

本发明在于提供一种以救必应酸为先导化合物合成一系列具有抗肿瘤作用的救必应衍生物。

本发明的目的是通过以下技术方案得以实现：

一种具有抗肿瘤活性的救必应酸衍生物(具体的取代基结构见表1)，其结构式如下：

其中：R₁为羟基或酰氧基；R₂为羟基或氨基醇

如上所述的一种具有抗肿瘤活性的救必应酸衍生物由以下方法得到：

1、乙醇提取中药救必应(Ilicis routundae cortex)，经纯化、分离、碱降解而获得的化合物1(3β，19α，24-三羟基-乌苏烷型-12-烯-28-羧酸)，即救必应酸。

2、化合物1分别与乙酸酐、丙酸酐或丁二酸酐反应得3β，19α-二酰氧基-24-羟基-乌苏烷型-12-烯-28-羧酸类化合物2-4。

其中R₁为酰氧基

3、化合物2-3与草酰氯在室温下反应，然后在PH为8-9的条件下加氨基醇反应得N(3β，19α-二酰氧基-24-羟基-乌苏烷型-12-烯-28-酰)-氨基醇化合物5-10；

其中R₁为酰氧基，R₂为取代氨基醇

4、化合物5-10在碱溶液中水解得N(3β，19α，24-三羟基-乌苏烷型-12-烯-28-酰)-氨基醇化合物11-13；

R₂为取代氨基醇

表1具体各化合物结构

以上所述的一种具有抗肿瘤活性的救必应酸衍生物，可用于制备治疗肿瘤疾病的药物。

本发明的特点为：对天然产物救必应酸进行化学修饰，得到一系列与救必应酸结构相似的衍生物，经药理实验证明，具有对肿瘤细胞明显的抑制作用，且活性优于母体化合物救必应酸。

救必应酸及衍生物对肿瘤细胞的抑制作用，这些药理作用，通过以下药效学试验例得到证实。

细胞人宫颈癌细胞(Hela)、人小细胞肺癌(NCI-H446)、人乳腺癌细胞(MCF-7)、人胃癌细胞(SGC-7901)、人肝癌细胞(BEL-7402)、前列腺癌细胞(DU 145)等6种细胞系均购自吉林省肿瘤医院。

药品及试剂救必应酸及各衍生物为本实验室自制；四甲基偶氮唑盐(MTT)为Sigma公司产品；青霉素G钾盐为Sigma公司产品；硫酸链霉素Sigma公司产品；HEPES为Sigma公司产品；DMSO为Sigma公司产品；胰酶为Difco公司；新生牛血清(FBS)为北京元亨圣马生物技术研究所产品；RPMI-1640培养基为Hyclone公司产品。

仪器 CK2TRC-3荧光倒置显微镜，日本OLYMPUS产品；D-63450-CO₂培养箱，德国Hera公司产品；FCANF129004酶标仪，澳大利亚TECAN公司产品。

实验方法MTT法 6种人的肿瘤细胞株按常规方法培养传代，取对数生长期细胞用于实验。将细胞以1×10⁵个/mL浓度接种于96孔板(100μL/孔)，培养12h后，实验组加入救必应酸各衍生物(或5-氟尿嘧啶作为阳性对照组)100μL/孔，阴性对照组加入培养液100μL/孔，每组各设4个平行孔，并分别设空白孔(即只加入药液和培养液，不加细胞)以调零。将救必应各衍生物组培养44h，加入5mg/mLMTT 20μL，继续培养4h，弃上清，每孔加入DMSO150μL，混匀，酶标仪(λ＝492nm)测定吸光度(A₄₉₂)，利用SPSS统计软件，计算细胞死亡率，求取IC₅₀。

实验结果

结果表明，经SPSS软件统计，救必应酸及衍生物对Hela、NCI-H446、MCF-7、SGC-7901、BEL-7402、DU 145等6种肿瘤细胞均有不同程度的抑制作用，救必应酸及衍生物对6种肿瘤细胞的抑瘤率、IC₅₀和5-FU对各细胞的IC₅₀值详见表2和3。从表2和表3中可以看出，化合物4、5、6、7、11、12、13对肿瘤细胞的生长抑制作用较强，而化合物1、2、3、8、9、10对肿瘤细胞的敏感性较差。各衍生物对肿瘤细胞的抑制作用都大于救必应酸。除救必应酸外，其余个化合物的IC₅₀均小于阳性对照药5-FU，说明各衍生物均具有很强的抑制肿瘤细胞的作用。

表2浓度为10.00μg/mL各化合物对6种肿瘤细胞的抑瘤率

表3救必应酸各衍生物及5-FU对6种肿瘤细胞的IC₅₀(μg/mL)

为了支持本发明，举例说明本发明中化合物的制备过程，但并不意味这本发明就限于此，具体实施方法如下。

实例1

3β，19α，24-三羟基-乌苏烷型-12-烯-28-羧酸(化合物1)的制备：

药材用70％的乙醇回流提取3次，每次2小时，合并提取液，加提取液体积2％药用活性碳，过滤，滤液浓缩至每1ml含1g药材；加1mol/l的氢氧化钠溶液2倍量，100℃水解4小时，放冷，用盐酸调PH值为3，滤过，弃去水解液，滤饼用去离子水洗至中性，再用85％的乙醇加热至沸，加入药液体积的1％的药用活性炭，趁热滤过，滤液减压浓缩回收至无醇味、加水至每1ml含1g药材，放置，过滤，水洗，干燥，再重结晶2次，得化合物1(分子式C₃₀H₄₈O₅，分子量为488.68)。收率为3.2％，含量为96.4％。白色粉末，mp：272～274℃；IR(KBr)cm^-1：3500～2600，1698，1650；EI-MS m/z：488(M+)。元素分析：实测值，C为72.69％，H为9.92％，O为16.58％；计算值：C为73.88％，H为9.83％，O为16.39％。

