CN102311449B - 棉酚衍生物在制备抗肿瘤药物中的应用 - Google Patents

棉酚衍生物在制备抗肿瘤药物中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及棉酚衍生物在制备抗肿瘤药物中的应用。本发明公开了一类新的棉酚衍生物；还公开了所述衍生物在制备防治肿瘤的药物组合物中的用途；还公开了含有所述棉酚衍生物的药物组合物及其制备方法。

Description

棉酚衍生物在制备抗肿瘤药物中的应用
技术领域
本发明属于生物医药领域；更具体地，本发明涉及棉酚衍生物在制备抗肿瘤药物中的应用。
背景技术
恶性肿瘤严重威胁着人类的健康，传统的化疗和放疗缺乏特异性，取得疗效的同时也往往给患者带来较大的毒副作用。
结肠癌(Colorectal cancer)在美国是第三大常见的癌症类型，也是第三大导致病人死亡的癌症类型。2009年，美国新增结肠癌病人约有146970例，其中49920例病人死亡。非转移性结肠癌患者的5年生存率约90％，但发生区域转移(如淋巴结转移)后下降为68％，发生远处转移后则只有10％。目前临床治疗结肠癌的策略包括手术切除病灶、放疗和化疗等等。然而，即使手术成功切除病灶并辅以术后化疗后，5年复发率仍然很高。因此，进一步研究与开发新的治疗结肠癌的药物及治疗策略显得尤为重要与紧迫。据报道，Bcl-2在早期结肠癌中的异常活化将抑制肿瘤细胞凋亡，促进肿瘤发生。棉酚是从棉籽中提取的一种化合物，最初被作为男性避孕药来使用。之前已有报道证实，棉酚通过与肿瘤细胞中Bcl-2和Bcl-xL的BH3结构域结合实现其促凋亡的功能。因此，棉酚可以考虑作为临床治疗结肠癌的候选化疗药物。
之前有研究指出，口服棉酚已经进入临床试验，用于治疗激素非依赖型转移性乳腺癌和肾上腺癌。然而，由于棉酚结构中存在两个活性醛基，可能因此在体内引起肝损伤和消化道损伤等毒副反应，导致它不适合临床应用。目前已经有一系列的棉酚衍生物被报道，如AT-101，Apogossypol，TW-37，ABT-737和WL-276等等，它们也具有抑制癌细胞生长的活性。此外有实验证实，Apogossypol对肝脏和胃肠道的毒性比天然棉酚要小，而且药效接近天然棉酚。由于水溶性良好的化合物通常具有比低水溶性的同类化合物更强的药代动力学性能，在低剂量即可产生更大的功效，因而化合物的水溶性是评价药物效价的一项重要的指标。然而，Apogossypol水溶性较差，表明它不是一个非常合适的药物，需要进一步改进。因此，有必要开发水溶性良好并且毒副作用小的棉酚衍生物，作为治疗结肠癌的潜在候选药物。
发明内容
本发明的目的在于提供棉酚衍生物在制备抗肿瘤药物中的应用。
在本发明的第一方面，提供一种如式I所示结构的化合物、其异构体或其药学上可接受的盐：
R1-R4独立地选自OH，H或O。
在一个优选例中，所述化合物中，R选自
Figure BSA00000174609600022
Figure BSA00000174609600023
在一个优选例中，所述化合物具有如下所示的结构(6-APA-钠-棉酮)：
Figure BSA00000174609600024
其中，R是
Figure BSA00000174609600031
在另一优选例中，所述的化合物具有如下所示的结构：
其中，R选自
Figure BSA00000174609600033
Figure BSA00000174609600034
更佳地，R选自
Figure BSA00000174609600035
Figure BSA00000174609600036
在本发明的另一方面，提供前面所述的化合物在制备防治肿瘤的药物组合物中的用途。
在一个优选例中，所述的肿瘤包括(但不限于)：结肠癌，乳腺癌，黑色素瘤，肺癌或前列腺癌。
在另一优选例中，所述的肿瘤是结肠癌。
在本发明的另一方面，提供前面所述的化合物在制备降低抗凋亡蛋白Bcl-2和/或Bcl-xL的表达的药物组合物中的用途。
在本发明的另一方面，提供一种药物组合物，含有：有效量的所述的化合物或其组合；以及药学上可接受的载体。
在另一优选例中，所述的药物组合物用于防治肿瘤。
在另一优选例中，所述的药物组合物还含有：有效量的5-氟尿嘧啶。
在本发明的另一方面，提供一种制备药物组合物的方法，所述方法包括：将有效量的所述的化合物或其组合与药学上可接受的载体混合。
在另一优选例中，所述方法还包括：将有效量的5-氟尿嘧啶与所述的化合物或其组合以及药学上可接受的载体混合。
在本发明的另一方面，提供一种药盒，含有所述的化合物；或含有所述的药物组合物。
在另一优选例中，所述的药物组合物用于防治肿瘤。
本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
附图说明
图1：棉酚衍生物的制备及结构。
流程1是化合物3、4、5、6、8、9的结构和制备的简要流程图。
流程2是化合物7的结构和制备流程。
