CN102297798A - 朊病毒蛋白配基和使用方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了结合朊病毒蛋白的配基以及使用该配基检测或除去样品、如生物学流体或环境样品中朊病毒蛋白的方法。配基能够结合一种或多种形式的朊病毒蛋白,包括细胞朊病毒蛋白(PrPc),感染性朊病毒蛋白(PrPsc),和重组朊病毒蛋白(PrPr)。配基结合各种物种、包括人和仓鼠的朊病毒。也提供了一种治疗受试者中朊病毒相关病理或延缓其进展的方法。
Description
本分案申请是基于申请号为200380109043.3,申请日为2003年12月03日,发明名称为“朊病毒蛋白配基和使用方法”的中国专利申请的分案申请。
相关申请的交叉参考
本申请要求2002年12月3日申请的,序列号为No.60/430,423的美国临时专利申请的利益。
发明领域
该发明涉及蛋白配基相互作用领域,更具体地涉及结合朊病毒蛋白的配基的鉴定和使用该配基检测或除去生物学样品中朊病毒的方法。
发明背景
天然或细胞朊病毒蛋白“PrPc”在整个哺乳类中广泛分布,并具有格外高度保守的氨基酸序列和蛋白结构。感染性朊病毒被认为是由正常细胞朊病毒蛋白(PrPc)的修饰型组成,被称做“PrPsc”。朊病毒与其它感染性病原体有一些共同的性质,但似乎不合有核酸。相反,推测非感染性PrPc向感染性PrPsc的转变涉及翻译后的构象变化,在这期间α螺旋被转换为β-折叠片。PrPc含有3个α螺旋,少有β-折叠片结构;相反,PrPsc富含β-折叠片。据认为PrPc转变为PrPsc会导致产生感染性海绵状脑病(TSEs),其间PrPsc积聚在中枢神经系统(CNS)中,并伴有神经病理性改变和神经学功能障碍。PrPsc,通常称作朊病毒蛋白的“瘙痒病(scrapie)”型,被认为对动物和人的这些感染性神经变性疾病的传播和发病机理是必须的并且可能是足够的。
TSEs的具体实例包括瘙痒病,其影响绵羊和山羊;牛海绵状脑病(BES),其影响牛;感染性水貂脑病,猫海绵状脑病和长耳鹿、白尾鹿、黑尾鹿和麋鹿的慢性萎缩病(CWD)。在人类,TSE疾病可自我表现为库鲁病(kuru)、克-雅综合症(CJD)、格-施-沙(Gerstmann-Straussler-Scheinker)综合征(GSS)、致死性失眠症和变异克-雅综合症(vCJD)。vCJD最近在人类出现是BSE在英国流行的结果,很有可能是由于消费了来源于感染了BSE或“疯牛病”的牛的食物产品所致。在上世纪从80年代中期到90年代早期,在英国有未知数目的人摄入了被BSE感染的牛的神经组织潜在性污染的食物。因为这种经口感染的疾病的潜伏期在人类可能超过二十年,因此vCJD的准确发病率可能许多年都不明显。迄今为止,已知超过130个人已经感染这种疾病,主要在英国;然而,加拿大、法国、香港、爱尔兰、意大利和美国也有病例报道。被污染的牛饲料产品从英国向全世界的出口表明BSE有可能全球存在,因此有发生cVJD的可能性。与这些观察一致的是在大多数欧洲国家、日本和以色列检测到BSE。所以,从包括食物产品的各种材料中检测和除去感染性朊病毒蛋白的能力是极其重要的。
在历史上,TSEs的诊断是基于该疾病临床症状的出现,而且只有通过对死后脑组织的组织学检查才能够确认。所有TSEs的特征是缺乏对病因的可测量的宿主免疫应答。因此,没有抗体产生,不能使用常规的血清学试验鉴定被感染的动物。最近,对脑中异常朊病毒蛋白的鉴定已经提高了做出疾病诊断的能力。
