CN105993958B - 一种鸭儿芹的组织培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种鸭儿芹的组织培养方法。现有技术中的鸭儿芹的组织培养，存在侧芽诱导率低、愈伤组织不能继续分化产生不定芽的问题，无法进行鸭儿芹的大量繁殖。一种鸭儿芹的组织培养方法，包括以下步骤：(1)外植体消毒处理；(2)愈伤组织诱导；(3)分化培养；(4)生根培养；(5)炼苗和移栽。本发明的方法用于鸭儿芹组织培养，克服其种子休眠期长、发芽率低等缺点，具有繁殖速度快、繁殖系数大，繁殖后代整齐一致，移栽成活率高的优点。可达到规模化生产的要求，而且能有效保持母本的优良遗传性状，保证了种苗的品质和质量。
Description
技术领域
本发明涉及一种鸭儿芹的繁育方法，特别地涉及一种鸭儿芹的组织培养方法，属于农业栽培技术领域。
背景技术
鸭儿芹(Cryptotaenia japonica Hassk.f.japonica)属伞形科，鸭儿芹属，为多年生草本。通常生于海拔200-2400米的山地、山沟及林下较阴湿的地区。我国南北各省(区)均有分布，朝鲜和日本也有。
鸭儿芹可全草入药，治虚弱，尿闭及肿毒等，民间有用全草捣烂外敷治蛇咬伤。种子含油约22％，可用于制肥皂和油漆。鸭儿芹是日本重要的栽培蔬菜之一。主要食用柔嫩的茎叶，有特殊的风味，主要用作汤料或做成“色拉”菜生食。因其易于生长，耐阴湿环境，也可作地被植物，应用于园艺造景中的角落、林下等荫蔽环境。因此，鸭儿芹无论对调剂市场蔬菜品种，对有机蔬菜的生产和创汇型农业的开发，还是丰富园林造景中地被植物的栽培种类，都具有十分重要的意义。
目前关于鸭儿芹的研究极少，国内的研究领域主要涉及一些特性的简单描述，以及种子萌发和栽培技术的研究。鸭儿芹休眠期长、种子萌发慢、发芽率普遍较低，采用常规的种子繁殖方法速度慢。国内仅有一篇文献涉及到鸭儿芹种子休眠破除的方法，但从种子处理到发芽仍需要较长的时间(35～50天)，并未加快种子发芽速度。组织培养技术具有繁殖速度快、繁殖系数大，繁殖后代整齐一致，能保持原有品种的优良性状，不受季节的限制等优点，目前国内对鸭儿芹的组织培养研究仅有一篇报道，并且存在侧芽诱导率低、愈伤组织不能继续分化产生不定芽的问题，无法进行鸭儿芹的大量繁殖。
授权公告号为CN 103988667B，授权公告日为2016年3月23日的中国授权发明专利中，公开了一种鸭儿芹引种栽培方法，该发明能使鸭儿芹发芽快，发芽率高，用该发明的栽培方法能实现鸭儿芹周年生产和高产。但是，这种鸭儿芹的引种栽培方法，所需的时间较长，且种子的发芽率较低，并不适合大量繁殖。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中存在的上述不足，而提供一种繁殖系数提高，适合大量繁殖的的鸭儿芹的组织培养方法。
本发明解决上述问题所采用的技术方案是：该一种鸭儿芹的组织培养方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)外植体消毒处理：选取生长良好的鸭儿芹一年生嫩茎，依次用洗衣粉浸泡10min，自来水冲洗3h，用75％乙醇灭菌20～40s，无菌水冲洗3～5次，再用质量浓度为1.5～3.5％的NaClO灭菌5～10min，无菌水冲洗3～5次后，用灭菌滤纸吸干表面水分，最后将消毒处理后的鸭儿芹置于无菌干净的培养皿中备用；
(2)愈伤组织诱导：将步骤(1)中消毒好的鸭儿芹嫩茎切成约1cm的小段，竖直插入诱导培养基中，进行暗培养30天，温度23～25℃；
(3)分化培养：将步骤(2)中产生的愈伤组织接入分化培养基中培养6周，温度23～25℃，光照12h/d，光照度为2000～2400lx；
(4)生根培养：将步骤(3)中产生的丛生芽切成单株，接入生根培养基中培养，温度23～25℃，光照12h/d，光照度为2000～2400lx，2周后，基部长出根系，长度达到2～5cm；
