CN104304004B - 一种北缬草组织培养繁殖方法 - Google Patents

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Abstract

本发明旨在提供一种北缬草(Valeriana fauriei Briq.)组织培养繁殖方法。具体如下：一、用北缬草幼嫩的茎段作外植体，进行无菌处理；二、取无菌的北缬草的茎段置于固体培养基上诱导出不定芽；三、诱导出的不定芽接种到固体培养基上进行生根和壮苗；四、组培苗移栽至培养基质中炼苗培育。本发明不受自然条件的限制和影响，具有快速和易规模化的特点。本发明可以缓解野生北缬草资源紧缺和过度采挖破坏生态平衡的问题。

Description

一种北缬草组织培养繁殖方法
技术领域
本发明属于植物组织培养繁殖技术领域，具体地，涉及败酱科缬草属药用植物北缬草(Valeriana fauriei Briq.)组织培养繁殖方法。
背景技术
北缬草(Valeriana fauriei Briq.)为败酱科Valerianaceae缬草属(Valeriana)野生多年生草本植物。缬草性平味辛，具有镇静安神、解痉止痛的功效，根茎被作为镇静药应用已有上千年。北缬草为缬草属植物中的代表，分布于东北地区(黑龙江、吉林、辽宁)和华东地区(江苏、安徽、浙江、江西、台湾)，并西向河南、陕西等地延伸。北缬草生于海拔2000m以下的山坡草甸、林间湿地、林缘路旁。目前，北缬草的药理作用、化学成分已得到不同程度的研究。有关北缬草专利产品的报导日益增多，该植物的药用价值已受到高度重视。我国大兴安岭地区野生北缬草资源较丰富，但过度开发利用对资源及环境造成破坏。而目前我国对于北缬草资源保护的研究尚处于起步阶段，仅少量研究报道。
在我国，对于北缬草的获取主要还是依赖于野生北缬草资源。然而，野生北缬草种子多数不育，自然发芽率较低，人工变温处理催芽，发芽率最高仅为50％。此外北缬草种子细小，人工收集费时费力，且大田栽培生产周期较长，占用耕地，易受气候、病虫害的影响。利用根茎移栽虽成活率高，但繁殖系数低，在大规模栽培种不适用。利用生物技术进行中药资源快速繁殖并实现大规模生产已成为一个新的发展方向。目前，对于缬草属植物的组培研究还很少，有利用子叶无菌条件下诱导芽簇的报道，同时，仅从V.officinalis叶片中诱导获得不定根，还未有对北缬草进行快速繁殖的研究报道。
发明内容
本发明旨在缓解野生北缬草资源紧缺和过度采挖破坏生态平衡的问题，提供一种北缬草组织培养繁殖方法。该方法能加快北缬草的繁殖速度，有利于扩大生产规模。
本发明的目的是通过以下技术措施来实现的：一种北缬草(Valeriana fauriei Briq.)组织培养繁殖方法，包括以下步骤：
(1)外植体诱导：取北缬草幼嫩的茎段作为外植体，进行无菌处理，接种于启动培养基培养至获得不定芽；
(2)继代增殖培养：将步骤(1)中形成的不定芽在无菌条件下切下，接种至增殖培养基上进行增殖，得到丛生芽；
(3)生根培养：将步骤(2)所得丛生芽在无菌条件下分离并接种至生根培养基中进行根诱导和壮苗，得到完整的组培苗；
(4)组培苗移栽：将步骤(3)中的健壮的组培苗加入少量无菌水，半开盖培养5～10天，再全开盖培养5～10天；将组培苗从培养瓶中取出，洗净根部培养基，栽入由蛭石和营养土按1∶1～1∶3的比例混合成的培养基质中炼苗培育成健壮的幼苗；
其中，步骤(1)中外植体除菌处理的方法为：用自来水冲洗15～25min，用60～80％乙醇消毒30～90s，用0.5～1.5％次氯酸钠溶液消毒10～20min后取出，用无菌水冲洗3～5次，用灭菌后的滤纸吸干表面水分，得到无菌北缬草外植体。
其中，步骤(1)中启动培养基为0.2～1.0mg/L 6-BA、0.01～0.02mg/L IBA和8g/I琼脂的pH为5.8的MS培养基；
其中，步骤(2)中增殖培养基为0.2～1.0mg/L 6-BA、0.01～0.02mg/L IBA和8g/L琼脂的pH为5.8的MS培养基；