实例2

3β，19α-二乙酰氧基-24-羟基-乌苏烷型-12-烯-28-羧酸(化合物2)的制备：

化合物1取5g，加吡啶200ml，醋酸酐100ml，80℃下搅拌，以TLC检测反应终点，反应完毕，回收反应溶剂，加水至250ml，用稀盐酸调PH为5，滤过，滤饼用水洗至无色，用乙酸乙酯250ml溶解，用水洗涤2次，每次100ml，再用10％碳酸钠洗涤3次，每次100ml，再用1mol/l的盐酸100ml洗涤1次，最后用水洗涤2次，每次100ml，回收乙酸乙酯也至干，加乙醇300ml加热溶解，加1g活性炭，搅拌均匀，滤过，滤液回收乙醇至50ml，放置，析晶，过滤，得化合物2(分子式C₃₄H₅₂O₇，分子量为572.74)。固体为4.1g。白色粉末，mp：156.5～158.5℃；IR(KBr)cm^-1：1256，1370，1387，1727；NMR：特征化学位移2.1(6H)；EI-MS m/z：572(M+)。元素分析：实测值，C为71.20％，H为9.21％，O为19.53％；计算值：C为71.33％，H为9.09％，O为19.58％。

实例3

3β，19α-二丁二酰氧基-24-羟基-乌苏烷型-12-烯-28-羧酸(化合物4)的制备：

化合物1取5g，丁二酸酐8g，吡啶100ml，搅拌溶解，缓缓加热至110℃，搅拌反应，以TLC检测反应终点，反应完毕，放至室温，加入100ml冰水中，用盐酸冰水混合液调PH值，滤过，滤渣水洗至无色，用乙醇300ml加热溶解，加水至1000ml，滤过，滤渣再用500ml95％乙醇加热溶解，加2g活性炭，搅拌均匀，滤过，滤液回收乙醇至200ml，加水200ml，浓缩，放置，析晶，过滤，得化合物4(分子式C₃₈H₅₆O₁₁，分子量为688.80)。固体为7.1g。白色粉末，mp：244.4～246.4℃；IR(KBr)cm^-1：1169，1216～1273，1714；NMR：特征化学位移2.6-2.7(8H)；EI-MS m/z：688(M+)。元素分析：实测值，C为65.98％，H为8.47％，O为25.46％；计算值：C为66.28％，H为8.14％，O为25.58％。

实例4

N(3β，19α-二乙酰氧基-24-羟基-乌苏烷型-12-烯-28-酰)-氨基乙醇(化合物5)的制备：

化合物2取0.811g，加6ml二氯甲烷溶解，加入草酰氯0.8ml，室温反应，以TLC检测反应终点，反应完毕，蒸发溶剂，加石油醚减压回收，反复3次，每次50ml，最后用8ml二氯甲烷溶解，用三乙胺调PH为9-10，再加乙醇胺0.8ml，反应1.5h，加水50ml，用稀盐酸调PH为3-4，回收溶剂，滤过，滤渣用乙醇200ml溶解，加水至500ml，滤过，滤渣再用乙醇100ml加热溶解，加0.5g活性炭，搅拌均匀，滤过，滤液回收乙醇，放置，析晶，过滤，得化合物5(分子式C₃₆H₅₇O₇N，分子量为615.81)。固体为0.69g。白色粉末，mp：153.4～155.8℃；IR(KBr)cm^-1：1037，1169，1250，1371，1471，1528，1636，1740；NMR：特征化学位移2.1(6H)，3.1(2H)，3.6(2H)，7.2(1H)；EI-MS m/z：615(M+)。元素分析：实测值，C为69.48％，H为9.41％，O为18.16％，N为2.31％；计算值：C为70.24％，H为9.27％，O为18.21％，N为2.28％。

实例5

N(3β，19α，24-三羟基-乌苏烷型-12-烯-28-酰)-氨基乙醇(化合物11)的制备：

化合物5取0.205g，加1mol/l氢氧化钠的60％甲醇溶液，100℃降解8h，放冷，加入30ml水，用稀盐酸调PH为3-4，滤过，滤渣用水洗至中性，干燥，再用95％乙醇溶解，回收溶剂，析晶，滤过，得化合物11。固体为0.16g(分子式C₃₂H₅₃O₅N，分子量为531.75)。白色粉末，mp：174.1.4～176.1℃；IR(KBr)cm^-1：1046，1460，1525，1046；NMR：特征化学位移3.1(2H)，3.6(2H)，7.2(1H)；EI-MS m/z：531(M+)。元素分析：实测值，C为71.68％，H为9.85％，O为15.16％，N为2.58％；计算值：C为72.32％，H为9.98％，O为15.07％，N为2.63％。

Claims

1.一种由救必应酸衍生物，其结构特征为：

其中：R₁为OH或CH₃COO或CH₃CH₂COO或COOHCH₂CH₂COO，R₂为OH或NHCH2CH2OH或NHCH(CH₃)CH₂OH或NH(C₆H₄-2-CH₂OH)。

2.根据权利要求1所述的救必应酸衍生物，其特征在于具有抑制肿瘤细胞生长的作用、可在制备抗肿瘤药物中的应用。