(5)炼苗和移栽：将步骤(4)中高度大于4cm，叶片在4～6片，根系长度2～5cm的鸭儿芹组培苗进行炼苗，先将培养瓶的瓶盖打开，室温下炼苗3d后，取出试管苗，洗净根部的培养基，移栽到准备好的基质上，保持温度不低于10℃，不高于30℃，湿度85％～95％，适当遮阴，常规管理。
本发明所述步骤(2)中的诱导培养基为MS培养基，所述培养基内加入0.5～1.0mg/L的2，4-二氯苯氧乙酸、30g/L的蔗糖和7g/L的琼脂粉，调节pH为5.8。
本发明所述步骤(3)中的分化培养基为MS培养基，所述培养基内加入1.5～2.0mg/L的6-苄基腺嘌呤、0.1～0.2mg/L的萘乙酸、30g/L的蔗糖和7g/L的琼脂粉，调节pH为5.8。
本发明所述步骤(4)中的生根培养基为1/2MS培养基，所述培养基内加入0.5～1.5mg/L吲哚丁酸、30g/L蔗糖和7g/L琼脂粉，调节pH为5.8。
本发明的优点为：本发明的方法用于鸭儿芹组织培养，克服其种子休眠期长、发芽率低等缺点，具有繁殖速度快，繁殖系数大，繁殖后代整齐一致，移栽成活率高的优点。可达到规模化生产的要求，而且能有效保持母本的优良遗传性状，保证了种苗的品质和质量。
具体优点为：
1、通过在诱导培养基中加入0.5～1.0mg/L的2，4-二氯苯氧乙酸，可改善愈伤组织的诱导情况，愈伤组织较多；
2、通过在分化培养基中加入1.5～2.0mg/L的6-苄基腺嘌呤和0.1～0.2mg/L的萘乙酸，可产生较多的丛生芽，提高产率；
3、生根培养基选用1/2MS培养基，且生根培养基内加入0.5～1.5mg/L吲哚丁酸，使生根效果更好，且生根快，根长，较粗，密集。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是实施例1中步骤(2)诱导出的愈伤组织图片。
图2是实施例1中步骤(3)分化出的不定芽图片。
图3是实施例1中步骤(4)得到的鸭儿芹试管苗图片。
具体实施方式
下面结合附图并通过实施例对本发明作进一步的详细说明，以下实施例是对本发明的解释而本发明并不局限于以下实施例。
实施例1。
本实施例的一种鸭儿芹的组织培养方法包括以下步骤：
(1)外植体消毒处理：选取生长良好的鸭儿芹一年生嫩茎，依次用洗衣粉浸泡10min，自来水冲洗3h，在超净工作台上用75％乙醇灭菌20～40s，无菌水冲洗3～5次，再用质量浓度为1.5～3.5％的NaClO灭菌5～10min，无菌水冲洗3～5次后，用灭菌滤纸吸干表面水分，最后将消毒处理后的鸭儿芹置于无菌干净的培养皿中备用，外植体消毒可以把材料表面上的各种微生物杀灭，同时，上述的消毒处理，消毒能力强，不易残留，对环境无害。
(2)愈伤组织诱导：将步骤(1)中消毒好的鸭儿芹嫩茎切成约1cm的小段，竖直插入诱导培养基中，进行暗培养30天，温度23～25℃，愈伤组织诱导是外植体的局部受到创伤刺激后，在伤口表面新生的组织，如图1所示，图1为通过步骤(2)而诱导出的愈伤组织。
(3)分化培养：将步骤(2)中产生的愈伤组织接入分化培养基中培养6周，温度23～25℃，光照12h/d，光照度为2000～2400lx，促进细胞发育成各自的组织，最终形成丛生芽，如图2所示，图2为通过步骤(3)而得到的分化出的不定芽。
(4)生根培养：将步骤(3)中产生的丛生芽切成单株，接入生根培养基中培养，温度23～25℃，光照12h/d，光照度为2000～2400lx，2周后，基部长出根系，长度达到2～5cm，图3为步骤(4)得到的鸭儿芹试管苗。
(5)炼苗和移栽：将步骤(4)中高度大于4cm，叶片在4～6片，根系长度2～5cm的鸭儿芹组培苗进行炼苗，先将培养瓶的瓶盖打开，室温下炼苗3d后，取出试管苗，洗净根部的培养基，移栽到准备好的基质上，保持温度不低于10℃，不高于30℃，湿度85％～95％，适当遮阴，常规管理，此处所指的常规管理为现有技术，此处不再赘述。
本实施例中的步骤(2)中的诱导培养基为MS培养基，培养基内加入0.5mg/L的2，4-二氯苯氧乙酸、30g/L的蔗糖和7g/L的琼脂粉，调节pH为5.8。
本实施例中的步骤(3)中的分化培养基为MS培养基，所述培养基内加入1.5mg/L的6-苄基腺嘌呤、0.1mg/L的萘乙酸、30g/L的蔗糖和7g/L的琼脂粉，调节pH为5.8。
