CN102301954A

CN102301954A - 一种黑水缬草愈伤组织再生植株的方法

Info

Publication number: CN102301954A
Application number: CN 201110208942
Authority: CN
Inventors: 王振宇; 崔磊; 周秀华; 赵海田
Original assignee: Harbin Institute of Technology
Current assignee: Harbin Institute of Technology
Priority date: 2011-07-25
Filing date: 2011-07-25
Publication date: 2012-01-04
Anticipated expiration: 2031-07-25
Also published as: CN102301954B

Abstract

一种黑水缬草愈伤组织再生植株的方法，它涉及一种黑水缬再生植株的方法。它解决了黑水缬草数量稀少、繁殖周期长、增殖效率低的问题。方法：一、黑水缬草种子处理后经培养获得幼苗；二、幼苗经培养获得无菌苗；三、无菌苗的新生嫩叶剪切后经培养，获得愈伤组织，再进行继代培养获得不定芽；四、将不定芽连同基部的愈伤组织一起切下，经培养获得小植株；五、将小植株从基部切下，然后在激动素中浸泡，经培养后形成完整植株即完成。本发明配方简单，操作工艺简便，培养周期短，扩繁系数大(每1个月增殖7.5～9.5倍)，再生频率高，成本低，有利于大规模生产。

Description

一种黑水缬草愈伤组织再生植株的方法

技术领域

本发明涉及一种黑水缬再生植株的方法。

背景技术

黑水缬草(V.amurensis Smir.ex Kom.)为败酱科(Valerianaceae)缬草属(Valeriana L)野生多年生草本植物。缬草具有广泛的药理活性及悠久的用药历史，其性平味辛，具有镇静安神，解挛止痛的功效，其根茎长期以来一直作为镇静药用于民间，早在明代《本草纲目》中就有记载。在西北欧，由缬草地下部分组成的缬草药物作为镇静剂使用以由来已久，古希腊人古罗马人早就已鉴定出缬草并用之为温和的镇静剂。据不完全统计，目前全世界有25个国家的81种缬草得到程度不同的研究，其中V.officiolis.L已被列入德国、英国、挪威、荷兰、日本药典，在第二版欧洲药品目录中也收录多种缬草制剂(Niels F Muller，RudolfP Dessing1992)。日本的北海缬草V.officinalis var latifolia，印度缬草V.wallichii DC和墨西哥缬草V.edulis Meyer目前仍是药用的商业来源。而目前我国对于缬草资源的开发尚处于起步阶段，仅有少量研究报道，没有相关的任何专利。目前对于缬草资源的开发利用和相关的研究主要还是依赖于野生缬草资源，由于多年来的过度采挖，其赖以生存的森林生态环境遭受到严重的破坏，然而人工栽培很难模拟出野生环境，其培养出的缬草的生长和代谢产物含量无法与野生植株比拟，此外人工栽培大田栽培生产周期长，占地面积大，且生产的植株和产物的品质易受到气候、栽培条件及病虫害的影响，供应难以满足市场的需求。研究非土地培植的缬草培养方法称为当务之急。利用生物技术进行中药资源繁殖并大规模生产其有效成分已成为一条新的发展途径，目前还未见从缬草愈伤组织中获得不定芽的报道，也未见相关再生植株等组织培养的专利申请。

发明内容

本发明的目的是为了解决黑水缬草数量稀少、繁殖周期长、增殖效率低的问题，而提供一种黑水缬草愈伤组织再生植株的方法。

黑水缬草愈伤组织再生植株的方法按以下步骤实现：一、黑水缬草种子经冷冻预处理后进行消毒，然后接种到添加7g/L琼脂的1/2MS培养基上，在温度为24～26℃、湿度为60％～80％、光照强度为3000lux、每天光照16h的条件下培养30～37天，获得幼苗；

二、将长度为2cm的幼苗接种到添加7g/L琼脂的MS培养基上，在温度为24～26℃、湿度为60％～80％、光照强度为3000lux、每天光照16h的条件下培养1～3个月，获得无菌苗；

三、取无菌苗的新生嫩叶剪切成直径1cm的圆片，然后接种到添加2.0mg/L2，4-D、0.15mg/L激动素、30g/L蔗糖和7g/L琼脂的MS培养基上，在温度为24～26℃、湿度为60％～80％、每天光照16h的条件下培养5～28天，获得愈伤组织，再更换新鲜培养基进行继代培养，经过5～6次继代培养后，将愈伤组织转接到MS培养基中，在25℃、60r/min、每10天更换新鲜的MS培养基条件下摇瓶继代培养4周，获得不定芽；

四、将形成的不定芽连同基部的愈伤组织一起切下，然后接种到添加0.5mg/L萘乙酸、1.5mg/L激动素和30g/L蔗糖的MS培养基中，在温度为24～26℃、湿度为60％～80％、每天光照16h的条件下培养4周，获得小植株，长度为4～5cm；

