CN102351934A

CN102351934A - 甾体生物碱化合物，其药物组合物及其制备方法和应用

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Publication number: CN102351934A
Application number: CN2011102355620A
Authority: CN
Inventors: 邱明华; 罗怀容; 孙赟; 周琳; 胡映开; 吴桂生
Original assignee: Kunming Institute of Botany of CAS
Current assignee: Kunming Institute of Botany of CAS
Priority date: 2011-08-16
Filing date: 2011-08-16
Publication date: 2012-02-15
Anticipated expiration: 2031-08-16
Also published as: CN102351934B

Abstract

具有抑制胆碱酯酶活性的式(I)的甾体生物碱类化合物，含有该类化合物的药物组合物，该类化合物及其药物组合物在制备抑制胆碱酯酶的药物中的应用，

Description

甾体生物碱化合物,其药物组合物及其制备方法和应用

技术领域：

本发明属于药物技术领域，具体地，涉及具有抑制胆碱酯酶活性的甾体生物碱类化合物，含有该类化合物的药物组合物，该类化合物及其药物组合物在制备抑制胆碱酯酶的药物中的应用。

背景技术：

随着世界人口平均寿命的逐年增加，老年性痴呆症的发病率也随着迅速上升，老年痴呆症中有50％-70％为阿尔茨海默氏病(AD)，阿尔茨海默氏症又称早老年性痴呆症，患者的脑功能逐渐率退，出现记忆力、抽象思维能力和语言表达能力减退、行动不便和其它功能性障碍，影响神经系统功能，最终导致死亡。AD是一种以进行性认知和记忆力损伤为主的中枢神经系统退行性疾病，估计全球世界阿尔茨海默氏病发病人数高达1200多万。在发达国家此病是继心血管病和肿瘤之后引起死亡的主要疾病。

治疗AD的药物主要有胆碱能类药物、神经细胞代谢增强剂、抗氧化剂、钙离子拮抗剂、神经生长因子、雌激素、抗炎药、抗β淀粉样蛋白药物等。目前临床上治疗该病最成功的方法就是通过提高中枢神经系统内胆碱能神经递质——乙酰胆碱的水平，改善AD病人的症状。其中针对的通过抑制AChE对乙酰胆碱的降解作用而提高脑内的乙酰胆碱的水平，是改善症状的有效途径。临床上有效的药物如他克林(Cognex，tacrine)，安理申(Aricept，donepezil)，艾斯能(Exelon，rivastigmine)，加兰他敏(Reminyl，galantamine)和石杉碱甲(HupA)均为乙酰胆碱酯酶抑制剂，它们能有效升高脑内乙酰胆碱水平，使人的认知功能得以改善²。而作为乙酰胆碱酯酶抑制剂的著名天然产物石杉碱甲，其药效得到了临床的充分肯定，在此基础上中国科学院上海药物研究所合成一系列石杉碱甲的衍生物，发现了一个新型的抗老年痴呆的治疗药物“希普林”，目前在欧洲进入了三期临床，预计2-3年以后可以得到批准上市。

可逆或不可逆地抑制乙酰胆碱酯酶(cholinesterase AChE)从而延缓乙酰胆碱分解的化合物称为胆碱酯酶抑制剂，又称抗乙酰胆碱酯酶药或间接胆碱能激动剂。胆碱酯酶抑制剂能抑制AChE，因而用途较广泛：1.抑制活性物质对受体区ACh的浓度因AChE的失活而增加，对肌肉的刺激随之增强。胆碱酯酶抑制剂用于治疗重症肌无力和青光眼，由于作用持续时间较长，在治疗上优于胆碱能激动剂。2.胆碱能神经传递的生物化学胆碱能神经内中枢神经冲动是通过动作电位传导的，Na+和K+是神经传递所涉及的重要离子。一旦接受神经冲动，ACh便从胆碱神经末梢的贮藏突触囊泡中释放出来。随后人Ch与突触后膜上的受体、运动终板或神经肌接头结合，从而改变接头后膜的通透性，使兴奋所必需的离子得以流动，由此实现冲动的传递。因此新型胆碱酯酶抑制剂的发现，对开发神经系统疾病治疗药物和天然杀虫农药，具有重要的意义。