本实施例中的步骤(4)中的生根培养基为1/2MS培养基，所述生根培养基内加入0.5mg/L吲哚丁酸、30g/L蔗糖和7g/L琼脂粉，调节pH为5.8。
实施例2。
本实施例的一种鸭儿芹的组织培养方法包括以下步骤：
(1)外植体消毒处理：选取生长良好的鸭儿芹一年生嫩茎，依次用洗衣粉浸泡10min，自来水冲洗3h，在超净工作台上用75％乙醇灭菌20～40s，无菌水冲洗3～5次，再用质量浓度为1.5～3.5％的NaClO灭菌5～10min，无菌水冲洗3～5次后，用灭菌滤纸吸干表面水分，最后将消毒处理后的鸭儿芹置于无菌干净的培养皿中备用，外植体消毒可以把材料表面上的各种微生物杀灭，同时，上述的消毒处理，消毒能力强，不易残留，对环境无害。
(2)愈伤组织诱导：将步骤(1)中消毒好的鸭儿芹嫩茎切成约1cm的小段，竖直插入诱导培养基中，进行暗培养30天，温度23～25℃，愈伤组织诱导是外植体的局部受到创伤刺激后，在伤口表面新生的组织。
(3)分化培养：将步骤(2)中产生的愈伤组织接入分化培养基中培养6周，温度23～25℃，光照12h/d，光照度为2000～2400lx，促进细胞发育成各自的组织，最终形成丛生芽；
(4)生根培养：将步骤(3)中产生的丛生芽切成单株，接入生根培养基中培养，温度23～25℃，光照12h/d，光照度为2000～2400lx，2周后，基部长出根系，长度达到2～5cm；
(5)炼苗和移栽：将步骤(4)中高度大于4cm，叶片在4～6片，根系长度2～5cm的鸭儿芹组培苗进行炼苗，先将培养瓶的瓶盖打开，室温下炼苗3d后，取出试管苗，洗净根部的培养基，移栽到准备好的基质上，保持温度不低于10℃，不高于30℃，湿度85％～95％，适当遮阴，常规管理，此处所指的常规管理为现有技术，此处不再赘述。
本实施例中的步骤(2)中的诱导培养基为MS培养基，培养基内加入1.0mg/L的2，4-二氯苯氧乙酸、30g/L的蔗糖和7g/L的琼脂粉，调节pH为5.8。
本实施例中的步骤(3)中的分化培养基为MS培养基，所述培养基内加入2.0mg/L的6-苄基腺嘌呤、0.2mg/L的萘乙酸、30g/L的蔗糖和7g/L的琼脂粉，调节pH为5.8。
本实施例中的步骤(4)中的生根培养基为1/2MS培养基，所述生根培养基内加入1.5mg/L吲哚丁酸、30g/L蔗糖和7g/L琼脂粉，调节pH为5.8。
实施例3。
本实施例的一种鸭儿芹的组织培养方法包括以下步骤：
(1)外植体消毒处理：选取生长良好的鸭儿芹一年生嫩茎，依次用洗衣粉浸泡10min，自来水冲洗3h，在超净工作台上用75％乙醇灭菌20～40s，无菌水冲洗3～5次，再用质量浓度为1.5～3.5％的NaClO灭菌5～10min，无菌水冲洗3～5次后，用灭菌滤纸吸干表面水分，最后将消毒处理后的鸭儿芹置于无菌干净的培养皿中备用，外植体消毒可以把材料表面上的各种微生物杀灭，同时，上述的消毒处理，消毒能力强，不易残留，对环境无害。
(2)愈伤组织诱导：将步骤(1)中消毒好的鸭儿芹嫩茎切成约1cm的小段，竖直插入诱导培养基中，进行暗培养30天，温度23～25℃，愈伤组织诱导是外植体的局部受到创伤刺激后，在伤口表面新生的组织。
(3)分化培养：将步骤(2)中产生的愈伤组织接入分化培养基中培养6周，温度23～25℃，光照12h/d，光照度为2000～2400lx，促进细胞发育成各自的组织，最终形成丛生芽；
(4)生根培养：将步骤(3)中产生的丛生芽切成单株，接入生根培养基中培养，温度23～25℃，光照12h/d，光照度为2000～2400lx，2周后，基部长出根系，长度达到2～5cm；
(5)炼苗和移栽：将步骤(4)中高度大于4cm，叶片在4～6片，根系长度2～5cm的鸭儿芹组培苗进行炼苗，先将培养瓶的瓶盖打开，室温下炼苗3d后，取出试管苗，洗净根部的培养基，移栽到准备好的基质上，保持温度不低于10℃，不高于30℃，湿度85％～95％，适当遮阴，常规管理，此处所指的常规管理为现有技术，此处不再赘述。
本实施例中的步骤(2)中的诱导培养基为MS培养基，培养基内加入0.8mg/L的2，4-二氯苯氧乙酸、30g/L的蔗糖和7g/L的琼脂粉，调节pH为5.8。