其中，步骤(3)中培养基为0.1～0.5mg/L IBA和8g/L琼脂的pH为5.8的1/2MS培养基。
优选地，上述方法还包括步骤(1)、步骤(2)与步骤(3)中培养条件：2～5％蔗糖、8g/L琼脂，pH5～6，培养温度为20～30℃，光照时间12～20h·d-1，光照2500～4000lux。
更优选地，上述方法还包括步骤(1)、步骤(2)与步骤(3)中培养条件：3～4％蔗糖、8g/L琼脂，pH5.5～6，培养温度为24～26℃，光照时间15～18h·d-1，光照3000lux。
更优选地，一种北缬草的组织培养繁殖方法，包括以下步骤：
(1)外植体诱导：将幼嫩的茎段用自来水冲洗20min，用70％乙醇消毒1min，用1％次氯酸钠溶液消毒15min后取出，用无菌水冲洗3～5次，接种于培养基上培养，置于光照3000lux，光照时间16h·d-1，温度为25±1℃下培养；
(2)继代增殖培养：将步骤(1)中形成的不定芽在无菌条件下切下，接种在增殖培养基上进行增殖，得到继代增殖的丛生芽；
(3)生根培养：将步骤(2)所得丛生芽在无菌条件下分离并接种至生根培养基中进行根诱导和壮苗，得到完整的组培苗；
(4)组培苗移栽：将步骤(3)中的健壮的组培苗加入少量无菌水，半开盖培养1周，再全开盖培养1周；将组培苗从培养瓶中取出，洗净根部培养基，栽入由蛭石和营养土按1∶1的比例混合成的培养基质中炼苗培育成健壮的幼苗；移栽培养期间注意保持生长环境湿度、适度遮阴、保温；生长适温22～28℃，夜温20～22℃；
其中，步骤(1)中启动培养基为1.0mg/L 6-BA、0.02mg/L IBA和8g/L琼脂的pH为5.8的MS培养基或0.5mg/L 6-BA、0.01mg/L IBA和8g/L琼脂的pH为5.8的MS培养基或0.2mg/L 6-BA、0.01mg/L IBA和8g/L琼脂的pH为5.8的MS培养基；
其中，步骤(2)中增殖培养基为1.0mg/L 6-BA、0.02mg/L IBA和8g/L琼脂的pH为5.8的MS培养基；
其中，步骤(3)中培养基为0.1mg/L IBA和8g/L琼脂的pH为5.8的1/2MS培养基；
其中，步骤(1)、步骤(2)与步骤(3)中培养基均加入3％蔗糖、8g/L琼脂，pH 5.8，培养温度为(25±1)℃，光照时间16h·d-1，光照3000lux。
本发明的优点：本发明利用组织培养方法得到完整的北缬草组培苗，其具有成本低、繁殖速度快的特点。发明中所用培养器皿均为塑料或玻璃制品，可重复回收利用，卫生环保；发明成本低，仅用MS培养基及植物激素即可；北缬草不定芽诱导仅用2周，继代增殖速度快，4周即可获得丛生芽，增殖3倍，生根培养容易，仅用2周即可得到粗壮的根系；发明体系稳定，不定芽诱导率高，苗成活率高。同时本发明的方法不占用耕地，不受自然条件的限制和约束，易规模化。
附图说明
图1所示为北缬草外植体照片。
图2所示为北缬草不定芽诱导培养2周后照片。
图3所示为北缬草不定芽诱导培养3周后照片。
图4所示为北缬草不定芽诱导培养4周后照片。
图5所示为北缬草不定芽继代增殖培养4周后照片。
图6所示为北缬草芽生根培养2周后照片。
图7所示为北缬草组培苗半开盖培养照片。
图8所示为北缬草组培苗全开盖培养照片。
图9所示为北缬草组培苗移栽培养4周后照片。
图10所示为北缬草组织培养情况。
具体实施方式
下面结合具体的实施例对本发明作进一步说明，而并非对发明的限定，依照本领域公知的现有技术，本发明的实施方式并不限于此，因此凡依照本公开内容所做出的本领域的等同替换，均属于本发明的保护范围。
实施例1
1.材料：
试验材料即组织培养外植体为北缬草植株幼嫩的茎段。
2.实验步骤：
(1)外植体诱导：将幼嫩的茎段用自来水冲洗20min，用70％乙醇消毒1min，用1％次氯酸钠溶液消毒15min后取出，用无菌水冲洗4次，接种于1.0mg/L 6-BA、0.02mg/L IBA的MS培养基上培养，培养基均加入3％蔗糖、8g/L琼脂，pH 5.8，培养温度为25℃，光照时间16h·d-1，光照3000lux；