其中，数字1-7分别代表化合物1-7；R表示相应化合物的取代基。
图2：化合物7抑制细胞生长并诱导细胞凋亡具有时间和剂量依赖效应。
(A)CT26细胞用不同浓度的化合物7处理不同时间后，检测细胞增殖能力。
(B)CT26细胞用不同浓度的化合物7处理不同时间后，通过TUNEL试剂盒检测细胞凋亡率，以DMSO处理作为阴性对照(NC)。
(C)对(B)的TUNEL结果的统计图。
图3：化合物7通过与Bcl-2和Bcl-xL的BH3结构域结合下调其蛋白表达水平。
(A-B)分子对接模拟研究。利用软件AutoDock Vina(http://vina.scripps.edu/)将抗凋亡蛋白Bcl-2(Protein Data Bank code 1YSW)(A)与Bcl-xL(PDB code1BXL)(B)与化合物7对接。
(C)CT26细胞用5μM和10μM化合物7在处理不同时间，以DMSO处理作为阴性对照(NC)；之后收集细胞，裂解，检测Bcl-2和Bcl-xL蛋白表达水平的变化，β-actin作为内参对照。
图4：化合物7与传统的抗癌药物5-氟尿嘧啶联用后，增强了其在体外及体内抑制结肠癌生长的活性。
(A)化合物7可以在体内抑制结肠癌生长。5×105/0.1ml的CT26细胞注入小鼠右侧背部皮下。待肿瘤体积达到约60mm3，将小鼠随机分成不同的组，每组4只。CT26荷瘤小鼠按10μmol/公斤体重的剂量每天经灌胃给予化合物7连续12天，以灌胃给予10％酒精作为阴性对照。每2天测定一次肿瘤长度和宽度。肿瘤体积按公式长×宽×宽×0.52来计算。(P＜0.01用*表示)。
(B)化合物7与5-氟尿嘧啶联用后，在体外显著抑制结肠癌生长。CT26细胞用10μM化合物7与25μM 5-氟尿嘧啶联合处理或分别单独处理后，检测细胞的存活率，以DMSO处理作为阴性对照(NC)(P＜0.01用*表示；P＜0.001用**表示)。
(C)CT26荷瘤小鼠按(A)分组。荷瘤小鼠按10μmol/公斤体重的剂量每天经灌胃给予化合物7，以10％乙醇作为对照；同时，按10毫克/公斤体重的剂量每两天经腹腔注射5-氟尿嘧啶一次，以PBS作为对照。每2天测量小鼠肿瘤并计算体积(P＜0.01用*表示；P＜0.001用**表示)。
图5：化合物7与天然棉酚(化合物1)在正常小鼠体内的毒性比较。6-8周雄性BALB/c小鼠分成3组，每组6只，分别按120μmol/公斤体重的剂量连续12天经灌胃给予化合物7或1，对照组灌给10％乙醇(NC)。
(A)不同处理组的小鼠生存情况统计。
(B)12天以后称量所有小鼠体重，并做统计分析(P＜0.01用*表示)。
(C)取3组小鼠的小肠，用石蜡包埋，5μm切片后做苏木素-伊红染色，并于镜下观察。
具体实施方式
棉酚由于其低水溶性以及体内副作用的原因，一直没有在临床上被普遍用于抗肿瘤治疗。为了克服以上缺点，本发明人进行了广泛而深入的研究，设计并合成了一些新的棉酚衍生物，并且分析了它们的抗癌活性，从中找到了一类抗肿瘤效果明显、水溶性好、毒副作用低的棉酚衍生物。在此基础上完成了本发明。
化合物
本发明首先提供了一种具有如结构式(I)所示结构的化合物：
Figure BSA00000174609600061
其中，R选自
Figure BSA00000174609600062
Figure BSA00000174609600063
R1-R4独立地选自OH，H或O。
相对于天然棉酚，由于在醛基位置上的改变(由醛基变为R基团)，引入水溶性片段制备得到席夫碱衍生物，使得本发明的化合物(特别是化合物7、化合物3以及化合物6-9)的可溶性显著优于天然的棉酚。
作为本发明的优选方式，所述的化合物具有如下所示的结构：
Figure BSA00000174609600064
其中，R是
Figure BSA00000174609600065
即6-APA-钠-棉酮；
或具有如下所示的结构：
Figure BSA00000174609600066
其中，R选自
Figure BSA00000174609600068
如的表示方法是本领域人员熟知的，其表示该位置的键可以是单键，也可以是双键。
本发明还包括上述化合物的药学上可接受的盐、水合物或前体，只要它们也具有防治肿瘤的作用。所述的“药学上可接受的盐”是指一类化合物与无机酸、有机酸、碱金属或碱土金属等反应生成的盐。这些盐包括(但不限于)：(1)与如下无机酸形成的盐：如盐酸、硫酸、硝酸、磷酸；(2)与如下有机酸形成的盐，如乙酸、草酸、丁二酸、酒石酸、甲磺酸、马来酸、或精氨酸。其它的盐包括与碱金属或碱土金属(如钠、钾、钙或镁)形成的盐，以酯、氨基甲酸酯，或其它常规的“前体药物”的形式。
所述的“化合物的前体”指当用适当的方法服用后，该化合物的前体在病人体内进行代谢或化学反应而转变成具有结构式(I)所示结构的一种化合物，或结构式(I)所示结构的一个化合物所组成的盐或溶液。