本实施例中的步骤(3)中的分化培养基为MS培养基，所述培养基内加入1.7mg/L的6-苄基腺嘌呤、0.15mg/L的萘乙酸、30g/L的蔗糖和7g/L的琼脂粉，调节pH为5.8。
本实施例中的步骤(4)中的生根培养基为1/2MS培养基，所述生根培养基内加入1.0mg/L吲哚丁酸、30g/L蔗糖和7g/L琼脂粉，调节pH为5.8。
比较实验1：
本实施例中不同浓度2,4-二氯苯氧乙酸对鸭儿芹茎段愈伤组织诱导的情况见表1。诱导培养基均为MS培养基，添加不同浓度的2,4-二氯苯氧乙酸。
表1
由表1可看出，2,4-二氯苯氧乙酸浓度在0.2、0.5、0.8和1.0mg/L时，出现愈伤组织，而在0.5和0.8mg/L时，愈伤组织多，在不添加2,4-二氯苯氧乙酸或2,4-二氯苯氧乙酸过多时，无愈伤组织。
比较实验2：
本实施例中不同浓度6-苄基腺嘌呤和萘乙酸对鸭儿芹不定芽分化的影响见表2。分化培养基均为MS培养基，添加不同浓度的6-苄基腺嘌呤和萘乙酸。
表2
由上表可看出，6-苄基腺嘌呤浓度为1.5mg/L，萘乙酸浓度为0.1mg/L，产生少量丛生芽，而在6-苄基腺嘌呤浓度为2mg/L，萘乙酸浓度为0.2mg/L时，产生大量丛生芽。
比较实验3：
本实施例中不同的生根培养基配方对鸭儿芹不定芽生根的影响情况见表3。
表3
由上表可看出，1/2MS培养基+0.5mg/L吲哚丁酸，1/2MS培养基+1.0mg/L吲哚丁酸，1/2MS培养基+1.5mg/L吲哚丁酸时，生根效果均较为明显。
本处的MS培养基和1/2MS培养基均为现有技术，此处不再赘述。
本说明书中所描述的以上内容仅仅是对本发明所作的举例说明。本发明所属技术领域的技术人员可以对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，只要不偏离本发明说明书的内容或者超越本权利要求书所定义的范围，均应属于本发明的保护范围。
Claims (1)
1.一种鸭儿芹的组织培养方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1) 外植体消毒处理：选取生长良好的鸭儿芹一年生嫩茎，依次用洗衣粉浸泡10min，自来水冲洗3h，用75%乙醇灭菌20~40s，无菌水冲洗3~5次，再用质量浓度为1.5~3.5%的NaClO灭菌5~10min，无菌水冲洗3~5次后，用灭菌滤纸吸干表面水分，最后将消毒处理后的鸭儿芹置于无菌干净的培养皿中备用；
(2) 愈伤组织诱导：将步骤(1)中消毒好的鸭儿芹嫩茎切成约1cm的小段，竖直插入诱导培养基中，进行暗培养30天，温度23~25℃；
(3)分化培养：将步骤(2)中产生的愈伤组织接入分化培养基中培养6周，温度23~25℃，光照12h/d，光照度为2000~2400lx；
(4) 生根培养：将步骤(3)中产生的丛生芽切成单株，接入生根培养基中培养，温度23~25℃，光照12h/d，光照度为2000~2400lx，2周后，基部长出根系，长度达到2~5cm；
(5) 炼苗和移栽：将步骤(4)中高度大于4cm，叶片在4~6片，根系长度2~5cm的鸭儿芹组培苗进行炼苗，先将培养瓶的瓶盖打开，室温下炼苗3d后，取出试管苗，洗净根部的培养基，移栽到准备好的基质上，保持温度不低于10℃，不高于30℃，湿度85%~95%，适当遮阴，常规管理，
所述步骤(4)中的生根培养基为1/2MS培养基，所述培养基内加入0.5~1.5mg/L吲哚丁酸、30g/L蔗糖和7g/L琼脂粉，调节pH为5.8，
所述步骤(2)中的诱导培养基为MS培养基，所述培养基内加入0.5~1.0mg/L 的2，4-二氯苯氧乙酸、30g/L的蔗糖和7g/L的琼脂粉，调节pH为5.8，
所述步骤(3)中的分化培养基为MS培养基，所述培养基内加入1.5~2.0mg/L 的6-苄基腺嘌呤、0.1~0.2mg/L的萘乙酸、30g/L的蔗糖和7g/L的琼脂粉，调节pH为5.8。
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