(2)继代增殖培养：将步骤(1)中形成的不定芽在无菌条件下切下，接种于1.0mg/L6-BA、0.02mg/L IBA和8g/L琼脂的pH为5.8的MS增殖培养基上进行增殖实验，得到继代增殖的丛生芽，培养基加入3％蔗糖、8g/L琼脂，pH 5.8，培养温度为25℃，光照时间16h·d-1，光照3000lux；
(3)生根培养：将步骤(2)所得丛生芽在无菌条件下分离并接种至0.01mg/L IBA的生根培养基中进行根诱导和壮苗，培养基加入3％蔗糖、8g/L琼脂，pH 5.8，培养温度为25℃，光照时间16h·d-1，光照3000lux，得到完整的组培苗；
(4)组培苗移栽：将步骤(3)中的健壮的组培苗加入少量无菌水，半开盖培养1周，再全开盖培养1周；将组培苗从培养瓶中取出，洗净根部培养基，栽入由蛭石和营养土按1∶1的比例混合成的培养基质中炼苗培育成健壮的幼苗；移栽培养期间注意保持生长环境湿度、适度遮阴、保温；生长适温22～28℃，夜温20～22℃；
3.实验结果：
(1)外植体诱导实验结果
以茎段为外植体(图1)，在1.0mg/L 6-BA、0.02mg/L IBA和8g/L琼脂的pH为5.8的MS培养基中培养1周后，组织开始膨胀，状态良好，出现芽分化迹象；培养2周后(图2)，就有小芽从生长点长出，生长状态良好，生长旺盛，每段外植体可以长2个不定芽；培养3周后，芽可生长至1cm(图3)；培养4周后，芽已生长至3-4cm(图4)。
上述结果表明利用北缬草外植体进行不定芽诱导，诱导率高，培养时间短，不定芽生长状态良好，具有很好的可行性。
(2)继代增殖培养实验结果
在1.0mg/L 6-BA、0.02mg/L IBA和8g/L琼脂的pH为5.8的MS培养基中，不定芽生长状况良好，培养1周后，小芽明显增大；培养2周后，就有小芽从生长点长出；培养4周后即可得到生长旺盛的丛生芽(图5)，增殖倍数为3倍。
上述结果表明，利用北缬草不定芽进行继代增殖，增殖速度快，仅4周可增殖3倍，不定芽状态保持良好，体系稳定，具有良好的可行性。
(3)生根培养实验结果
在0.01mg/L IBA的生根培养基中培养1周后就有根长出，培养2周后(图7)根长度可达3cm，且生长旺盛。
上述结果表明，利用北缬草丛生芽进行生根诱导，生根速度快，仅2周即可获得粗壮的根系，体系稳定，具有良好的可行性。
实施例2
1.材料：
试验材料即组织培养外植体为北缬草植株幼嫩的茎段。
2.实验步骤：
(1)外植体诱导：将幼嫩的茎段用自来水冲洗15min，用60％乙醇消毒30s，用0.5％次氯酸钠溶液消毒10min后取出，用无菌水冲洗3次，接种于0.5mg/L 6-BA、0.01mg/L IBA的MS培养基上培养，培养基均加入2％蔗糖、8g/L琼脂，pH 5.0，培养温度为20℃，光照时间12h·d-1，光照2500lux；
(2)继代增殖培养：将步骤(1)中形成的不定芽在无菌条件下切下，接种于0.5mg/L6-BA、0.01mg/L IBA和8g/L琼脂的pH为5.8的MS增殖培养基上进行增殖实验，得到继代增殖的丛生芽，培养基均加入2％蔗糖、8g/L琼脂，pH 5.0，培养温度为20℃，光照时间12h·d-1，光照2500lux；
(3)生根培养：将步骤(2)所得丛生芽在无菌条件下分离并接种至0.01mg/L IBA的生根培养基中进行根诱导和壮苗，培养基均加入2％蔗糖、8g/L琼脂，pH 5.0，培养温度为20℃，光照时间12h·d-1，光照2500lux，得到完整的组培苗；
(4)组培苗移栽：将步骤(3)中的健壮的组培苗加入少量无菌水，半开盖培养5天，再全开盖培养5天；将组培苗从培养瓶中取出，洗净根部培养基，栽入由蛭石和营养土按1∶1的比例混合成的培养基质中炼苗培育成健壮的幼苗；移栽培养期间注意保持生长环境湿度、适度遮阴、保温；生长适温22～28℃，夜温20～22℃；
3.实验结果：
(1)外植体诱导实验结果
