CN102300467B - 植酸酶在发酵大豆基产品制备中的用途 - Google Patents
植酸酶在发酵大豆基产品制备中的用途 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及制备发酵大豆基产品的方法，所述方法包括：a.提供含有0.5-10重量%大豆蛋白的水性液体；b.将该水性液体巴氏灭菌或灭菌；c.用含乳酸菌的起子培养物接种该巴氏灭菌或灭菌的液体；d.通过在15-48℃下培养0.5-40小时，发酵该接种的水性液体，以获得发酵产品；其中在所述水性液体在步骤b中的巴氏灭菌后在该水性液体中掺入植酸酶或其中在发酵步骤d结束前不晚于10分钟向该巴氏灭菌或灭菌的液体中加入植酸酶，所述植酸酶以每克大豆蛋白不大于11FTU的量掺入该巴氏灭菌或灭菌的液体中；且其中通过巴氏灭菌、冷却或pH调节终止发酵步骤d。据发现，通过同时进行植酸酶处理和发酵，可以在使植酸降解对脂质氧化的不利作用最小化的同时实现矿物质，如铁和镁的生物利用率的显著提高。本发明还提供含有大豆蛋白、多不饱和脂肪酸、铁和/或镁和肌醇磷酸酯的发酵大豆基产品，其中该发酵产品中所含的肌醇磷酸酯的磷酸酯残基平均数在1.5-4.0的范围内。
Description
技术领域
本发明涉及植酸酶在制备发酵大豆基产品的方法中的用途和已用植酸酶处理的发酵大豆基产品。
大豆衍生产品，如大豆蛋白浓缩物和分离物天然含有显著量的植酸（肌醇六磷酸酯）。植酸是强键合多价金属阳离子，如Fe2+、Fe3+、Mg2+、Ca2+和Zn2+的不可消化的有力螯合剂。由于这些矿物质中的一些天然存在于大豆衍生产品中，这些产品中所含的植酸不利地影响这些矿物质的生物利用率。因此，尽管大豆含有显著量的上述矿物质，这些大豆矿物质由于它们的生物利用率低的事实而具有有限的营养价值。此外，大豆衍生产品中天然存在的植酸也不利地影响补充矿物质，如Fe2+、Zn2+和Cu2+的生物利用率。
植酸酶可用于将植酸分解成易消化组分。因此，植酸酶处理可用于增强大豆衍生产品中所含的多价金属阳离子的生物利用率。
背景技术
在WO 2006/098721中公开了大豆衍生产品的植酸酶处理。该国际专利申请描述了具有降低的植酸含量的蛋白质材料的制备方法，所述方法包括：
a. 由含蛋白质的植物材料制备水提取物，
b. 调节该提取物的pH以沉淀蛋白质材料，
c. 分离沉淀的蛋白质材料并形成该沉淀的蛋白质材料在水中的悬浮液，
d. 提高该悬浮液的pH以形成在水中（部分）溶解的蛋白质材料，和
e. 干燥该蛋白质材料；
其中植酸酶在调节pH前掺入水提取物中或在干燥前掺入（部分）溶解的蛋白质材料中。WO
2006/098721进一步描述了包含通过上述方法获得的水合蛋白质材料、水合蛋白质稳定剂和食用酸的具有3.0至4.5的pH的酸性饮料组合物。
US
2007/0014910描述了包含0.6-4.6重量%的大豆蛋白产品的酸性含蛋白质的饮料，其中通过包含蛋白质的酸沉淀的方法制备该大豆蛋白产品：
• 由含大豆蛋白的植物材料制备大豆蛋白提取物；
• 使该大豆蛋白提取物与酸接触以形成大豆蛋白沉淀物；
• 使该大豆蛋白沉淀物与水合溶液接触以形成大豆蛋白悬浮液；
• 将植酸降解酶引入大豆蛋白悬浮液并使该大豆蛋白悬浮液与植酸降解酶反应30秒至50分钟以形成改性大豆蛋白材料；
• 将该改性大豆蛋白材料的pH调节至pH 6.5至8.0以形成中和的大豆蛋白材料；
• 将该中和的大豆蛋白材料加热至132-160℃的温度1-30秒以形成热处理的大豆蛋白材料；和
• 干燥该热处理的大豆蛋白材料以形成大豆蛋白产品。
也描述了该方法的替代实施方案，其中在酸沉淀前或在中和后引入植酸降解酶。
WO
2006/043478描述了制备具有优异风味以及减轻的青（草）味和涩味、顺滑质地和在腭上的合意口感的发酵豆乳的方法，所述方法包括以已用具有植酸分解酶活性的酶处理过的豆乳为原料进行乳酸发酵。WO
2006/043478教导了在植酸分解后通过灭菌使植酸酶失活。
上述方法的缺点在于下述事实：植酸酶处理过的大豆蛋白组合物表现出极大降低的氧化稳定性。如提高的产生氧化异味的倾向所示的这种降低的氧化稳定性是由于植酸酶处理消除了植酸对例如铁和铜阳离子的螯合作用的事实。铁和铜都是催化脂质氧化，尤其是多不饱和脂肪酸氧化（其产生气味强烈的醛）的公知促氧化剂。由于大豆衍生材料中通常大量存在氧化敏感的多不饱和脂肪酸，植酸的酶促降解会降低所述大豆衍生材料的氧化稳定性。这种降低的氧化稳定性表现为提高的这种大豆衍生材料在储存、加工过程中或在最终产品应用中产生异味的倾向。
发明内容
本发明人已经发现，在乳酸菌发酵的大豆基产品中，可以在使与降低的氧化稳定性相关联的不利作用最小化的同时实现植酸酶处理的益处，例如提高的铁生物利用率。