本发明还包括上述化合物的异构体、外消旋体，只要它们也具有防治肿瘤的作用。化合物具有一个或多个不对称中心。所以，这些化合物可以作为外消旋的混合物、单独的对映异构体、单独的非对映异构体、非对映异构体混合物、顺式或反式异构体存在。
作为本发明的一种特别优选的方式，所述的化合物是6-APA-钠-棉酮。经验证，该化合物水溶性明显大于天然棉酚，毒副作用明显低于天然棉酚，且具有非常好的抗肿瘤作用。
本领域人员应理解，在得知了本发明化合物的结构以后，可通过多种本领域熟知的方法、利用公知的原料，来获得本发明的化合物，比如化学合成或从生物(如动物或植物)中提取的方法，这些方法均包含在本发明中。
合成化学改造、保护官能团方法学(保护或去保护)对合成应用化合物是很有帮助的，并且是现有技术中公知的技术，如R.Larock，Comprehensive OrganicTransformations，VCH Publishers(1989)；T.W.Greene and P.G.M.Wuts，Protective Groups in Organic Synthesis，3rd Ed.，John Wiley and Sons(1999)；L.Fieser and M.Fieser，Fieser and Fieser”sReagents for Organic Synthesis，JohnWiley and Sons(1994)；和L.Paquette，ed.，Encyclopedia of Reagents for OrganicSynthesis，John Wiley and Sons(1995)中都有公开。
用途
基于本发明人的新发现，本发明提供了具有式(I)所示的结构的化合物或其异构体、外消旋体、药学上可接受的盐、水合物或前体的用途，用于制备防治肿瘤的药物(或组合物)。
在本发明的实施例中，具体验证了各化合物对于多种肿瘤细胞株的抑制作用，结果证明了各化合物可以不同程度地发挥抗肿瘤作用。特别是6-APA-钠-棉酮(化合物7)的水溶性比天然棉酚有很大改善，且具有很好的抗肿瘤活性。6-APA-钠-棉酮通过诱导肿瘤细胞中Bcl-2和Bcl-xL蛋白表达水平的下降，并且抑制Bcl-2和Bcl-xL与其促凋亡蛋白形成二聚体来诱导肿瘤细胞发生凋亡。体内实验证实6-APA-钠-棉酮能够抑制小鼠结肠癌细胞形成肿瘤的生长。此外，6-APA-钠-棉酮在体内的毒副作用也比天然棉酚要小，并且该化合物与5-氟尿嘧啶联合使用时，对结肠癌的生长有了更好的抑制作用。因此，6-APA-钠-棉酮用于肿瘤(特别是结肠癌)治疗的前景要优于天然棉酚，具有可观的临床研究和应用价值。
组合物
如本文所用，术语“本发明的组合物”通常是药物组合物，其含有式(I)所示结构的化合物或其异构体、外消旋体、药学上可接受的盐、水合物或前体作为防治肿瘤的活性成分；以及药学上可接受的载体或赋形剂。
本发明中，术语“含有”表示各种成分可一起应用于本发明的混合物或组合物中。因此，术语“主要由...组成”和“由...组成”包含在术语“含有”中。
本发明中，“药学上可接受的”成分是适用于人和/或动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)即有合理的效益/风险比的物质。
本发明中，“药学上可接受的载体”是用于将本发明的具有式(I)所示结构的化合物或其异构体、外消旋体、药学上可接受的盐、水合物或前体传送给动物或人的药学上或食品上可接受的溶剂、悬浮剂或赋形剂。载体可以是液体或固体。适用于本发明的药学上可接受的载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。
本发明还提供了制备防治肿瘤的组合物的方法，包括使用具有式(I)所示的结构的化合物。可将有效量的式(I)化合物与药学上可接受的载体混合获得本发明的组合物，活性成分在组合物中的重量比例例如可以是0.0001-50wt％；较佳地可以是0.001-20wt％。
本发明的药物组合物也可以是一种中药或天然产物提取物，其中含有本发明的具有式(I)所示结构的化合物作为活性成分，提取可以采用一些已知的方法。
本发明所述的药物组合物的剂型可以是多种多样的，只要是能够使活性成分有效地到达哺乳动物患处的剂型都是可以的。从易于制备和给药的立场看，优选的药物组合物是一种注射或口服的制剂。比如可选自：溶液、或悬浮液、粉末剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂。其中具有式(I)所示结构的化合物或其异构体、外消旋体、药学上可接受的盐、水合物或前体可以存在于适宜的固体或液体的载体或稀释液中。本发明的药物组合物中可以加入制备不同剂型时所需要的各种常规载体或辅料，如填充剂、矫味剂、抗氧化剂、香料、色素、润滑剂、助流剂、润湿剂、乳化剂、pH缓冲物质等。这些添加剂都是本领域人员所熟知的。