以茎段为外植体，在0.5mg/L 6-BA、0.01mg/L IBA和8g/L琼脂的pH为5.8的MS培养基中培养1周后，组织开始膨胀，状态良好，出现芽分化迹象；培养2周后，就有小芽从生长点长出，生长状态良好，生长旺盛，每段外植体可以长2个不定芽；培养3周后，芽可生长至1cm；培养4周后，芽已生长至3-4cm。
上述结果表明利用北缬草外植体进行不定芽诱导，诱导率高，培养时间短，不定芽生长状态良好，具有很好的可行性。
(2)继代增殖培养实验结果
在0.5mg/L 6-BA、0.01mg/L IBA和8g/L琼脂的pH为5.8的MS培养基中，不定芽生长状况良好，培养1周后，小芽明显增大；培养2周后，就有小芽从生长点长出；培养4周后即可得到生长旺盛的丛生芽，增殖倍数为3倍。
上述结果表明，利用北缬草不定芽进行继代增殖，增殖速度快，仅4周可增殖3倍，不定芽状态保持良好，体系稳定，具有良好的可行性。
(3)生根培养实验结果
在0.01mg/L IBA的生根培养基中培养1周后就有根长出，培养2周后根长度可达3cm，且生长旺盛。
上述结果表明，利用北缬草丛生芽进行生根诱导，生根速度快，仅2周即可获得粗壮的根系，体系稳定，具有良好的可行性。
实施例3
1.材料：
试验材料即组织培养外植体为北缬草植株幼嫩的茎段。
2.实验步骤：
(1)外植体诱导：将幼嫩的茎段用自来水冲洗25min，用80％乙醇消毒90s，用1.5％次氯酸钠溶液消毒20min后取出，用无菌水冲洗5次，接种于0.2mg/L 6-BA、0.01mg/L IBA的MS培养基上培养，培养基均加入5％蔗糖、8g/L琼脂，pH 6，培养温度为30℃，光照时间20h·d-1，光照4000lux；
(2)继代增殖培养：将步骤(1)中形成的不定芽在无菌条件下切下，接种于0.2mg/L6-BA、0.01mg/L IBA和8g/L琼脂的pH为5.8的MS增殖培养基上进行增殖实验，得到继代增殖的丛生芽，培养基均加入5％蔗糖、8g/L琼脂，pH 6，培养温度为30℃，光照时间20h·d-1，光照4000lux；
(3)生根培养：将步骤(2)所得丛生芽在无菌条件下分离并接种至0.5mg/L IBA的生根培养基中进行根诱导和壮苗，培养基均加入5％蔗糖、8g/L琼脂，pH 6，培养温度为30℃，光照时间20h·d-1，光照4000lux，得到完整的组培苗；
(4)组培苗移栽：将步骤(3)中的健壮的组培苗加入少量无菌水，半开盖培养10天，再全开盖培养10天；将组培苗从培养瓶中取出，洗净根部培养基，栽入由蛭石和营养土按1∶3的比例混合成的培养基质中炼苗培育成健壮的幼苗；移栽培养期间注意保持生长环境湿度、适度遮阴、保温；生长适温22～28℃，夜温20～22℃；
3.实验结果：
(1)外植体诱导实验结果
以茎段为外植体，在0.2mg/L 6-BA、0.01mg/L IBA和8g/L琼脂的pH为5.8的MS培养基中培养1周后，组织开始膨胀，状态良好，出现芽分化迹象；培养2周后，就有小芽从生长点长出，生长状态良好，生长旺盛，每段外植体可以长2个不定芽；培养3周后，芽可生长至1cm；培养4周后，芽已生长至3-4cm。
上述结果表明利用北缬草外植体进行不定芽诱导，诱导率高，培养时间短，不定芽生长状态良好，具有很好的可行性。
(2)继代增殖培养实验结果
在0.2mg/L 6-BA、0.01mg/L IBA和8g/L琼脂的pH为5.8的MS培养基中，不定芽生长状况良好，培养1周后，小芽明显增大；培养2周后，就有小芽从生长点长出；培养4周后即可得到生长旺盛的丛生芽，增殖倍数为3倍。
上述结果表明，利用北缬草不定芽进行继代增殖，增殖速度快，仅4周可增殖3倍，不定芽状态保持良好，体系稳定，具有良好的可行性。
(3)生根培养实验结果
在0.5mg/L IBA的生根培养基中培养2周后就有根长出，培养4周后根长度可达4cm，且生长旺盛。
上述结果表明，利用北缬草丛生芽进行生根诱导，生根速度快，仅4周即可获得粗壮的根系，体系稳定，具有良好的可行性。

Claims (4)