除了摄入牛来源的被感染产品,输血和器官移植代表了另一种在人类中传播vCJD的潜在方式。人类通过输血传播vCJD的可能性目前尚不知道,但是基于从实验动物模型、包括从经口实验性感染BSE的绵羊和天然感染搔痒病的绵羊传播的数据,这似乎非常有可能。和其它人类TSEs不同,PrPsc存在于vCJD病人的淋巴网状系统中,因此增加了传染原存在于血液中以及其通过输血传播的可能性。提高对通过输血传播的风险关注的其它因素包括未知数目、但是推测有大量的人暴露于BSE并且缺乏vCJD临床前诊断性试验。而且,在灵长类和小鼠中的物种适应后,vCJD的毒力似乎增强,提示人和人之间的传播可能比从牛到人的传播更有效。因此,急需用于防止vCJD通过输血传播的方法。这样的措施可能包括感染供体的早期鉴定以及动物来源食品和旨在用于动物或人类消费或应用的健康产品、人和牛来源的血源性产品、以及器官移植中TSE病原的延迟,除去和灭活。不幸的是,PrPsc显著耐受化学和物理灭活方法,选择性的灭活方法很难找。
通过与配基的特异性相互作用除去朊病毒似乎更有希望。已经鉴定出许多结合朊病毒蛋白的配基。如在PCT/US01/11150中所描述的,已经尝试了从组合肽文库中筛选出能和在所有已知哺乳动物朊病毒蛋白中发现的八肽重复序列(PHGGGWGQ(SEQ ID NO:220))结合的配基,而且发现了一系列的配基。其它材料包括各种聚合物,例如,TosoBioSep的氨基聚丙烯酸甲酯、常用的离子交换树脂(见美国专利No.5,808,011,Gawryl等)、与淀粉样斑块相互作用的配基,例如刚果红(Ingrosso,L.,等,Congo red prolongs the incubation periodin scrapie-infected hamsters.J.Virology 69:506-508(1995))、4-碘,4-脱氧阿霉素(Tagliavini,F.,等,Effectiveness ofanthracycline against experimental prion disease in Syrianhamster.Science 276:1119-1122(1997))、两性霉素B、卟啉和酞菁(Priola,S.A.,等,Porphyrin and Phthalocyainine antiscrapiecompounds,Science 287:1503-1506(2000))、金属(Stockel等,Biochemistry,37,7185-7193(1998))、以及与PrP相互作用形成复合体的肽(见美国专利5,750,361,Prusiner等,和Soto,C.等,Reversion of prion protein conformational changes insyntheticβ-sheet breakerpeptides,Lancet,355:192-197(2000))、肝素和其它多硫酸化聚阴离子(Caughey,B.,等,Binding of the Protease-sensitive form ofprion protein PrP to Sulphated Glycosaminoglycan and CongoRed,J.Virology 68:2135-2141(1994))、抗体(Kascsak,R.J.,等,Immunodiagnosis of prion disease,Immunological Invest.26:259-268(1997)),以及其它蛋白,例如纤溶酶原(Fischer,M.B.等,Binding of disease-associated prion protein to plasminogen.,Nature 408:479-483(2000))。目前,尽管一些配基在特定的环境中可能有用,但是还没有完全表征一个配基或者发现它能结合来自多种介质的朊病毒(见美国专利No.5,808,011,Gawryl等)。
到目前为止,人类TSE疾病100%是致命的。不幸的是,尽管已经报道有许多化合物可能是有前景的治疗剂,包括两性霉素,硫酸化聚阴离子、刚果红染料以及蒽环抗生素,但所有化合物均显示较微弱的阻碍朊病毒增殖的潜能,没有一个显示对从感染宿主中除去预先存在的朊病毒有任何影响。因此,仍急需新的治疗试剂。