更特别地，本发明人已经意外地发现，如果植酸酶处理和发酵同时进行，可以非常有效地使植酸降解对脂质氧化，尤其是对异味形成的不利作用最小化。本发明人还已经发现，通过使用巴氏灭菌、冷却和/或pH-调节终止大豆基底物的发酵，可以进一步使异味形成最小化。
因此，本发明涉及制备发酵大豆基产品的方法，所述方法包括：
a. 提供含有0.5-10重量%大豆蛋白的水性液体；
b. 将该水性液体巴氏灭菌或灭菌；
c. 用含乳酸菌的起子培养物接种该巴氏灭菌或灭菌的液体；
d. 通过在15-48℃下温育0.5-24小时，发酵该接种的水性液体，以获得发酵产品；
其中在该水性液体中掺入植酸酶之后将所述水性液体在步骤b中巴氏灭菌、或其中在发酵步骤d结束前不晚于10分钟向该巴氏灭菌或灭菌的液体中加入植酸酶，其中通过一个或多个下列作用终止发酵步骤d：
• 发酵产品的巴氏灭菌；
• 将发酵产品冷却至低于10℃的温度；
• 将发酵产品的pH调节至小于4.5的pH。
尽管本发明人不希望受制于理论，据信，在本方法中，在乳酸菌消化引发异味的氧化产物的能力抵消由之前螯合的铁和/或铜阳离子的“释放”造成的提高的不饱和脂肪酸氧化的同时，逐渐降低植酸的螯合作用。因此，本方法能够产生包含高度可生物利用的金属矿物质，如铁并且几乎或完全没有异味的发酵产品。相反，如果对大豆蛋白材料施以植酸酶处理并随后用在产生发酵大豆基产品的方法中，由于未螯合的金属促氧化剂会在发酵底物的制备和随后发酵过程中发挥它们的完全促氧化作用，会产生更显著的异味。
通过巴氏灭菌、冷却或pH调节终止发酵，由此进一步使异味形成最小化。本发明人已经发现，例如，发酵大豆基产品的灭菌导致形成显著的异味。相反，如果通过巴氏灭菌、冷却或pH-调节终止发酵，几乎不形成这种异味。
本发明人另外发现，通过确保植酸的酶促分解仅进展到该发酵产品中所含的肌醇磷酸酯（即肌醇单-至六-磷酸酯）的磷酸酯残基平均数在1.5-4.0范围内的程度，可以获得含有显著量可生物利用的铁和/或镁并表现出令人惊讶地高的氧化稳定性的发酵大豆基产品。
相应地，本发明的另一方面涉及发酵产品，其含有：
• 0.5-10重量%大豆蛋白；
• 0.1-20重量%多不饱和脂肪酸含量为该发酵产品的至少0.1重量%的油；
• 0.01- 7.5毫摩尔/升的铁和/或0.5-375毫摩尔/升的镁；
• 至少3微摩尔/升的选自肌醇单磷酸酯、肌醇二磷酸酯、肌醇三磷酸酯、肌醇四磷酸酯、肌醇五磷酸酯、肌醇六磷酸酯及其组合的肌醇磷酸酯；和
• 20至99重量%的水；
其中该发酵产品中所含的肌醇磷酸酯的磷酸酯残基平均数在1.5-4.0的范围内。
发明详述
本发明的第一方面涉及制备发酵大豆基产品的方法，所述方法包括：
a. 提供含有0.5-10重量%大豆蛋白的水性液体；
b. 将该水性液体巴氏灭菌或灭菌；
c. 用含乳酸菌的起子培养物接种该巴氏灭菌或灭菌的液体；
d. 通过在15-48℃下温育0.5-24小时，发酵该接种的水性液体，以获得发酵产品；
其中在该水性液体中掺入植酸酶之后将所述水性液体在步骤b中巴氏灭菌、或其中在发酵步骤d结束前不晚于10分钟向该巴氏灭菌或灭菌的液体中加入植酸酶，所述植酸酶以每克大豆蛋白不大于11 FTU的量掺入该巴氏灭菌或灭菌的液体中；一个FTU是在pH
5.5和37℃下每分钟由过量植酸钠产生1微摩尔无机磷的植酸酶活性；且其中通过一个或多个下列作用终止发酵步骤d：
• 发酵产品的巴氏灭菌；
• 将发酵产品冷却至低于10℃的温度；
• 将发酵产品的pH调节至小于4.5的pH。
本文所用的术语“乳酸菌”是指产生乳酸作为碳水化合物发酵的主要代谢最终产物的耐酸、不形成孢子、不呼吸的杆形革兰氏阳性杆菌或球菌。本文所用的术语“乳酸菌”不包括双歧杆菌。
本文所用的术语“乳酸盐”包括乳酸以及乳酸的可食用盐。
本文所用的术语“植酸酶”是指能够分解植酸（肌醇六磷酸酯）的酶，例如通过水解植酸以从中释放一个或多个磷酸根。植酸酶优选能从植酸中除去至少3个磷酸根基团。
可通过首先添加大豆蛋白和随后添加植酸酶来适当地将植酸酶掺入含大豆蛋白的水性液体中。也可以通过首先添加植酸酶和随后添加大豆蛋白或通过同时添加植酸酶和大豆蛋白来将植酸酶掺入该水性液体中。
在本方法中，植酸酶通常以每克大豆蛋白至少0.1 FTU的量掺入该水性液体或巴氏灭菌或灭菌的液体中；一个FTU是在pH 5.5和37℃下每分钟由过量植酸钠产生1微摩尔无机磷的植酸酶活性。在M. Wyss等人；Biophysical Characterisation of fungal phytases
(myo-Inositol hexakisphosphate phosphohydrolase): Molecular size, glycosylation
pattern, and engineering of proteolytic resistance（真菌植酸酶（肌醇六磷酸酯磷酸水解酶）的生物物理表征：分子尺寸、糖基化形式和蛋白水解抗性工程学）.