本发明还提供了一种防治肿瘤的方法，包括步骤：给需要的对象施用有效量的式(I)化合物。活性成分的给药量是治疗有效量。当外用时，本发明所述的化合物的安全有效量通常约0.1ng-100mg/kg体重；较佳的约1ng-10mg/kg体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、用药者健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。
此外，本发明所述的化合物还可与其他活性成分或治疗剂(如其它抗肿瘤药物等)一起使用。作为本发明的优选方式，所述的其它活性成分或治疗剂是5-氟尿嘧啶。
作为本发明的优选方式，本发明所述的化合物与5-氟尿嘧啶当用于制备药物组合物时，两者的使用量按照摩尔比为1∶(1-20)；较佳地为1∶(5-10)；更佳地为1∶8。
本发明还提供了一种药盒，其特征在于，含有本发明所述的一种或多种化合物；或含有本发明所述的药物组合物。所述的药盒中还可含有使用说明书，以指导药物的使用。
本发明的主要优点在于：
(1)首次揭示了一类新的棉酚衍生物，其比天然棉酚具有更好的水溶性，且具有较好的抗肿瘤效果。
(2)本发明的化合物毒副作用低，用药安全。
(3)本发明的化合物完全可以通过人工合成的方式生产，成本低廉。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室指南(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
I.材料和方法
除非另外说明，所用的试剂购自GL Biochem(上海)公司。
1.化合物的制备
化合物制备的概要流程见图1，方法描述如下：
制备6-APA-Na-棉酮(化合物7)
取39毫克6-APA(6-氨基青霉素烷酸)，氢氧化钠10毫克，0摄氏度下溶于6毫升甲醇和异丙醇[1∶1(v/v)]中，检测PH接近6时，加入棉酮48毫克，室温保持5小时，抽滤，异丙醇淋洗，干燥得到64毫克化合物7。
Figure BSA00000174609600101
化合物7
1H NMR(300MHz，CD3OD)δ9.54(s，2H)，9.53(s，2H)，5.65(d，J＝6Hz，2H)，，5.66(d，J＝5.7Hz，2H)，5.44-5.46(m，4H)，4.28(br s，OH)，4.25(brs，OH)，3.99(m，4H)，1.96(s，6H)，1.98(s，6H)，1.66(s，6H)，1.66(s，6H)，1.59(s，12H)，1.44(d，J＝6.9Hz，12H)，1.43(d，J＝7.2Hz，12H)；13C NMR(75MHz，CDCl3)δ187.3，187.3，185.4，185.3，172.8，171.2，171.1，167.4，167.2，161.8，161.5，151.7，151.6，145.9，145.8，138.3，138.3，135.4，135.4，126.6，126.5，125.8，125.7，110.2，73.3，70.7，70.5，66.8，66.7，64.5，63.4，31.2，28.3，26.3，23.9，19.3，19.1，19.0，13.4，13.2.Anal.Calcd forC46H44N4Na2O14S2.3CH3OH/H2O：C，51.75；H，5.50；N，4.93.Found：C，51.23；H，5.06；N，4.87.
制备L-苯丙氨酸钠-消旋棉酚(化合物3)
取氢氧化钠8毫克，溶于6毫升甲醇和异丙醇[1∶5(v/v)]全溶后，加入L-苯丙氨酸33毫克，反应液加热至60摄氏度0.5小时，当PH为8后，加入消旋棉酚52毫克，反应液保持在65-70摄氏度3小时，得到黄色沉淀，过滤沉淀，异丙醇淋洗，干燥后得到55毫克化合物3。
Figure BSA00000174609600111
化合物3
1H NMR(300MHz，CD3OD)δ9.45(s，2H)，9.26(s，2H)，7.50(s，2H)，7.49(s，2H)，7.23-7.00(m，20H)，4.19(dd，J＝9.3，3.6Hz，2H)，4.13(dd，J＝9.3，3.6Hz，2H)，3.74(m，4H)，3.39(dd，J＝13.5，3.6Hz，4H)，3.07(dd，J＝13.5，9.3Hz，2H)，2.97(dd，J＝13.5，9.3Hz，2H)，1.95(s，12H)，1.51(d，J＝6.3Hz，12H)，1.49(d，J＝6.9Hz，12H)；13C NMR(75MHz，CDCl3)δ175.2，175.2，172.0，171.9，161.5，149.5，149.4，146.9，137.2，131.5，131.4，129.4，129.3，129.1，128.5，128.2，128.2，128.0，128.0，127.2，127.2，126.3，126.3，117.5，117.4，116.8，116.7，115.4，103.5，103.4，67.2，67.1，63.4，40.9，40.5，27.2，23.9，19.4，19.1，19.0.