神经生长因子(nerve growth factor，NGF)的神经营养作用，在胚胎发育的一定时期内，为效应神经元生存所必须。体外实验证实，如果培养液中不加NGF，神经细胞即不能长出轴突，也不能存活。NGF及其受体也广泛分布于中枢神经系统，由海马和脑皮质产生的NGF可通过胆碱能神经逆行运输至前脑基底核，维持胆碱能神经元的存活和功能。在胚胎发育早期，中枢NGF的含量决定胆碱能神经的密度。在无胆碱能神经支配的小脑区和下丘脑，NGF含量也较高，表明除胆碱能神经外，NGF对其他类神经元也有营养作用。基于这些认识，本发明试图通过发现对胆碱酯酶抑制或激活作用的活性物质，发现对NGF具有活性的天然有机化合物。

发明内容：

本发明旨在提供新型的甾体生物碱，该类生物碱具有抑制胆碱酯酶的活性。另一目的还在于提供以该类生物碱为活性成分组成的药物组合物，它们的制备方法，及其它们在制备抑制胆碱酯酶的药物中的应用。

本发明的上述目的是由下述的技术方案得以实现的：

如下结构式(I)所示的甾体生物碱化合物，

其中，R₁＝H，CH₃，C₂H₅......C_nH_2n+1；CHO，COCH₃，COC₂H₅......COC_nH_2n+1；n＝0～20

R₂＝H，CH₃，C₂H₅......C_nH_2n+1；CHO，COCH₃，COC₂H₅......COC_nH_2n+1；n＝0～20。

上面所述的甾体生物碱化合物，为下述结构式所示的化合物1和2，

本发明同时提供了抑制胆碱酯酶的组合物，其含有上述任一项的甾体生物碱化合物作为有效成分，至少还包含一种药学上可接受的载体。

本发明上述任一项甾体生物碱化合物在制备抑制胆碱酯酶的药物中的应用。

上述抑制胆碱酯酶的组合物在制备抑制胆碱酯酶的药物中的应用。

本发明的甾体生物碱化合物的制备方法，取毛叶板凳果P.axillaris var.stylosa植物，晾干粉碎，用95％甲醇加热回流提取3次，合并提取液后减压回收，得甲醇浸膏；分5次向甲醇浸膏中加入3％HCl水溶液捏溶，酸水溶解部分加入5％NaOH水溶液，调至pH≈9后，静置过夜，用氯仿萃取5次，回收溶剂，得生物碱部分Fr.A，将生物碱部分Fr.A浸膏以硅胶拌样，进行硅胶柱层析，氯仿-甲醇溶剂系统，1∶0至0∶1梯度洗脱，经过TLC检测，合并相同部分，得到四个馏分Fr.A1-A4；馏分Fr.A1利用硅胶柱色谱，氯仿-甲醇溶剂系统、氯仿-丙酮溶剂系统、石油醚-丙酮溶剂系统，氧化铝柱色谱，以石油醚-丙酮-二乙胺系统反复梯度洗脱，之后经葡聚糖凝胶LH-20柱色谱纯化，得到化合物1；馏分Fr.A2经硅胶柱色谱，石油醚-丙酮-二乙胺系统、石油醚-丙酮系统和葡聚糖凝胶LH-20柱色谱反复层析，得化合物2。

本发明从毛叶板凳果(Pachysandra axillaris var.stylosa)中得到的上述的新型的甾体生物碱，是甾体C-2上存在直接以C-C键连结的苯基，是比较新奇的天然结构，而更加有趣的是，这些新型甾体生物碱显示比较好的胆碱酯酶抑制活性。