Appl. Envir. Micr.（应用和环境微生物学）, 65 (2),
359-366, 1999中描述了适合测定植酸酶活性的方法。
植酸酶优选以每克大豆蛋白至少0.2 FTU，更优选每克大豆蛋白至少1 FTU，最优选每克大豆蛋白至少1.5 FTU的量添加。本发明人已经发现，使用相对少量的植酸酶避免植酸完全降解成肌醇和磷酸是有利的。相应地，在一个优选实施方案中，添加的植酸酶活性的量不超过每克大豆蛋白5 FTU，其最优选不超过每克大豆蛋白2.3 FTU。
优选在发酵步骤d结束前添加植酸酶以实现与同时发酵相关的完全益处。根据一个优选实施方案，在发酵步骤d结束前至少30分钟，优选至少1小时添加植酸酶。
根据所用植酸酶剂量和所用发酵条件，在12小时内或甚至在6小时内实现植酸充分降解通常是没有问题的。因此，有利地，在发酵步骤d结束前不多于12小时，再更优选不多于6小时，最优选在发酵步骤d结束前不多于4小时添加植酸酶。
由于一些市售植酸酶表现出极高的热稳定性，可以在巴氏灭菌前将植酸酶添加到该水性液体中，因为在巴氏灭菌后仍保持充足的植酸酶活性以在例如12小时内实现充足的植酸降解。但是，为使植酸酶活性损失最小化，优选将植酸酶添加到巴氏灭菌或灭菌的水性液体中。
根据一个特别优选的实施方案，在巴氏灭菌或灭菌的液体接种的15分钟内加入植酸酶。再更优选地，在接种时的10分钟内或甚至5分钟内加入植酸酶。在此，术语“在X分钟内”是指在接种前少于X分钟和在接种后少于X分钟加入植酸酶。
通过将植酸酶添加与接种相结合，可以确保使最终发酵产品中的植酸酶活性最小化，尤其是如果将此类发酵产品巴氏灭菌或灭菌。本发明人已经发现，通过在所述液体接种的同时将低剂量植酸酶添加到该巴氏灭菌或灭菌的液体中可实现植酸的充分降解以显著提高被该酸结合的矿物质的生物利用率。有利地，本方法包括以相当于0.0005-5.75 FTU/毫升的量，更优选以0.005-0.58 FTU/毫升的量，最优选以0.0075-0.23
FTU/毫升的量将植酸酶添加到该巴氏灭菌或灭菌的液体中。
通过低剂量添加植酸酶，最终发酵产品中的植酸酶活性可以保持低水平，且巴氏灭菌将所述活性降至无关紧要的水平，即使使用热稳定的植酸酶。要理解的是，最终产品中没有植酸酶活性是有利的，因为这样的残留活性可能不利地影响产品稳定性。通常，发酵产品中的植酸酶活性不超过0.12
FTU/毫升。再更优选地，发酵产品中的植酸酶活性不超过0.06 FTU/毫升，其最优选不超过0.01 FTU/毫升。
根据一个特别优选的实施方案，本方法包括发酵产品的巴氏灭菌，所述巴氏灭菌造成至少90%，更优选至少95%，最优选至少99%的植酸酶活性降低。
为获得其中植酸已充分降解以使结合的矿物质可生物利用的最终产品以及几乎或完全不含植酸酶活性的最终产品（尤其是如果将该产品巴氏灭菌和/或使用热稳定的植酸酶）而应添加的植酸酶的剂量水平取决于许多因素，如酶解持续时间、pH、温度、植酸浓度等。已经研究了植酸酶活性与温度和pH之间的关系并可如下描述：
10-(T+5)/15 × 10(pH-11.5)/2
≤ 剂量（以FTU/毫升计）≤ 10-(T-25)/15 × 10(pH-7.5)/2
其中T在25至50℃的范围内并代表以℃为单位的发酵温度，pH在3.5至7.5的范围内并代表在加入植酸酶时该水性液体的pH。
根据一个特别优选的实施方案，本方法采用热稳定的植酸酶，本文所用的术语“热稳定的植酸酶”是指以5.75 FTU/毫升的量存在于10 mM乙酸钠（pH 7）中时在80℃下暴露30分钟时损失小于50%，优选小于30%所述植酸酶活性的植酸酶。
本方法中所用的水性液体有利地包含0.75-6重量%，优选2-3.5重量%的大豆蛋白。该巴氏灭菌或灭菌的液体以及发酵产品的大豆蛋白含量优选在这些相同范围内。
大豆蛋白可合适地以豆乳、豆乳粉、大豆蛋白浓缩物、大豆蛋白分离物、水解大豆蛋白分离物或其组合的形式提供。合适的豆乳（提取物）、大豆蛋白浓缩物、大豆蛋白分离物或水解大豆蛋白分离物可购自例如Solae, Cargill, Kerry Group plc和SunOpta plc之类的供应商。在本发明的一个特别优选的实施方案中，该豆乳（提取物）、大豆蛋白分离物或水解大豆蛋白分离物已使用现有技术中，例如US
7,108,881中描述的任何方法去味。
含大豆蛋白的水性液体在发酵前巴氏灭菌或灭菌以避免微生物污染。可以使用本领域中公知的不同技术，如热处理、膜过滤、超高压等实现灭菌和巴氏灭菌。