制备2-氨基2吲哚-乙酸甲酯-(-)棉酚(化合物4)
取2-氨基2吲哚-乙酸甲酯41毫克，室温下溶于甲醇后，加入(-)棉酚52毫克，之后反应液加热至50-54摄氏度，2-3小时后，抽滤得到62毫克化合物4。
Figure BSA00000174609600121
化合物4
1H NMR(300MHz，CDCl3)δ9.64(d，J＝7.8Hz，1H)，9.60(d，J＝7.5Hz，1H)，8.30(br s，OH)，7.95(br s，NH)，7.64(m，2H)，7.52(s，2H)，7.08-7.36(m，6H)，5.53(m，1H)，5.55(m，1H)，5.37(br s，OH)，5.32(br s，OH)，3.76(s，3H)，3.78(s，3H)，3.66(m，2H)，1.99(s，3H)，2.02(s，3H)，1.50(d，J＝6.6Hz，12H)；13C NMR(75MHz，CDCl3)δ173.5，170.2，161.2，149.1，147.1，136.4，132.2，129.1，128.0，128.0，125.0，124.1，123.0，120.7，118.8，118.2，116.0，114.6，111.7，104.0，58.8，58.7，53.1，27.5，20.3，20.3，20.0.
制备(Rg，S，S)2-氨基-3甲氧基-3-(4-对硝基)丙醇-(-)棉酚(化合物5)
取(S，S)2-氨基-3甲氧基-3-(4-对硝基)丙醇39毫克，氢氧化钠6毫克，室温下溶于5毫升无水甲醇中，检测PH为8后，加入(-)棉酚39毫克，反应液保持在50-54摄氏度5小时，抽干溶剂用石油醚/丙酮(4∶1)重结晶得到36毫克化合物5。
化合物5
ESI-MS[M-H]-：933.3；1H NMR(300MHz，CDCl3)δ13.45(m，NH)，9.31(d，J＝9Hz，2H)，8.17(d，J＝7.8Hz，4H)，7.93(br s，OH)，7.54(s，2H)，7.49(d，J＝7.8Hz，4H)，5.36(br s，OH)，4.62(br s，OH)，3.86(m，2H)，3.73(m，4H)，3.44(m，2H)，3.31(s，6H)，2.00(s，6H)，1.49(d，J＝7.8Hz，12H)；13C NMR(75MHz，CDCl3)δ172.9，163.4，149.5，147.8，146.6，146.0，131.9，128.2，128.0，127.9，127.9，123.3，123.3，117.8，117.1，115.1，103.6，81.0，68.1，61.5，56.8，27.2，19.4，19.4，18.8.
制备6-APA-K-(+)棉酚(化合物6)
取43毫克6-APA，氢氧化钾11毫克，0摄氏度下溶于6毫升甲醇和异丙醇[1∶1(v/v)]中，检测PH接近6时，加入(+)棉酚52毫克，室温保持5小时，有黄色沉淀，抽滤，异丙醇淋洗，干燥得到黄色粉末42毫克化合物6。
Figure BSA00000174609600131
化合物6
1H NMR(300MHz，CD3OD)δ9.86(s，2H)，7.55(s，2H)，5.66(br s，2H)，5.41(br s，2H)，4.30(br s，OH)，3.82(m，2H)，2.03(s，6H)，1.73(s，6H)，1.58(s，6H)，1.44(br d，12H).
制备L-异亮氨酸钠-消旋棉酚(化合物8)
取氢氧化钠9毫克，溶于6毫升甲醇和异丙醇[1∶5(v/v)]全溶后，加入L-异亮氨酸29毫克，反应液加热至60摄氏度0.5小时，当PH为9后，加入消旋棉酚58毫克，反应液保持在65-70摄氏度3小时，得到黄色沉淀，过滤沉淀，异丙醇淋洗，干燥后得到52毫克化合物8。
Figure BSA00000174609600141
化合物8
1H NMR(300MHz，CD3OD)δ9.78(s，2H)，7.54(s，2H)，3.85(d，J＝7.5Hz，2H)，3.77(m，2H)，2.06(m，2H)，2.02(s，6H)，1.65(m，2H)，1.50(brd，12H)，1.24(m，2H)，1.00(2×br d，6H)，0.94(br t，6H)；13C NMR(75MHz，CDCl3)δ175.6，175.5，171.7，161.8，149.7，147.1，131.6，128.2，127.5，127.4，117.9，117.7，117.0，115.8，103.8，63.4，38.9，38.8，27.2，24.1，24.1，19.6，19.2，15.3，15.3，10.8.