在许多其它疾病中,其中许多疾病是神经性疾病,正常可溶蛋白的装配和分解形成构象改变和不溶形式被认为是致病过程。疾病的发生和从正常形式转变到构象改变蛋白之间的关系还很不清楚。除了朊病毒外,这种不溶蛋白的实例还包括:阿尔茨海默氏(Alzheimer′s)病和脑淀粉样血管病(CAA)的淀粉样蛋白斑中的β-淀粉状蛋白肽;帕金森氏(Parkinson′s)病的Lewy小体中的α突触核蛋白(α-synuclein)沉积物、在额颞叶痴呆(frontal temporal dementia)和皮克(Pick’s)病中神经原纤维缠结中的tau、肌萎缩性脊髓侧索硬化中的超氧化物歧化酶;以及亨廷顿(Huntington′s)病中的亨廷顿蛋白(huntingtin)。
一般这些高度不溶的蛋白形成由具有β-片层构象共有特征的无分支原纤维构成的聚集物。在中枢神经系统中,淀粉状蛋白可存在于脑和脑脊膜血管中(脑血管沉积)以及脑实质(斑块)中。在人和动物模型中神经病理学的研究表明邻近淀粉样沉积物的细胞的正常功能受到扰乱。
神经炎斑块形成的确切机制以及斑块形成与疾病相关性神经变性过程的相互关系在很大程度上还不清楚。为理解其转变的过程以及发现将与疾病相关形式特异性相互作用的结构,都需要有可容易地分离或可区别蛋白的两个或多个构象型(例如PrPc和PrPsc)的方法学。当前分离或区别同种型的方法学包括:在存在离液剂如尿素的聚丙烯酰胺凝胶即横向尿素梯度胶中的不同迁移率;对蛋白酶,例如蛋白酶K(PK)处理的不同敏感性,称作PrPres的PrPsc的PK耐受性消化产物的检测;不同的温度稳定性;在非离子型去污剂中的相对溶解度;以及纤维结构结合某些化学物质(例如刚果红和异黄酮S)的能力。然而,仍迫切需要鉴定对构象发生改变的蛋白、尤其是疾病相关型蛋白特异的高亲合力试剂。这种试剂将可用于开发可能的诊断性试剂盒,分离和纯化不同形式的蛋白,用于从治疗剂、生物产品、疫苗、和食品中除去所述疾病的感染型,以及用于治疗。
发明概述
本发明提供了结合朊病毒蛋白的配基及其应用。所述配基是与朊病毒分析物以选择性和特异性相结合的肽。它们能够结合朊病毒蛋白中的一种或多种形式,包括细胞朊病毒蛋白(PrPc)、感染性朊病毒蛋白(PrPsc)以及重组朊病毒蛋白(PrPr)。该配基可结合来自各种物种,包括人和仓鼠的朊病毒。也提供了包含在支持物如树脂或膜上的朊病毒蛋白结合配基的组合物。
配基可用于从样品中检测或除去朊病毒蛋白,所述样品例如是生物学流体或环境样品。配基可用于检测或除去样品中所有的朊病毒蛋白,或可选择性地挑选以检测或除去朊病毒蛋白的单一型,因此配基可用于在来自患人TSEs的病人和患瘙痒病、BSE和CWD的动物的样品中区分感染性和非感染性朊病毒蛋白。
也提供了一种治疗受试者中朊病毒相关病理或延缓其进展的方法。例如,本发明的配基可用于治疗病变,如CJD、vCJD、GSS、致死性失眠症、瘙痒病、BSE和CWD。这种配基可能是通过抑制PrPsc的聚合或通过抑制PrPsc和PrPc的相互作用、从而延缓PrPsc的进一步进展而起作用的。
本发明的另一方面提供了用于鉴定额外配基,特别是对蛋白的构象改变形式特异的配基的方法,其中的一些形式参与疾病的发展。所描述的方法学也适合开发、评价或筛选直接结合PrPsc的大量潜在的药物候选物。
从下面详细的描述和优选的实施例中明显可知本发明的其它特征和优势。
附图的简要描述
图1来自结合脑匀浆物的haPrPc和haPrPsc的组合文库的珠中的化学发光信号。通过特异性单克隆抗体(3F4)与缀合了对3F4特异的二抗的碱性磷酸酶的结合检测PrPc和PrPsc。在放射自显影胶片上检测对碱性磷酸酶特异性的化学发光底物所产生的光。对组合文库的珠所产生的信号的位置编号。随后对珠上的配基测序。这些珠在转移和变性之前不产生信号,但是在结合蛋白的转移和变性以及用缀合3F4抗体的酶标记之后,发射出强信号。