本发明人已经发现，如果发酵步骤d包括在25-48℃，再更优选30-43℃的温度下温育，本方法可获得特别好的结果。通常，所述温育具有0.5-14小时，优选0.5-10小时，最优选1-8小时的持续时间。
通过一个或多个下列作用终止发酵步骤d：
• 发酵产品的巴氏灭菌；
• 将发酵产品冷却至低于10℃，优选低于8℃；
• 将发酵产品的pH调节至小于4.5的pH。
不同于灭菌，后面的终止作用不造成植酸酶失活。但是，发现不是必须将植酸酶灭活才能获得具有优异感官性质的稳定发酵产品。
在进一步优选的实施方案中，将发酵产品均化以产生在7℃下的粘度小于在100 s-1下50
mPa.s的产品。均化产生低粘度的非常顺滑的发酵产品，其构成饮料的优异基础。
本方法中可用的乳酸菌的实例包括嗜热链球菌、德氏乳杆菌（Lactobacillus
delbrueckii）、瑞士乳杆菌（Lactobacillus helveticus）、嗜酸乳杆菌、Lactobacillus casei、罗伊氏乳杆菌（Lactobacillus
reuteri）、鼠李糖乳杆菌（Lactobacillus rhamnosus）、短乳杆菌（Lactobacillus brevis）、发酵乳杆菌（Lactobacillus
fermentum）、清酒乳杆菌（Lactobacillus sake）、植物乳酸杆菌（Lactobacillus plantarum）、乳酸乳球菌乳酸亚种（Lactococcus
lactis subsp lactis）、乳酸乳球菌亚种（Lactococcus
lactis subsp cremoris Leuconostoc mesenteroides）、乳脂明串珠菌（Leuconostoc cremoris）、乳明串珠菌（Leuconostoc lactis）。本发明自然还包括两种或更多种上述乳酸菌的联合使用。
根据本方法的一个实施方案，乳酸菌优选在发酵步骤d过程中产生显著量的乳酸。相应地，在发酵步骤d的过程中，乳酸盐的发酵生成优选使pH降低至少1.2
pH单位，更优选至少1.5 pH单位。
根据本方法的另一实施方案，在发酵步骤d过程中产生仅有限量的乳酸，意味着在所述发酵步骤过程中，乳酸盐的生成使pH降低小于1.2 pH单位，优选小于1.0 pH单位。嗜温乳酸菌特别适合根据此实施方案使用。
为了制造无异味的发酵产品，控制本方法中的发酵条件以促进C5-C9正烷醛和/或反式-2-己烯醛的代谢。相应地，在本方法的一个特别优选的实施方案中，在发酵步骤d的过程中至少一种C5-C9正烷醛，优选至少3种C5-C9正烷醛的浓度不增加。甚至更优选地，在发酵步骤d的过程中至少一种C5-C9正烷醛的浓度降低至少30%，优选至少50%。
根据另一优选实施方案，在发酵步骤d的过程中，反式-2-己烯醛的浓度不提高。再更优选地，在发酵步骤d的过程中，反式-2-己烯醛的浓度降低至少30%，优选至少50%。
特定物质浓度降低X%意味着如果初始浓度为Y ppm，降低的浓度等于Y(100-X) /100 ppm。
通过实施例中描述的分析方法测定本文中提到的烷醛和烯醛浓度。
使用上述分析方法，以实现不想要的醛的所需消化的方式选择合适的LAB菌株和优化工艺条件完全在本领域技术人员的技术内。
如上文中解释，本方法中的植酸酶处理提供提高被植酸络合的多价金属阳离子的生物利用率的优点。由于大豆蛋白分离物和浓缩物通常含有显著量的铁和/或镁，本方法在该水性液体含有至少0.01毫摩尔/升铁和/或至少0.5毫摩尔/升镁的情况下特别有效。优选地，该水性液体中的铁浓度在0.02-7.5毫摩尔/升的范围内，更优选在0.1-1毫摩尔/升的范围内。同样地，该水性液体中的优选镁浓度在1-375毫摩尔/升的范围内，更优选在5-50毫摩尔/升的范围内。
要理解的是，如果巴氏灭菌或灭菌的液体含有显著量的植酸，本方法的益处最显著。由于植酸的部分水解形式，尤其是肌醇五磷酸酯也具有络合多价金属的能力，这些肌醇磷酸酯也会不利地影响矿物质，如铁和镁的生物利用率。根据一个优选实施方案，该水性液体的肌醇六磷酸酯和肌醇五磷酸酯的组合含量超过每克大豆蛋白1微摩尔，更优选超过每克大豆蛋白5微摩尔，最优选超过每克大豆蛋白20微摩尔。
由于本方法旨在显著降低螯合植酸的含量，该发酵产品的肌醇六磷酸酯和肌醇五磷酸酯的组合含量优选不超过每克大豆蛋白5微摩尔。甚至更优选地，该发酵产品的肌醇六磷酸酯和肌醇五磷酸酯的组合含量不超过每克大豆蛋白3微摩尔，最优选不超过每克大豆蛋白1微摩尔。