制备L-异亮氨酸钠-(+)棉酚(化合物9)
取氢氧化钠13毫克，溶于6毫升甲醇和异丙醇[1∶5(v/v)]全溶后，加入L-异亮氨酸42毫克，反应液加热至60摄氏度0.5小时，当PH为9后，加入(+)棉酚85毫克，反应液保持在65-70摄氏度3小时，得到黄色沉淀，过滤沉淀，异丙醇淋洗，干燥后得到119毫克化合物9。
Figure BSA00000174609600142
化合物9
1H NMR(300MHz，CD3OD)δ9.76(s，2H)，7.53(s，2H)，3.82(d，J＝2.4Hz，2H)，3.75(m，2H)，2.03(m，2H)，2.03(s，6H)，1.50(t，J＝6.9Hz，12H)，1.00(d，J＝6.6Hz，6H)，0.93(t，J＝7.2Hz，6H)；13C NMR(75MHz，CDCl3)δ175.4，171.8，161.8，149.7，147.0，131.7，128.1，127.3，117.8，116.9，115.7，103.7，63.4，38.8，27.2，24.6，24.2，24.0，19.5，19.2，15.3，10.7.
2.细胞培养
小鼠结肠癌细胞系CT26(获自美国ATCC生物资源中心)，乳腺癌细胞系4T1(获自美国ATCC生物资源中心)与黑色素瘤细胞系B16-F10(获自美国ATCC生物资源中心)用RMPI-1640培养基(HyClone，Logan，UT)添加10％胎牛血清(HyClone)，100单位/毫升青霉素和100ug/mL链霉素(Invitrogen，Carlsbad，CA)培养。人结肠癌细胞系HCT116(获自美国ATCC生物资源中心)和SW620(获自美国ATCC生物资源中心)，肺癌细胞系A549(获自美国ATCC生物资源中心)，乳腺癌细胞系MDA-MB-435(获自美国ATCC生物资源中心)和MCF-7(获自美国ATCC生物资源中心)，前列腺癌细胞系PC-3(获自美国ATCC生物资源中心)用DMEM(HyClone)添加10％胎牛血清，青霉素和链霉素在37℃，5％CO2培养箱中培养。
3.细胞活力检测
先将合成的化合物用DMSO溶解。将不同类型肿瘤细胞系以每孔5×103/100μl种于96孔板。贴壁后，加入不同浓度的化合物或联合5-氟尿嘧啶(Wako Pure Chemical Industries，Osaka，Japan)处理72小时，以DMSO为阴性对照。处理结束后，加入3-(4，5-甲基偶氮基)-2，5二苯基四唑盐(MTT，Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)，然后再在37℃避光孵育4小时。产生的晶体用DMSO溶解后于酶标仪上读数。
4.细胞增殖能力检测
CT26细胞以每孔2×103细胞/100μl种于96孔板。加入不同浓度的化合物7处理不同时间后，用Cell Titer 96 Aqueous One Solution Cell Proliferation Kit试剂盒(Promega Corporation，Madison，WI)检测细胞增殖能力。实验具体操作步骤见试剂盒说明书。
5.TUNEL细胞凋亡检测
CT26细胞用不同浓度的化合物7处理不同时间后，用In Situ Cell DeathDetection Kit试剂盒(Roche Applied Science，Mannheim，Germany)检测细胞凋亡程度。细胞用PBS洗两次后，用4％多聚甲醛在室温下固定1小时，用PBS洗两次后，用通透细胞溶液在冰上处理细胞2分钟，再用PBS洗两次后，与凋亡检测反应混合液在37℃避光孵育1小时，细胞核用DAPI染色，最后用PBS洗两次。在荧光显微镜下分析样品，随机选五个视野计数阳性的细胞，统计分析阳性细胞百分比。
6.分子对接模拟
本发明人利用软件AutoDock Vina(http://vina.scripps.edu/)将抗凋亡蛋白Bcl-2(Protein Data Bank code 1YSW)与Bcl-xL(PDB code 1BXL)与化合物7对接。
7.免疫印迹
细胞用化合物7处理后，细胞裂解液用10％SDS-PAGE凝胶电泳，之后转印到硝酸纤维素膜(Amersham Bioscience，Buckinghamshire，UK)上。膜用含5％(w/v)脱脂牛奶和1‰(v/v)吐温-20的TBS溶液室温封闭1小时，然后用抗Bcl-2(Cell Signaling，Beverly，MA)，Bcl-xL(Cell Signaling)和β-actin(Santa CruzBiotechnology，Santa Cruz，CA)的抗体在4℃孵育过夜。TBST洗3次后，用辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗(Jackson ImmunoResearch Laboratories，WestGrove，PA)在室温下孵育1小时，TBST洗3次后，用化学发光底物SuperSignalWest Pico Chemiluminescent Substrate(Pierce Biotechnology，Rockford，IL，USA)显色，实验具体操作步骤见试剂盒说明书。