图2显示了正常人脑提取物中的huPrPc与柱样形式的亲和树脂的结合。制备脑匀浆物和珠,并在磷酸盐(PBS)或柠檬酸盐磷酸盐葡萄糖(CPD)缓冲液中平衡。蛋白印迹上信号的强度是结合到树脂上的PrPc的强度的函数。泳道1包含分子量标准(MW);泳道2 20ul 0.1%正常人脑匀浆物。泳道3-8,从珠中洗脱的PrPc。
图3显示了CJD感染的人脑的提取物中huPrPsc以分批形式与亲和树脂的结合。该图是蛋白印迹,其中显示与含有散发性CJD病人的huPrPsc的组织匀浆物相接触后从珠中洗脱的朊病毒量。在与已用PK处理以显示PrPres的存在或者保持未处理的组织匀浆物接触后,冲洗珠。将它们在含有SDS的缓冲液中煮沸以释放结合蛋白,在蛋白印迹之后通过SDS-PAGE拆分样品。用单克隆抗体3F4探针探测后,由PrP特异性条带的出现证明huPrPsc和PrPc与树脂的结合。在凝胶的顶端显示了肽序列。PK消化的样品表示为(+),未消化的为(-)。
图4CJD感染人脑的提取物中的huPrPsc与柱形式的亲和性树脂的结合。在凝胶的顶端显示肽序列。事先用PK消化过的样品以+表示,未消化的以-表示。对照包括20ul 1%脑匀浆。使用单克隆抗体3F4特异性检测PrPc和PrPsc,并通过化学发光信号的检测使其可见。
图5“珠印迹”转移方案的图示。在与起始材料孵育之后在凝胶中排列珠。结合蛋白从珠上转移并如所示通过缓冲液的毛细管转移捕获在膜上。
图6通过各种亲和树脂从感染的RBCCs中除去PrPres。用患瘙痒病的仓鼠的脑匀浆使红细胞浓缩物(RBCCs)致敏,并顺序通过具有不同亲和配基的树脂柱。通过凝胶电泳分析树脂结合型蛋白。凝胶上样的方式显示于表11中。
发明详述
这里描述了结合朊病毒蛋白的配基及其应用。所述配基是能够以特异性和亲和性结合朊病毒蛋白的蛋白、肽或多肽。优选地,配基具有6kDa或更低的分子量。
配基可用于检测样品、如人或动物来源的生物学流体或环境样品中朊病毒蛋白的方法,以及诊断和治疗朊病毒疾病的方法。例如,本发明的配基可用于使用全血、血液成分、细胞、血清、血浆、血浆衍生物、脑脊液、尿液、泪液、扁桃体、阑尾和其它样品治疗诊断病变如CJD、vCJD、GSS、致死性失眠症、瘙痒病、BSE和CWD以及其它TSEs。配基也可用于从样品中除去朊病毒蛋白,所述样品例如是血液样品、血液成分、细胞、血清、血浆、血浆衍生物、脑脊液、尿液、泪液、扁桃体、阑尾和其它样品。配基用于在样品中检测或从中除去所有朊病毒蛋白,或者可选择性的选取以检测或除去朊病毒蛋白的单一形式,因此可用来区分样品中的感染性和非感染性朊病毒蛋白。
所描述的方法可用于从聚合物、合成化合物以及合成化合物文库中筛选朊病毒的额外配基。
这里也提供了鉴定额外配基,特别是对蛋白的构象改变形式特异的配基的方法,其中的一些改变形式与是疾病的进展有关。
也提供了适于发现、评价或筛选大量潜在药物候选物的方法学。
定义
这里使用的术语“一个”、“一种”、“这个”和“这种”定义为“一个或多个”或“一种或多种”,还包含多个(种)的情形,除非上下文显示不适当。
术语“3F4”指对PrPc的天然型,但不对天然PrPsc或PrPres特异的单克隆抗体。抗体对仓鼠和人类PrPc,PrPsc和PrPres的变性形式有特异性。
如这里使用的,术语“血源性组合物”和血液组合物可交换地使用,意思是包括全血、红细胞浓缩物、血浆、血清、富含血小板和缺乏血小板的成分、血小板浓缩物、白细胞、血浆沉淀物、血浆分级分离沉淀物和上清液,包括IgA、IgE、IgG和IgM的免疫球蛋白制品、纯化的凝血因子浓缩物、纤维蛋白原浓缩物,或来源于人类或动物的各种其它组合物。其也包括通过现有技术中的各种常用方法中的任何一种方法,包括离子交换、亲和、凝胶渗透、和/或疏水层析或通过示差沉淀所制备的纯化的血源性蛋白。