通常，在本发明的方法中，在以植酸酶的添加开始和以发酵步骤d的终止结束的期间内，以摩尔计的肌醇六磷酸酯和肌醇五磷酸酯的组合含量降低至少80%。再更优选地，上述降低为至少85%，最优选至少95%。
由于植酸酶处理，本方法产生其中肌醇磷酸酯中的磷酸酯残基平均数显著降低的发酵产品。通常，肌醇六磷酸酯和肌醇五磷酸酯一起占该发酵产品中所含的肌醇和肌醇磷酸酯总量的小于50摩尔%，更优选小于30摩尔%，最优选小于15摩尔%。
同样地，肌醇二磷酸酯和肌醇三磷酸酯一起优选占该发酵产品中所含的肌醇磷酸酯总量的至少30摩尔%，更优选至少50摩尔%。
本发明人已经发现，有利的是控制植酸的酶促分解以确保一方面实现肌醇六磷酸酯和肌醇五磷酸酯的充分降解以提高被这些肌醇磷酸酯络合的矿物质的生物利用率和另一方面不完全将肌醇磷酸酯转化成肌醇单磷酸酯和磷酸。更特别地，本发明人已经观察到，有利的是将植酸降解至该肌醇磷酸酯（即肌醇单磷酸酯至六磷酸酯）中所含的磷酸酯残基平均数在1.5-4.0的范围内，优选在2.0-4.0的范围内的程度。尽管本发明人不希望受制于理论，但据信，例如，肌醇二磷酸酯和肌醇三磷酸酯对矿物质，如铁阳离子的生物利用率几乎没有影响，而这些肌醇磷酸酯确实以某种方式减轻此类矿物质的促氧化作用。
本方法可合适地包括添加一种或多种食品成分和/或微量营养素。该方法可例如包括向该水性液体、巴氏灭菌或灭菌产品或向该发酵产品中添加水果和/或蔬菜成分。可添加的水果成分的实例包括水果块、水果汁和水果浓缩物。在本方法的某阶段可添加的其它成分和添加剂的实例包括甜味剂、调味物质、防腐剂、维生素、矿物质、饱腹感引发或增强剂、胆固醇降低剂等。
根据本发明的一个优选实施方案，该方法包括向该发酵产品中加入一种或多种选自铁、铜、镁或锌的矿物质，更优选一种或多种选自铁和镁的矿物质。本方法最优选包括向获自步骤d的发酵产品中加入铁。一种或多种这些矿物质的添加能将最终产品中这些矿物质的含量标准化，因为原材料中，尤其是大豆蛋白源材料中这些矿物质的浓度显著不同。根据一个特别优选的实施方案，铁以至少0.01毫摩尔/升的量掺入发酵产品中以实现至少0.15毫摩尔/升的最终铁浓度。
通常，接种巴氏灭菌或灭菌液体的步骤包括将含有足量活乳酸菌的起子培养物施加到该液体中。优选地，起子培养物以足以在发酵步骤d结束时产生大约104-109 Cfu/ml乳酸菌的量添加。根据一个优选实施方案，该起子培养物在发酵结束时产生每毫升104.5-108.5，优选105-108的活乳酸菌细胞。
本发明的另一方面涉及经过植酸酶处理的乳酸菌发酵大豆基产品，所述发酵产品含有：
• 0.5-10重量%大豆蛋白；
• 0.1-20重量%多不饱和脂肪酸含量为该发酵产品的至少0.1重量%的油；
• 0.01-7.5毫摩尔/升的铁和/或0.5-375毫摩尔/升的镁，
• 至少3微摩尔/升的选自肌醇单磷酸酯、肌醇二磷酸酯、肌醇三磷酸酯、肌醇四磷酸酯、肌醇五磷酸酯、肌醇六磷酸酯及其组合的肌醇磷酸酯；和
• 20至99重量%的水；
其中该发酵产品中所含的肌醇磷酸酯的磷酸酯残基平均数在1.5-4.0的范围内。
根据一个优选实施方案，该发酵产品中的植酸酶活性降至小于0.1 FTU/l，更优选小于0.05
FTU/l，最优选小于0.005 FTU/l。通过巴氏灭菌或灭菌，尤其是通过灭菌可以合适地降低发酵产品中的植酸酶活性。相应地，该发酵大豆基产品优选是巴氏灭菌或灭菌的产品，最优选是灭菌产品。
本发明的发酵产品通常含有相当于104-109个乳酸菌细胞/毫升的量的乳酸菌材料，所述乳酸菌材料选自活乳酸菌、死乳酸菌、乳酸菌残留物及其组合。该发酵产品最优选含有相当于106-108.5个乳酸菌细胞/毫升的量的乳酸菌材料，尤其是选自活乳酸菌、死乳酸菌及其组合的乳酸菌材料。
该发酵产品通常含有至少0.1重量%的油。有利地，该发酵产品含有0.1-20重量%的油，尤其是大豆油。
本文提到的铁浓度优选涉及阳离子铁，尤其是选自Fe2+、Fe3+及其组合的阳离子铁。同样地，镁浓度优选涉及阳离子镁，尤其是Mg2+。
大豆蛋白源中存在的植酸的摩尔量常常超过这些相同大豆蛋白源中存在的铁的摩尔量。因此，为了使铁可生物利用，重要的是，铁与肌醇多磷酸酯的摩尔比超过1:1。在此，术语“肌醇多磷酸酯”是指选自肌醇四磷酸酯、肌醇五磷酸酯、肌醇六磷酸酯及其组合的肌醇磷酸酯。优选地，根据本发明，该发酵产品中铁与肌醇多磷酸酯的摩尔比超过2:1，其最优选超过3:1。