8.体内抗肿瘤活性检测
6-8周的雄性BALB/c小鼠购自上海实验动物中心，小鼠的饲养依据上海第二医科大学关于实验动物使用的准则。5×105/0.1ml的CT26细胞注入小鼠右侧背部皮下。待肿瘤体积达到约60mm3，将小鼠随机分成不同的组，每组4只。化合物7用10％乙醇溶解。小鼠按10μmol/公斤体重的剂量连续12天经灌胃给予化合物7，以灌胃给予10％乙醇作为对照。5-氟尿嘧啶按10毫克/公斤体重的剂量每两天经腹腔注射给药一次，以腹腔注射PBS作为阴性对照。每2天测定一次肿瘤长度和宽度。肿瘤体积按公式长×宽×宽×0.52来计算。
9.体内毒性检测
化合物7和天然棉酚(化合物1)用10％(v/v)乙醇溶解。6-8周雄性BALB/c小鼠分成3组，每组6只，分别按120μmol/公斤体重的剂量连续12天经灌胃给予化合物7或1，对照组灌给10％乙醇。统计小鼠的生存情况，12天以后称量所有小鼠体重，并做统计分析。取3组小鼠的小肠，用石蜡包埋，5μm切片后做苏木素-伊红染色，并于镜下观察。
10.统计分析
用Student′s t-test检验比较两组数据之间的差异，P值小于0.05被认为差异有统计学意义。
II.实施例
实施例1.细胞活力检测
本发明人首先检测了新合成的化合物(图1，化合物3-9；其中化合物8为光学消旋体，化合物9为正旋光化合物)对不同肿瘤细胞系的杀伤作用。将一些人和小鼠的肿瘤细胞系用不同浓度的化合物处理72小时后，MTT法检测细胞活力。
结果表明，化合物3-9对于肿瘤细胞均具有一定的杀伤效果，特别是化合物7。人和小鼠结肠癌细胞系SW620，HCT116和CT26对化合物7比较敏感，半数致死剂量IC50约为6至18μM(表1)。乳腺癌细胞系MDA-MB-435，MCF-7和4T1对化合物7也有一定敏感性，IC50值超过28μM。化合物7还对小鼠黑色素瘤细胞系B16-F10，人肺癌细胞系A549和前列腺癌细胞系PC-3具有比较明显的杀伤作用(表1)。这些结果表明，化合物7对结肠癌细胞系有显著的杀伤作用。因此，化合物7可作为肿瘤(特别是结肠癌)治疗的候选药物进一步去研究。
表1、细胞增殖活力检测
Figure BSA00000174609600181
为进一步研究化合物7对结肠癌细胞系的杀伤作用是否具有时间和剂量依赖效应，本发明人用不同浓度的化合物7在不同时间点处理CT26细胞，检测细胞的增殖能力。结果表明，20μM化合物7明显抑制CT26细胞的生长(图2A)。在20μM化合物7处理24小时后，大约80％的CT26细胞存活。再处理24小时后，只有约60％的细胞存活；再处理3天后，几乎所有的细胞都已死亡。10μM和5μM化合物7同样可以有效地抑制CT26细胞的生长(图2A)。然而，2μM化合物7对CT26细胞只有轻微的抑制作用，即使在处理120h后，超过90％的细胞仍然存活(图2A)。另外，在同一时间点，高剂量的化合物7对CT26细胞的杀伤作用比低剂量的要强。这些数据表明，化合物7对CT26细胞的杀伤作用具有时间和剂量依赖效应。
实施例2.化合物7诱导CT26细胞凋亡
本发明人用不同浓度的化合物7处理CT26细胞24、48或72小时，通过TUNEL试剂盒检测肿瘤细胞的凋亡率(图2B)。TUNEL统计结果见图2C。
上述结果表明，化合物7可诱导肿瘤细胞凋亡，且诱导肿瘤细胞凋亡具有时间和剂量依赖效应。
实施例3.化合物7通过与Bcl-2和Bcl-xL的BH3结构域结合下调其蛋白表达水平
之前的研究结果表明，棉酚可作为BH3结构域的模拟物来调节Bcl-2家族蛋白的表达。本发明人通过AutoDock Vina软件将化合物7与Bcl-2和Bcl-xL做了模拟对接。对接模型的结果显示，化合物7可以结合到Bcl-2和Bcl-xL的BH3结构域中(图3A)，说明化合物7能结合到Bcl-2和Bcl-xL上。
因此，本发明人用化合物7处理CT26细胞后，检测Bcl-2和Bcl-xL蛋白表达水平的变化。结果表明，5μM和10μM化合物7在处理CT26细胞24小时后，Bcl-2和Bcl-xL蛋白水平有显著下降(图3C)。
上述数据表明，化合物7可以降低CT26细胞中的抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-xL的表达，与分子模拟对接的结果一致。
实施例4.化合物7与5-氟尿嘧啶联用后，增强了其在体外及体内抑制结肠癌生长的活性