附图说明：

图1为本发明化合物1a的X-Ray单晶衍射ORTEP drawing结构示意图。

具体实施方式：

下面结合附图，用本发明的实施例来说明本发明的实质性内容，但并不以此来限定本发明。

实施例1：

活性甾体生物碱stylosamine A(1)，stylosamine B(2)的制备

1、材料：

毛叶板凳果(Pachysandra.axillaris var.stylosa)为黄杨科(Buxaceae)板凳果属(Pachysandra)植物，又名宿柱三角咪，常绿或半常绿平卧亚灌木，密被微柔毛。茎直立，叶坚纸质，卵形或卵状长圆形，先端渐尖或急尖，叶面近光滑，叶背有匀细的短柔毛，中脉、侧脉上尚布满疏或密长毛及全面散生俯卧的长毛，花单性，雌雄同株，组成穗状花序，花序腋生，较长而密，先端下弯，上部为雄花，基部为雌花，均白色。雄花具1苞片，长椭圆形，背脊具毛，雄蕊4枚，花丝无毛扁平，花药2室，背部着生。雌花基部具2个小苞片，近三角形，边缘具纤毛，花柱柱头线形，反折，无毛。肉质蒴果，成熟时红色，顶端具有3枚宿存长达1.2cm的卷曲花柱。花期3月，果期10月。主要分布于我国云南、江西、陕西、广东、福建等省，在云南省内主要分布于滇东至东南(路南、师宗、弥勒、蒙自、文山、广南、富宁等地)，生于海拔600-2100米的山地林下阴湿地。(1.云南省植物研究所，云南植物志，1977；第一卷：153-156.；2.中国科学院中国植物志编辑委员会，中国植物志.科学出版社：1980；第四十五卷第一分册：56-60.)

毛叶板凳果全草入药，药材名为三角咪，又称山板凳、毛叶板凳果等。各地本草，特别西南地区的地方本草对其均有所记载，认为其药性温，味辛，可活血、化瘀、止痛，主治跌打损伤、劳伤腰痛、腹痛，《贵州草药》还记载了2个毛叶板凳果的方子，一个是毛叶板凳果、铁筷子、见血飞各9g，泡酒服用治疗劳伤腰痛；另一个是毛叶板凳果、铁筷子各15g，水煎服用治疗跌打损伤。现代关于毛叶板凳果的研究较少，一般认为，毛叶板凳果主要含有螺旋富贵草碱B、矮陀陀碱A、B等甾体生物碱类化合物，其中一些化合物还具有抗肿瘤活性等。

2、植物来源：

实验用毛叶板凳果(P.axillaris var.stylosa)样品于2008年9月采自云南省文山州马关市八寨乡石桥村；植物标本由昆明植物所李锡文研究员鉴定；标本存放于昆明植物所植物化学与西部植物资源可持续利用国家重点实验室。

3、提取和分离：

毛叶板凳果(P.axillaris var.stylosa)植物全株14kg，自然晾干后粉碎，用甲醇(95％)加热回流提取3次，合并提取液后减压回收，得甲醇浸膏4.5kg。分5次向甲醇浸膏中加入HCI水溶液(3％)捏溶，酸水不溶部分为非生物碱部分(约700g)，酸水溶解部分则加入NaOH水溶液(5％)，调至pH≈9后，静置过夜，用氯仿萃取5次，回收溶剂，得生物碱部分Fr.A(400g)。

将生物碱部分Fr.A浸膏以硅胶拌样，进行硅胶柱层析(氯仿-甲醇溶剂系统，1∶0至0∶1梯度洗脱)，经过TLC检测，合并相同部分，得到四个馏分(Fr.A1-A4)。

馏分Fr.A 1利用硅胶柱色谱(氯仿-甲醇溶剂系统、氯仿-丙酮溶剂系统、石油醚-丙酮溶剂系统)，氧化铝柱色谱(以石油醚-丙酮-二乙胺系统洗脱)反复梯度洗脱，之后经葡聚糖凝胶LH-20柱色谱(甲醇)纯化，得到化合物1(156mg)。馏分Fr.A2经硅胶柱色谱(石油醚-丙酮-二乙胺系统、石油醚-丙酮系统)和葡聚糖凝胶LH-20柱色谱(甲醇)反复层析，得化合物2(15mg)。馏分Fr.A3则利用氧化铝柱色谱脱色(氯仿-丙酮系统、石油醚-丙酮系统)，并通过硅胶柱色谱(石油醚-丙酮-二乙胺系统、氯仿-丙酮系统)层析、纯化，得到化合物3(52mg)。

4、甾体生物碱stylosamine A(1)，stylosamine B(2)的结构表征：

(1)stylosamine A(1)