该发酵产品中肌醇磷酸酯的浓度有利地在0.05-8毫摩尔/升的范围内。换言之，肌醇磷酸酯的浓度优选在每克大豆蛋白5-80微摩尔的范围内，更优选在每克大豆蛋白10-50微摩尔的范围内。
根据一个特别优选的实施方案，该发酵产品中所含的肌醇磷酸酯的磷酸酯残基平均数在1.6-3.5的范围内。
如上解释，该发酵产品的肌醇六磷酸酯和肌醇五磷酸酯的组合含量优选不超过5微摩尔/克大豆蛋白。再更优选地，该发酵产品的肌醇六磷酸酯和肌醇五磷酸酯的组合含量不超过3微摩尔/克大豆蛋白，其最优选不超过1微摩尔/克大豆蛋白。
有利地，肌醇六磷酸酯和肌醇五磷酸酯一起占该发酵产品中所含的肌醇和肌醇磷酸酯总量的小于50摩尔%，更优选小于30摩尔%,，最优选小于15摩尔%。
根据另一优选实施方案，肌醇二磷酸酯和肌醇三磷酸酯一起占该发酵产品中所含的肌醇磷酸酯总量的至少20摩尔%，更优选至少30摩尔%,，最优选至少40摩尔%。
本发明所涵盖的发酵大豆基产品的实例包括发酵大豆饮料和大豆基酸奶。特别优选的发酵产品是发酵大豆饮料，尤其是含有0.5-10重量%大豆蛋白和20-99重量%，优选60-98重量%水的发酵大豆饮料。
借助下列实施例进一步举例说明本发明。
具体实施方式
实施例
磷分析
如Wyss等人（Wyss
M, Pasamontes L, Friedlein A, Remy R, Tessier M, Kronenberger A等人， Biophysical characterization of fungal phytases
(myo-inositol hexakisphosphate phosphohydrolases): Molecular size,
glycosylation pattern, and engineering of proteolytic resistance（真菌植酸酶（myo-肌醇六磷酸酯磷酸水解酶）的生物物理表征：分子尺寸、糖基化形式和蛋白水解抗性工程学），Applied
and Environmental Microbiology（应用和环境微生物学） 1999；65 (2) :359-366.）描述的来自植酸酶的水解磷的光度测定。
取100微升样品并立即用等体积的15%三氯乙酸稀释以终止酶反应。随后，将样品充分混合几秒并在15.000g下离心5分钟。上清液在软化水中稀释5倍并随后通过将10微升这种稀释样品与90微升软化水和100微升0.6 M H2SO4、2%抗坏血酸和0.5%钼酸铵混合来量化释放的磷酸根离子。在45℃下温育30分钟后，在微滴定板读数器（Spectramax）中测量在820纳米下的吸光度。使用空白溶液（含大豆，无植酸酶）测量大豆中天然存在的游离磷的份额并从样品值中减去。使用磷酸钾标准溶液（2-400
μM）作为参考。
加速贮存寿命试验
在20毫升顶空管瓶中装入2毫升样品。将管瓶储存在60℃。选择60℃的温度以确保样品在储存期间不变质。将样品储存28天。在此期间，定期在GC-MS (HP) (DBwax柱：20m x
180μm x 0.3μm,
J&W scientific）上用静态顶空挥发物分析法一式三份地分析样品的脂质氧化标记（乙醛、1-戊烯-3-醇、1-戊烯-3-酮、2t-戊烯醛、戊醛、戊烷、2t-丁醛、丙烯醛、丙醛、己醛）。GC温度程序如下：35℃下2分钟，35℃/分钟，至200℃，200℃下2分钟。注射体积为250微升，无分流。
醛分析
通过SPME接着GC-MS分析异味挥发物：
将2克样品置于20毫升顶空管瓶中并用气密盖密封。
借助固相微萃取分析样品。所用纤维：Carboxen/PDMS 85 μm，来自Supelco。
在配有Gerstel CIS-4注射器和SPME选项的Gerstel MPS-2自动取样器的Agilent
GC/MS上进行分析。柱：VF-5；50m *
0.2 mm * 0.33 μm。
GC程序：
• 40℃(2
min) - (3°/min) ->160℃(0 min) - (20°/min)
->250℃(2 min)
• 气体：氦气
• 流速：1毫升/分钟，恒定流速
SPME取样时间：在40℃下35分钟
解吸：在170℃下40分钟
不分流（split-less）时间：2分钟
离子铁生物利用率
所有玻璃器皿在10% (v/v) HNO3中温育整夜。在实验当天，所有玻璃器皿用milli-Q水洗涤5次以除去HNO3。