根据本发明人之前的研究结果，化合物7具有体外抗肿瘤活性。本发明人给CT26荷瘤小鼠按10μmol/公斤体重的剂量每天经灌胃给予化合物7，12天后，给药组小鼠的肿瘤体积显著小于对照组(P＜0.01)(图4A)。本发明人选择5-氟尿嘧啶(5-FU)与化合物7(图中简写为“7”)联用，研究它们联用后对结肠癌生长的抑制效果。结果表明，10μmol/升化合物7与25μmol/升5-氟尿嘧啶联用后，对CT26细胞的生长抑制明显超过化合物7或5-氟尿嘧啶单独使用的效果(P＜0.01)(图4B)。
因此，本发明人给CT26荷瘤小鼠按10μmol/公斤体重的剂量每天经灌胃给予化合物7，以10％乙醇作为对照；同时，按10毫克/公斤体重的剂量每两天经腹腔注射5-氟尿嘧啶一次，以PBS作为对照。结果表明，12天后，化合物7与5-FU联用组的小鼠肿瘤体积明显小于化合物7或5-FU单用组(P＜0.01)(图4C)。
上述结果表明，化合物7与5-FU联用可以作为新的结肠癌化疗策略。
实施例5.化合物7与天然棉酚(化合物1)的体内毒性比较
之前有文章报道apogossypol按120μmol/公斤体重的剂量处理小鼠后，比等同剂量的天然棉酚毒性小。因此，本发明人按同样的剂量经灌胃给予小鼠化合物7(图中简写为“7”)或化合物1(图中简写为“1”)，对照组灌给10％乙醇，观察小鼠的生存情况与体重变化。
结果显示，由于化合物1在小鼠体内的损伤的积累，在第8天，化合物1处理的小鼠有一只死亡；第12天，第二只小鼠死亡(图5A)。然而，所有的化合物7处理的小鼠在第12天仍然存活。另外，化合物1处理12天后的小鼠体重与处理前相比有显著下降(P＜0.01)，而化合物7处理后的小鼠体重并没有显着下降(图5B)。
而且，化合物1处理的小鼠小肠与对照组相比有明显损伤，但化合物7处理组小鼠与对照组没有明显差别(图5C)。
因此，化合物7比化合物1在体内的毒性小，表明它是一个较为理想的抗肿瘤药物，可用于进一步的临床。
实施例6.各化合物的水溶性实验
测量天然棉酚(化合物1和2)以及各新化合物(化合物3-9)在37℃时在100克水中的溶解度，以比较它们的水溶性情况。
结果发现，化合物7在37℃时在100克水中的溶解度为9.25克，而天然棉酚在同样条件下的溶解度小于0.001克。因此，化合物7的水溶性要明显优于天然棉酚。
化合物3、6以及8-9(均为盐)的水溶性也较好，溶解度大大提高，明显优于天然棉酚。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (13)

1.一种如式I所示结构的化合物、其旋光异构体或其药学上可接受的盐：
Figure FDA0000370136430000011
(I)；
其中，R选自
Figure FDA0000370136430000012
或
Figure FDA0000370136430000013
R1-R4独立地选自OH，H或O。
2.如权利要求1所述的化合物，其特征在于，R选自
Figure FDA0000370136430000014
Figure FDA0000370136430000015
或
Figure FDA0000370136430000016
3.如权利要求1所述的化合物，其特征在于，具有如下所示的结构：
Figure FDA0000370136430000017
其中，R是
Figure FDA0000370136430000018
或
Figure FDA0000370136430000019
4.如权利要求1所述的化合物，其特征在于，具有如下所示的结构：
其中，R选自
Figure FDA0000370136430000022
Figure FDA0000370136430000023
或
Figure FDA0000370136430000024
5.如权利要求4所述的化合物，其特征在于，R选自
Figure FDA0000370136430000026
或
Figure FDA0000370136430000027
6.权利要求1-2或4任一所述的化合物在制备防治肿瘤的药物组合物中的用途，所述的肿瘤包括：结肠癌，乳腺癌，黑色素瘤，肺癌或前列腺癌。
7.权利要求3所述的化合物在制备防治肿瘤的药物组合物中的用途。
8.权利要求1-5任一所述的化合物在制备降低抗凋亡蛋白Bcl-2和/或Bcl-xL的表达的药物中的用途。
9.一种药物组合物，其特征在于，含有：有效量的权利要求1-5任一所述的化合物或其组合；以及药学上可接受的载体。
10.如权利要求9所述的药物组合物，其特征在于，还含有：有效量的5-氟尿嘧啶。
11.一种制备药物组合物的方法，其特征在于，所述方法包括：将有效量的权利要求1-5任一所述的化合物或其组合与药学上可接受的载体混合。
12.如权利要求11所述的方法，其特征在于，还包括：将有效量的5-氟尿嘧啶与权利要求1-3任一所述的化合物或其组合以及药学上可接受的载体混合。
13.一种药盒，其特征在于，含有权利要求1-5任一所述的化合物；或含有权利要求9-10任一所述的药物组合物。
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