五、将小植株从基部切下，然后在10mg/L激动素中浸泡小植株基部，再接种到添加0.5mg/L萘乙酸、1.5mg/L激动素和30g/L蔗糖的MS培养基中，在温度为24～26℃、湿度为60％～80％、每天光照16h的条件下培养4周形成完整植株，即完成黑水缬草愈伤组织再生植株。

本发明配方简单，操作工艺简便，培养周期短，扩繁系数大(每1个月增殖7.5～9.5倍)，再生频率高，成本低，有利于大规模生产。

本发明中黑水缬草愈伤组织再生植株和野生的植物相比，产生的后代遗传稳定性好，可获得稳定的质量和产量，不受自然条件的限制和影响。

本发明中黑水缬草愈伤组织再生植株的方法不占用耕地面积，只需要占用有限的厂房和培养室。

本发明中黑水缬草愈伤组织再生植株的方法通过人工调节与控制愈伤组织的生长，可进行次生产物的合成。

附图说明

图1为具体实施方式九中所得黑水缬草愈伤组织再生植株的图片。

具体实施方式

具体实施方式一：本实施方式黑水缬草愈伤组织再生植株的方法按以下步骤实现：一、黑水缬草种子经冷冻预处理后进行消毒，然后接种到添加7g/L琼脂的1/2MS培养基上，在温度为24～26℃、湿度为60％～80％、光照强度为3000lux、每天光照16h的条件下培养30～37天，获得幼苗；

本实施方式步骤二中添加7g/L琼脂的MS培养基，pH值为5.6，于121℃、0.1MPa下灭菌15min。

本实施方式步骤三中添加2.0mg/L2，4-D、0.15mg/L激动素、30g/L蔗糖和7g/L琼脂的MS培养基，pH值为5.8，于121℃、0.1MPa下灭菌15min。

本实施方式中1/2MS培养基、MS培养基的成分如表1所示。

表1

具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一的不同是步骤一中冷冻预处理的过程为：将健康饱满的种子用自来水冲洗5遍，用滤纸吸掉表面水分，然后置于培养皿中，于-4℃条件下保存1周。其它步骤及参数与具体实施方式一相同。

本实施方式中冷冻预处理的目的是破除种子休眠。

具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一的不同是步骤一中消毒的过程为：将冷冻预处理后的种子在室温中用无菌水浸泡过夜，在无菌台中用无菌水涮洗5次，然后用灭菌后的滤纸吸干表面水分，将种子包裹于小块无菌纱布中，浸泡在体积浓度为75％的乙醇中浸泡1min，然后无菌水清洗2次，再置于质量浓度为0.1％的HgCl₂中浸泡5min，随后用无菌水清洗5次，用灭菌后的滤纸吸干表面水分。其它步骤及参数与具体实施方式一相同。

具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式一至三之一的不同是步骤一中在温度为25℃、湿度为70％、光照强度为3000lux、每天光照16h的条件下培养35天，获得幼苗。其它步骤及参数与具体实施方式一至三之一相同。

具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式一至四之一的不同是步骤二中在温度为25℃、湿度为70％、光照强度为3000lux、每天光照16h的条件下培养2个月，获得无菌苗。其它步骤及参数与具体实施方式一至四之一相同。

具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式一至五之一的不同是步骤三中在温度为25℃、湿度为65％、每天光照16h的条件下培养7天，获得愈伤组织。其它步骤及参数与具体实施方式一至五之一相同。

具体实施方式七：本实施方式与具体实施方式一至六之一的不同是步骤四中在温度为25℃、湿度为60％、每天光照16h的条件下培养4周，获得小植株。其它步骤及参数与具体实施方式一至六之一相同。

具体实施方式八：本实施方式与具体实施方式一至七之一的不同是步骤五中在温度为24～26℃、湿度为60％～80％、每天光照16h的条件下培养4周形成完整植株。其它步骤及参数与具体实施方式一至七之一相同。

具体实施方式九：本实施方式黑水缬草愈伤组织再生植株的方法按以下步骤实现：一、黑水缬草种子经冷冻预处理后进行消毒，然后接种到添加7g/L琼脂的1/2MS培养基上，在温度为25℃、湿度为70％、光照强度为3000lux、每天光照16h的条件下培养35天，获得幼苗；

二、将长度为2cm的幼苗接种到添加7g/L琼脂的MS培养基上，在温度为25℃、湿度为70％、光照强度为3000lux、每天光照16h的条件下培养2个月，获得无菌苗；

三、取无菌苗的新生嫩叶剪切成直径1cm的圆片，然后接种到添加2.0mg/L2，4-D、0.15mg/L激动素、30g/L蔗糖和7g/L琼脂的MS培养基上，在温度为25℃、湿度为70％、每天光照16h的条件下培养10天，获得愈伤组织，再更换新鲜培养基进行继代培养，经过6次继代培养后，将愈伤组织转接到MS培养基中，在25℃、60r/min、每10天更换新鲜的MS培养基条件下摇瓶继代培养4周，获得不定芽；