在剧烈摇振后，取60克样品并在100毫升溶解容器中与20毫升水合并。将这些容器转移到溶解装置（II类型，Vankel VK700）中。将pH调节至2.0。随后，向各容器中加入胃蛋白酶（0.5克/升），产生90毫升产物悬浮液在pH 2.0的模拟胃液中的溶液。在以100 rpm混合下在37℃下温育60分钟后，取悬浮液样品以测定总铁和在锥形瓶中模拟肠期。
为了模拟肠期，将充满NaHCO3水溶液的渗析膜（Spectra/Por
7 MWCO 8000）置于锥形瓶中。渗析膜中存在的碳酸氢钠的量能将模拟消化调节至pH 6.8。在37℃水浴中温育30分钟和连续摇振（100 rpm）后，向该烧瓶中加入胰酶（0.4毫克/毫升）和胆汁酸溶液（1.25毫克/毫升）的混合物。该烧瓶在相同的37℃水浴中在连续摇振（100 rpm）下用渗析膜进一步温育另外2小时。此后，取出渗析膜并取渗析液内容物样品测定离子可渗析铁的量。
通过等离子体发射光谱法测定总铁。使用Roche/Hitachi分析器和基于锆铁（ferrozine）的用于分析人血清中的铁的试剂测定离子铁（Fe2+和Fe3+的总和）。
实施例
1
通过在热水（90℃）中混合5.6%豆乳粉（Soy Supreme Fibre Reduced soy bean powder SunOpta Grains
and Food Group, Hope, MN, USA），制备2.5%蛋白质含量的大豆基料。在添加2%蔗糖、1%葡萄糖之前该粉末水合至少15分钟。随后使该混合物冷却至43℃并分成3个等分试样和进一步如下处理：
• 等分试样1在43℃下保持1小时，随后接种0.02%市售冻酸乳酪培养浓缩物T-071016（嗜热链球菌株的指定混合培养物，丹麦Chr
Hansen, Hørsholm提供）。该混合物在43℃下再温育3小时，随后储存在4℃下直至通过SPME接着GC-MS分析。
• 用0.01% (w/w) 植酸酶的市售酶制品（获自DSM Food Specialities B. V., Delft, 荷兰的DSM植酸酶5000液体[至少5750 FTU/g]）处理等分试样2并在43℃下保持1小时。在此期间后，用市售冻酸乳酪培养浓缩物T-071016（嗜热链球菌株的指定混合培养物，丹麦Chr Hansen, Hørsholm提供）接种该混合物。在43℃下再继续温育3小时，随后储存在4℃下直至通过SPME接着GC-MS分析。
• 等分试样3在43℃下保持1小时，随后用市售冻酸乳酪培养浓缩物T-071016（嗜热链球菌株的指定混合培养物，丹麦Chr Hansen, Hørsholm提供）接种该混合物并同时用0.01% (w/w) 植酸酶的市售酶制品（获自DSM
Food Specialities B. V., Delft, 荷兰的DSM植酸酶5000液体）处理。在43℃下再继续温育3小时，随后储存在4℃下直至通过SPME接着GC-MS分析。
己醛分析：
在温育后，如上所述分析等分试样1、2和3的己醛含量。所得结果描述在表1中。
表1
| 3小时发酵后 | 己醛含量（峰下的面积） |
| 等分试样1 | 160,000 |
| 等分试样2 | 220,000 |
| 等分试样3 | 170,000 |
这些结果清楚表明，同时的植酸酶处理和发酵产生比植酸酶处理接着发酵低的氧化异味。如果由植酸酶处理过的大豆粉制备等分试样2接着如上所述发酵3小时，所观察到的差异更大。
实施例
2
使用实施例1中描述的程序制备5%蛋白质含量的大豆基料。此外，通过将植酸酶（获自DSM Food
Specialities B. V., Delft, 荷兰的DSM植酸酶5000液体）溶解在自来水中（100X稀释）制备植酸酶水溶液。
向5升大豆基料中加入5毫升稀植酸酶（总酶稀释 = 100.000x），接着在43℃下温育。为了以可再现的方式模拟发酵过程，用乳酸逐渐酸化该混合物。由此以30分钟时间间隔添加乳酸等分试样以将该混合物的pH逐步降低每次0.5
pH单位，在5小时后达到4.5的最终pH。在0、1、2、3、4和5小时后取750毫升样品，用软化水稀释2x，用乳酸调节至pH 4.0并ultraturraxed 10秒。立即对这些样品施以均化和巴氏灭菌（在77℃下）以终止植酸酶活性。
通过使用上述磷分析程序分析样品中的游离磷酸根含量，测定该巴氏灭菌样品的肌醇磷酸酯组成。结果显示在表2中。
对该巴氏灭菌样品施以如上所述的加速氧化试验。使用如上所述的静态顶空分析以规则的时间间隔测定样品中的己醛含量。所有样品中的己醛含量的发展被发现遵循在10-15天后达到其最大值的S-曲线。对各样品而言，测定在何时间后己醛含量达到其最大含量的50%（t1/2）。结果显示在表2中。