1.一种北缬草(Valeriana fauriei Briq.)组织培养繁殖方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)外植体诱导：取北缬草幼嫩的茎段作为外植体，进行无菌处理，接种于启动培养基培养至获得不定芽；
(2)继代增殖培养：将步骤(1)中形成的不定芽在无菌条件下切下，接种至增殖培养基上进行增殖，得到丛生芽；
(3)生根培养：将步骤(2)所得丛生芽在无菌条件下分离并接种至生根培养基中进行根诱导和壮苗，得到完整的组培苗；
(4)组培苗移栽：将步骤(3)中的健壮的组培苗加入少量无菌水，半开盖培养5～10天，再全开盖培养5～10天；将组培苗从培养瓶中取出，洗净根部培养基，栽入由蛭石和营养土按1∶1～1∶3的比例混合成的培养基质中炼苗培育成健壮的幼苗；
其中，步骤(1)对外植体进行除菌处理的方法为：用自来水冲洗15～25min，用60～80％乙醇消毒30～90s，用0.5～1.5％次氯酸钠溶液消毒10～20min后取出，用无菌水冲洗3～5次，用灭菌后的滤纸吸干表面水分，得到无菌北缬草外植体 ；
其中，步骤(1)中启动培养基为0.2～1.0mg/L 6-BA、0.01～0.02mg/L IBA和8g/L琼脂的pH为5.8的MS培养基；
其中，步骤(2)中增殖培养基为0.2～1.0mg/L 6-BA、0.01～0.02mg/L IBA和8g/L琼脂的pH为5.8的MS培养基；
其中，步骤(3)中培养基为0.1～0.5mg/L IBA和8g/L琼脂的pH为5.8的1/2MS培养基。
2.如权利要求1所述北缬草组织培养繁殖方法，其特征在于步骤(1)、步骤(2)与步骤(3)中培养条件：2～5％蔗糖、8g/L琼脂，pH5～6，培养温度为20～30℃，光照时间12～20h·d-1，光照2500～4000lux。
3.如权利要求1所述北缬草组织培养繁殖方法，其特征在于：3～4％蔗糖、8g/L琼脂，pH5.5～6，培养温度为24～26℃，光照时间15～18h·d-1，光照3000lux。
4.如权利要求1所述北缬草组织培养繁殖方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)外植体诱导：将幼嫩的茎段用自来水冲洗20min，用70％乙醇消毒1min，用1％次氯酸钠溶液消毒15min后取出，用无菌水冲洗4次，接种于培养基上培养，置于光照3000lux，光照时间16h·d-1，温度为25±1℃下培养；
(2)继代增殖培养：将步骤(1)中形成的不定芽在无菌条件下切下，接种在增殖培养基上进行增殖实验，得到继代增殖的丛生芽；
(3)生根培养：将步骤(2)所得丛生芽在无菌条件下分离并接种至生根培养基中进行根诱导和壮苗，得到完整的组培苗；
(4)组培苗移栽：将步骤(3)中的健壮的组培苗加入少量无菌水，半开盖培养1周，再全开盖培养1周；将组培苗从培养瓶中取出，洗净根部培养基，栽入由蛭石和营养土按1∶1的比例混合成的培养基质中炼苗培育成健壮的幼苗；移栽培养期间注意保持生长环境湿度、适度遮阴、保温；生长适温22～28℃，夜温20～22℃；
其中，步骤(1)中启动培养基为1.0mg/L 6-BA、0.02mg/L IBA和8g/L琼脂的pH为5.8的MS培养基或0.5mg/L 6-BA、0.01mg/L IBA和8g/L琼脂的pH为5.8的MS培养基或0.2mg/L 6-BA、0.01mg/L IBA和8g/L琼脂的pH为5.8的MS培养基；
其中，步骤(2)中增殖培养基为1.0mg/L 6-BA、0.02mg/L IBA和8g/L琼脂的pH为5.8的MS培养基；
其中，步骤(3)中培养基为0.1mg/L IBA和8g/L琼脂的pH为5.8的1/2MS培养基；
其中，步骤(1)、步骤(2)与步骤(3)中培养基均加入3％蔗糖、8g/L琼脂，pH5.8，培养温度为(25±1)℃，光照时间16h·d-1，光照3000lux。
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