四、将形成的不定芽连同基部的愈伤组织一起切下，然后接种到添加0.5mg/L萘乙酸、1.5mg/L激动素和30g/L蔗糖的MS培养基中，在温度为25℃、湿度为70％、每天光照16h的条件下培养4周，获得小植株，长度为4～5cm；

五、将小植株从基部切下，然后在10mg/L激动素中浸泡小植株基部，再接种到添加0.5mg/L萘乙酸、1.5mg/L激动素和30g/L蔗糖的MS培养基中，在温度为25℃、湿度为7％、每天光照16h的条件下培养4周形成完整植株，即完成黑水缬草愈伤组织再生植株。

本实施方式步骤一中黑水缬草种子的来源：2006年七～八月于黑龙江省帽儿山地区采集；从花序中剥得种子。

本实施方式步骤五中形成完整的植株，其中生根率达到96％，所得黑水缬草愈伤组织再生植株，如图1所示。

具体实施方式十：本实施方式黑水缬草愈伤组织再生植株的方法按以下步骤实现：一、黑水缬草种子经冷冻预处理后进行消毒，然后接种到添加7g/L琼脂的1/2MS培养基上，在温度为26℃、湿度为80％、光照强度为3000lux、每天光照16h的条件下培养37天，获得幼苗；

二、将长度为2cm的幼苗接种到添加7g/L琼脂的MS培养基上，在温度为26℃、湿度为80％、光照强度为3000lux、每天光照16h的条件下培养3个月，获得无菌苗；

三、取无菌苗的新生嫩叶剪切成直径1cm的圆片，然后接种到添加2.0mg/L2，4-D、0.15mg/L激动素、30g/L蔗糖和7g/L琼脂的MS培养基上，在温度为26℃、湿度为80％、每天光照16h的条件下培养25天，获得愈伤组织，再更换新鲜培养基进行继代培养，经过6次继代培养后，将愈伤组织转接到MS培养基中，在25℃、60r/min、每10天更换新鲜的MS培养基条件下摇瓶继代培养4周，获得不定芽；

四、将形成的不定芽连同基部的愈伤组织一起切下，然后接种到添加0.5mg/L萘乙酸、1.5mg/L激动素和30g/L蔗糖的MS培养基中，在温度为26℃、湿度为80％、每天光照16h的条件下培养4周，获得小植株，长度为4～5cm；

五、将小植株从基部切下，然后在10mg/L激动素中浸泡小植株基部，再接种到添加0.5mg/L萘乙酸、1.5mg/L激动素和30g/L蔗糖的MS培养基中，在温度为26℃、湿度为80％、每天光照16h的条件下培养4周形成完整植株，即完成黑水缬草愈伤组织再生植株。

本实施方式步骤五中形成完整的植株，其中生根率达到98％。

Claims

1.一种黑水缬草愈伤组织再生植株的方法，其特征在于黑水缬草愈伤组织再生植株的方法按以下步骤实现：一、黑水缬草种子经冷冻预处理后进行消毒，然后接种到添加7g/L琼脂的1/2MS培养基上，在温度为24～26℃、湿度为60％～80％、光照强度为3000lux、每天光照16h的条件下培养30～37天，获得幼苗；

2.根据权利要求1所述的一种黑水缬草愈伤组织再生植株的方法，其特征在于步骤一中冷冻预处理的过程为：将健康饱满的种子用自来水冲洗5遍，用滤纸吸掉表面水分，然后置于培养皿中，于-4℃条件下保存1周。

3.根据权利要求1所述的一种黑水缬草愈伤组织再生植株的方法，其特征在于步骤一中消毒的过程为：将冷冻预处理后的种子在室温中用无菌水浸泡过夜，在无菌台中用无菌水涮洗5次，然后用灭菌后的滤纸吸干表面水分，将种子包裹于小块无菌纱布中，浸泡在体积浓度为75％的乙醇中浸泡1min，然后无菌水清洗2次，再置于质量浓度为0.1％的HgCl₂中浸泡5min，随后用无菌水清洗5次，用灭菌后的滤纸吸干表面水分。

4.根据权利要求1、2或3所述的一种黑水缬草愈伤组织再生植株的方法，其特征在于步骤一中在温度为25℃、湿度为70％、光照强度为3000lux、每天光照16h的条件下培养35天，获得幼苗。

5.根据权利要求4所述的一种黑水缬草愈伤组织再生植株的方法，其特征在于步骤二中在温度为25℃、湿度为70％、光照强度为3000lux、每天光照16h的条件下培养2个月，获得无菌苗。

6.根据权利要求5所述的一种黑水缬草愈伤组织再生植株的方法，其特征在于步骤三中在温度为25℃、湿度为65％、每天光照16h的条件下培养7天，获得愈伤组织。

7.根据权利要求6所述的一种黑水缬草愈伤组织再生植株的方法，其特征在于步骤四中在温度为25℃、湿度为60％、每天光照16h的条件下培养4周，获得小植株。

8.根据权利要求7所述的一种黑水缬草愈伤组织再生植株的方法，其特征在于步骤五中在温度为24～26℃、湿度为60％～80％、每天光照16h的条件下培养4周形成完整植株。