stylosamine A(1)为无色针状结晶或结晶性粉末，无臭；分子式C₃₀H₄₈N₂，分子量437.3895；

易溶于氯仿，酸水；溶于甲醇、乙醇等有机溶剂，难溶于水。

熔点：235℃

[α]²⁰ _D+81.5(CHCl₃，c 1.17)；

紫外光谱UV(MeOH)λmax：207nm；

红外光谱IR(KBr)υmax：3460，2931，1446，755，702cm^-1；

质谱(+)FAB-MS m/z(％)：[M+H]⁺437(100)，421(5)，365(5)，72(74)；

高分辨质谱HR-ESIMSm/s：437.3871(C₃₀H₄₉N₂，计算值437.3895)。

stylosamine A(1)的NMR数据：

氢核磁共振谱数据δ_H(ppm)：1.74-1.80o(1H，m，1-Ha)，1.56-1.63o(1H，m，1-Hb)，3.07(1H，m，2-H)，2.80(1H，s，3-H)，1.56-1.63o(2H，m，4-H)，1.56-1.63o(1H，m，5-H)，1.21-1.25o(2H，m，6-H)，1.66-1.70o(1H，m，7-Ha)，0.99-1.01o(1H，m，7-Hb)，1.38-1.42o(1H，m，8-H)，0.93-0.97o(1H，m，9-H)，1.56-1.63o(1H，m，11-Ha)，1.21-1.25o(1H，m，11-Hb)，1.86-1.89o(1H，m，12-Ha)，1.11-1.15o(1H，m，12-Hb)，1.04-1.07o(1H，m，14-H)，1.56-1.63o(1H，m，15-Ha)，1.04-1.07o(1H，m，15-Hb)，1.86-1.89o(1H，m，16-Ha)，1.43-1.49o(1H，m，16-Hb)，1.38-1.42o(1H，m，17-H)，0.65(3H，s，18-H)，0.89(3H，s，19-H)，2.41(H，m，20-H)，0.86(3H，d，J＝6.4Hz，21-H)，2.17(6H，s，20-N-Me)，2.14(3H，s，3-N-Me)。苯基部分：7.26(1H，m，2’-H)，7.32(1H，m，3’-H)，7.22(1H，m，4’-H)，7.32(1H，m，5’-H)，7.26(1H，m，6’-H)。

数值后o表示信号重叠，通过2D-NMR解析指定。

碳核磁共振谱数据δc(ppm)：37.0(t，C-1)，42.5(d，C-2)，60.4(d，C-3)，31.6(t，C-4)，38.4(d，C-5)，28.4(t，C-6)，31.9(t，C-7)，35.4(d，C-8)，54.7(d，C-9)，36.5(s，C-10)，20.8(t，C-11)，39.8(t，C-12)，41.7(s，C-13)，56.7(d，C-14)，24.0(t，C-15)，27.7(t，C-16)，54.4(d，C-17)，12.4(q，C-18)，12.5(q，C-19)，61.1(d，C-20)，9.8(q，C-21)，39.9(2xq，20-N-Me)，34.8(q，3-N-Me)。苯基部分：144.1(s，C-1’)，127.8(s，C-2’)，128.4(s，C-3’)，126.2(s，C-4’)，128.4(s，C-5’)，127.8(s，C-6’)。

stylosamine A(1)的化学结构推定为：2β-苯基-20a-二甲胺基-3a-甲胺基-5a-孕甾烷

(2β-phenyl-20α-dimethylamino-3α-methylamino-5α-pregnane)，结构如下：

由于直接培养化合物1的单晶存在困难，因此使用CH₃I与化合物1进行反应，将3位氮原子上活泼H用一个甲基取代，得到化合物1a，然后培养得到化合物1a的单晶。

通过对化合物1a进行X-衍射，2位苯环，3位甲基氮的空间构型被确定为α(图1：化合物1a的X-Ray单晶衍射ORTEP drawing结构)。

化合物1a的X-Ray单晶衍射数据：

化合物1a，实验式C31H50N2；分子量450.73；测试温度：93(2)K；测试波长：0.71073A

晶体系Crystal system：三斜；Triclinic；空间群space group：P1

晶胞参数：a＝5.991(3)A，b＝7.400(4)A，c＝16.054(9)Aα＝95.389(5)°，β＝96.557(10)°，γ＝105.587(7)°

晶胞体积：675.3(6)A³

单位晶胞内分子数Z:1；晶胞密度：1.108Mg/m³

最终可靠因子Final R indices[I＞2sigma(I)]：R1＝0.0379，wR2＝0.0845

可靠因子(全部数据)R indices(all data)R1＝0.0428，wR2＝0.08/3

2.stylosamine B(2)