使用上述体外试验测定巴氏灭菌样品中所含的铁的离子铁生物利用率。
结果再显示在表2中。
表2
| 温育时间 | 游离磷酸根 | 氧化t1/2 | 可生物利用的离子铁 |
| 0小时 | 3 mM | 12天 | 11.9% |
| 1小时 | 4 mM | 12天 | 14.7% |
| 2小时 | 7.5 mM | 11天 | 21.4% |
| 3小时 | 10 mM | 11天 | 37.7% |
| 4小时 | 14 mM | 9天 | 37.3% |
| 5小时 | 14 mM | 9天 | 38.1% |
这些结果表明，通过植酸的部分dephytinization获得气味和铁生物利用率方面的最佳结果。在此试验中，在2-3小时后获得最佳结果，这相当于肌醇磷酸酯中2.5至3.8的磷酸酯残基平均数。
Claims (18)
1.制备发酵大豆基产品的方法，所述方法包括：
a. 提供含有0.5-10重量%大豆蛋白的水性液体；
b. 将该水性液体巴氏灭菌或灭菌；
c. 用含乳酸菌的起子培养物接种该巴氏灭菌或灭菌的液体；
d. 通过在15-48℃下温育0.5-24小时，发酵该接种的水性液体，以获得发酵产品；
其中在该水性液体中掺入植酸酶之后将所述水性液体在步骤b中巴氏灭菌、或其中在发酵步骤d结束前不晚于10分钟向该巴氏灭菌或灭菌的液体中加入植酸酶，所述植酸酶以每克大豆蛋白不大于11 FTU的量掺入该巴氏灭菌或灭菌的液体中；一个FTU是在pH 5.5和37℃下每分钟由过量植酸钠产生1微摩尔无机磷的植酸酶活性；且
其中通过一个或多个下列作用终止发酵步骤d：
• 发酵产品的巴氏灭菌；
• 将发酵产品冷却至低于10℃的温度；
• 将发酵产品的pH调节至小于4.5的pH。
2.根据权利要求1的方法，其中植酸酶以每克大豆蛋白至少0.1 FTU的量掺入该水性液体或巴氏灭菌或灭菌的液体中。
3.根据权利要求1或2的方法，其中植酸酶以每克大豆蛋白不大于5 FTU的量掺入该水性液体或巴氏灭菌或灭菌的液体中。
4.根据权利要求1的方法，其中在发酵步骤d结束前至少30分钟添加植酸酶。
5.根据权利要求4的方法，其中在发酵步骤d结束前至少1小时添加植酸酶。
6.根据权利要求1的方法，其中在发酵步骤d结束前不多于12小时添加植酸酶。
7.根据权利要求6的方法，其中在发酵步骤d结束前不多于6小时添加植酸酶。
8.根据权利要求1或2的方法，其中将植酸酶添加到巴氏灭菌或灭菌的水性液体中。
9.根据权利要求1的方法，其中发酵步骤d包括在30-48℃的温度下温育0.5-10小时。
10.根据权利要求1的方法，其中通过发酵产品的巴氏灭菌终止发酵步骤d。
11.根据权利要求1的方法，其中该水性液体的肌醇六磷酸酯和肌醇五磷酸酯的组合含量超过1微摩尔/克大豆蛋白。
12.根据权利要求1的方法，其中该发酵产品中所含的肌醇磷酸酯的磷酸酯残基平均数在1.5-4.0的范围内。
13.根据权利要求1的方法，其中在以植酸酶的添加开始和以发酵步骤d的终止结束的期间内，以摩尔计的肌醇六磷酸酯和肌醇五磷酸酯的组合含量降低至少80%。
14.根据权利要求1的方法，其中肌醇二磷酸酯和肌醇三磷酸酯一起占该发酵产品中所含的肌醇磷酸酯总量的至少30摩尔%。
15.经过植酸酶处理的通过权利要求1的方法生产的乳酸菌发酵大豆基产品，所述发酵产品含有：
• 0.5-10重量%大豆蛋白；
• 0.1-20重量%多不饱和脂肪酸含量为该发酵产品的至少0.1重量%的油；
• 0.01- 7.5毫摩尔/升的铁和/或0.5-375毫摩尔/升的镁；
• 至少3微摩尔/升的选自肌醇单磷酸酯、肌醇二磷酸酯、肌醇三磷酸酯、肌醇四磷酸酯、肌醇五磷酸酯、肌醇六磷酸酯及其组合的肌醇磷酸酯；和
• 20至99重量%的水；
其中该发酵产品中所含的肌醇磷酸酯的磷酸酯残基平均数在1.5-4.0的范围内。
16.根据权利要求15的发酵产品，其中铁与选自肌醇四磷酸酯、肌醇五磷酸酯、肌醇六磷酸酯及其组合的肌醇多磷酸酯的摩尔比超过1:1。
17.根据权利要求15或16的发酵产品，其中该产品包含每克大豆蛋白至少0.02毫克植酸酶材料，所述植酸酶材料选自活性植酸酶、无活性植酸酶及其组合。
18.根据权利要求15的发酵产品，其中该发酵产品中所含的肌醇磷酸酯的磷酸酯残基平均数在1.6-3.5的范围内。
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