stylosamine B(2)为无色针状结晶或结晶性粉末，无臭；分子式C₂₉H₄₆N₂，分子量423.3739；

易溶于氯仿；溶于酸水，溶于甲醇、乙醇等有机溶剂，难溶于水。

熔点：156℃

[α]²⁰ _D+28.0(CHCl₃，c 0.92)；

紫外光谱UV(MeOH)λmax：206nm；

红外光谱IR(KBr)υmax：3433，2925，1445，757，700cm^-1；

质谱(+)FAB-MSm/z(％)：[M+H]⁺ 423(40)，365(10)；58(100)；

高分辨质谱HR-ESIMSm/s：423.3706(C₂₉H₄₇N₂，计算值423.3739)。

stylosamine B(2)的NMR数据：

氢核磁共振谱数据δ_H(ppm)：1.72-1.82o(1H，m，1-Ha)，1.59-1.67o(1H，m，1-Hb)，3.08(1H，m，2-H)，2.82(1H，s，3-H)，1.50-1.64o(2H，m，4-H)，1.52-1.63o(1H，m，5-H)，1.23-1.29o(2H，m，6-H)，1.65-1.70o(1H，m，7-Ha)，0.94-0.99o(1H，m，7-Hb)，1.34-1.45o(1H，m，8-H)，0.94-0.99o(1H，m，9-H)，1.57-1.64o(1H，m，11-Ha)，1.22-1.29o(1H，m，11-Hb)，1.92-1.96o(1H，m，12-Ha)，1.16-1.20o(1H，m，12-Hb)，1.06-1.13o(1H，m，14-H)，1.60-1.67o(1H，m，15-Ha)，1.05-1.14o(1H，m，15-Hb)，1.85-1.94o(1H，m，16-Ha)，1.29-1.39o(1H，m，16-Hb)，1.31-1.39o(1H，m，17-H)，0.68(3H，s，18-H)，0.90(3H，s，19-H)，2.41(H，m，20-H)，1.09(3H，d，J＝6.1Hz，21-H)，2.38(3H，s，20-N-Me)，2.15(3H，s，3-N-Me)。苯基部分：7.21-7.36o(1H，m，2’-H)，7.21-7.36o(1H，m，3’-H)，7.21-7.36o(1H，m，4’-H)，7.21-7.36o(1H，m，5’-H)，7.21-7.36o(1H，m，6’-H)。

数值后o表示信号重叠，通过2D-NMR解析指定。

碳核磁共振谱数据δc(ppm)：37.0(t，C-1)，42.4(d，C-2)，60.3(d，C-3)，31.6(t，C-4)，38.3(d，C-5)，28.3(t，C-6)，31.9(t，C-7)，35.2(d，C-8)，54.3(d，C-9)，36.5(s，C-10)，20.7(t，C-11)，39.5(t，C-12)，42.2(s，C-13)，56.4(d，C-14)，24.1(t，C-15)，27.0(t，C-16)，56.2(d，C-17)，12.5(q，C-18)，12.5(q，C-19)，58.0(d，C-20)，18.4(q，C-21)，33.0(q，20-N-Me)，34.7(q，3-N-Me)。苯基部分：144.1(s，C-1’)，127.8(s，C-2’)，128.4(s，C-3’)，126.2(s，C-4’)，128.4(s，C-5’)，127.8(s，C-6’)。

stylosamine B(2)的化学结构推定为：2β-苯基-20a-甲胺基-3a-甲胺基-5a-孕甾烷(2β-phenyl-20α-methylamino-3α-methylamino-5α-pregnane)，结构如下：

实施例2：

本发明化合物乙酰胆碱酯酶、丁酰胆碱酯酶抑制实验：

1、实验原理：

乙酰胆碱酯酶(acetylcholinesterase，AChE)的主要生理功能为通过快速水解神经传递介质乙酰胆碱(ACh)，中止胆碱能突触中的脉冲传递，故AChE又称乙酰胆碱水解酶(acetylcholine hydrolase)^[2]。

乙酰胆碱酯酶与碘化硫代乙酰胆碱生成的产物，与5，5-二硫双硝基苯甲酸生成一种黄色物质，本模型利用该颜色反应，来测定待测样品对乙酰胆碱酯酶的抑制程度。

丁酰胆碱酯酶(BChE)抑制活性与乙酰胆碱酯酶抑制活性实验类似。

2、材料

乙酰胆碱酯酶(AChE)、丁酰胆碱酯酶(BChE)、5，5-二硫双硝基苯甲酸、碘化硫代乙酰胆碱等均购于SIGMA公司，其它均为国产分析纯。

3、乙酰胆碱酯酶、丁酰胆碱酯酶的抑制活性测定：

取5支磷酸盐缓冲溶液的梨型管，依次加入不同的1.0mM的样品DMSO溶液，使其用DMSO补齐至刻度体积后，将浓度控制为50.0，25.0，12.5，6.25，3.13(x10^-9M)。分别加入一定量的4mg/mL 5，5-二硫代双(2-硝基苯甲酸)和乙酰胆碱酯酶溶液(0.1mg/ml)，并在37℃保温15min后。立即加入一定量2mg/mL硫代乙酰胆碱溶液，摇匀后测其在λ＝405nm处的A值(A_n)。参比用0.1M pH 8.0磷酸盐缓冲溶液。以未加样品所测得的A_control值作为100个活力单位，

相对酶活力＝(A_n/A_control)×100

然后以酶的相对活力对抑制剂浓度作图，根据抑制曲线求得各种化合物的IC₅₀值(抑制酶活力50％时的抑制剂浓度)。

4、本发明实施例1所得化合物1和2对乙酰胆碱酯酶、丁酰胆碱酯酶的抑制活性

表1化合物1和2对乙酰胆碱酯酶、丁酰胆碱酯酶的抑制活性

IC₅₀(μM)	化合物1	化合物2
			AChE	31.11	96.36
BChE	7.35	15.40

新型甾体生物碱化合物1和2属于甾体C-2上具有苯基取代的新型天然产物，发现此类活性具有重要意义；同时孕甾化合物对乙(丁)酰胆碱酯酶抑制活性一般不是十分显著，但是是重要的神经甾体类结构，对神经系统极可能具有其他活性。而这类结构对丁酰胆碱酯酶抑制活性相对较强。

实施例3：

按实施例1的方法先制得化合物1-2，按常规加注射用复合溶剂或助溶剂及注射用水，精滤，灌封灭菌制成注射液。

实施例4：

按实施例1的方法先制得化合物1-2，将其制成固体分散体，溶于注射用水中，再用无菌抽滤漏斗过滤，再无菌精滤，分装于安瓿中，低温冷冻干燥后无菌熔封得粉针剂。

实施例5：

按实施例1的方法先制得化合物1-2，按其与赋形剂重量比为1∶5-1∶10的比例加入赋形剂，制粒压片或制丸。

实施例6：

按实施例1的方法先制得化合物1-2，加入适宜附加剂按常规口服液制法制成口服液。

实施例7：

按实施例1的方法先制得化合物1-2，按其与赋形剂重量比为1∶5-1∶10的比例加入赋形剂，制成颗粒剂或冲剂或胶囊。

Claims

1.如下结构式(I)所示的甾体生物碱化合物，

2.如权利要求1所述的甾体生物碱化合物，为下述结构式所示的化合物1和2，

3.抑制胆碱酯酶的组合物，其含有权利要求1或2任一项的甾体生物碱化合物作为有效成分，至少还包含一种药学上可接受的载体。

4.权利要求1或2所述的任一项甾体生物碱化合物在制备抑制胆碱酯酶的药物中的应用。

5.权利要求3所述的抑制胆碱酯酶的组合物在制备抑制胆碱酯酶的药物中的应用。

6.权利要求1或2所述的任一项甾体生物碱化合物的制备方法，取毛叶板凳果P.axillaris var.stylosa植物，晾干粉碎，用95％甲醇加热回流提取3次，合并提取液后减压回收，得甲醇浸膏；分5次向甲醇浸膏中加入3％HCl水溶液捏溶，酸水溶解部分加入5％NaOH水溶液，调至pH≈9后，静置过夜，用氯仿萃取5次，回收溶剂，得生物碱部分Fr.A，将生物碱部分Fr.A浸膏以硅胶拌样，进行硅胶柱层析，氯仿-甲醇溶剂系统，1∶0至0∶1梯度洗脱，经过TLC检测，合并相同部分，得到四个馏分Fr.A1-A4；馏分Fr.A1利用硅胶柱色谱，氯仿-甲醇溶剂系统、氯仿-丙酮溶剂系统、石油醚-丙酮溶剂系统，氧化铝柱色谱，以石油醚-丙酮-二乙胺系统反复梯度洗脱，之后经葡聚糖凝胶LH-20柱色谱纯化，得到化合物1；馏分Fr.A2经硅胶柱色谱，石油醚-丙酮-二乙胺系统、石油醚-丙酮系统和葡聚糖凝胶LH-20柱色谱反复层析，得化合物2。