术语“组合文库”指通过固相组合化学技术合成的化学制剂的集合。这个定义包括使用产生数百万有明确长度的随机肽或可设计成包括明确结构的分离-偶联-重组方法。构件可以是天然氨基酸、合成分子、氨基酸类似物、分枝类似物、三嗪染料等。
术语特定序列的“保守性变异”或“保守性修饰变异”指氨基酸或其它具有实质性化学相似性的密切相关的结构。此外,改变、添加或缺失编码序列中单个氨基酸或小比例氨基酸的各取代、缺失或添加是保守性修饰变异,其中所述变异导致用化学上相似的氨基酸取代另一种氨基酸。提供功能相似性氨基酸的保守取代表是本领域公知的。在下面的六组中,每一组都含有可相互进行保守性取代的天然氨基酸:
1)丝氨酸(S)、苏氨酸(T);
2)天冬氨酸(D)、谷氨酸E);
3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q);
4)精氨酸(R)、赖氨酸(K);
5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、缬氨酸(V)、丙氨酸(A)
6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)。
许多非天然氨基酸也被视为是天然存在的氨基酸的保守取代。如果当序列排列以达到最大对应时,两个序列中的氨基酸残基序列相同,那么这两个多肽可以说成是“同一的”。可通过Smith和Waterman,Adv.Appl.Math.2:482(1981)的局部同源性算法、通过Needleman和Wunsch,J.Mol.Biol.48:443(1970)的同源性排列算法、通过Pearson和Lipman,Proc.Natl.Acad.Sci.(US.AJ85:2444(1988)的相似性搜索方法、通过电脑完成这些算法(GAP,BESTFIT,FASTA,和TFASTA,Wisconsin Genetics Software Package,Genetics ComputerGroup,575 Science Dr.,Madison,WI)或通过检查,进行序列的最佳排列以便比较。
术语“配基”指与蛋白、肽或多肽结合的分子。本发明的配基可以是抗体制剂、蛋白、肽、多肽、氨基酸、核酸、碳水化合物、糖、脂类、有机分子、聚合物、和/或推定的治疗剂等。
术语“蛋白”、“肽”、“多肽”、和“寡肽”可交换使用,这里被定义为氨基酸链,其中碳通过由一个氨基酸的羧基和另一个氨基酸的氨基之间的缩合反应所形成的肽键相连接。在链一端的末端氨基酸(即氨基末端)有游离氨基,而在链的另一端的末端氨基酸(即羧基末端)有游离羧基。这样,术语“氨基末端”(缩写为N-末端)指肽的氨基末端处氨基酸上的游离氨基,或者指肽内任何其它部位处的氨基酸的氨基(当参与肽键时指亚氨基)。类似地,术语“羧基末端”(缩写为C-末端)指肽的羧基末端处氨基酸上的游离羧基,或者指肽内任何其它部位处氨基酸的羧基。当在树脂上通过Merrifield合成法合成时,通常通过与固定化氨基的肽键将C-末端羧基偶联到树脂上。
典型地,按顺序对组成肽的氨基酸编号,从氨基末端开始,并且向肽的羧基末端的方向增加。因此,当提及一个氨基酸“跟随”另一个时,则后一氨基酸比“前面的”氨基酸更靠近肽的羧基末端。
术语“PrPc”指在哺乳动物体内自然而广泛表达的天然朊病毒蛋白分子。其结构高度保守,而且与疾病状态不相关。
术语“PrPsc”指PrPc分子的构象改变型,其被认为是有感染性的,而且与TSE/朊病毒疾病有关,包括vCJD、CJD、库鲁病(kuru)、致命性失眠症、GSS、瘙痒病、BSE、CWD,以及俘获和实验动物的其它罕见TSEs。它和正常的细胞PrPc有相同的氨基酸序列,但已经将其中一些α-螺旋转换成了β-片层,并且与疾病状态有关。
术语″PrPres″指在用PK部分消化PrPsc后仍然存在的PrPsc蛋白的27-30kDa蛋白酶耐受性衍生物。
术语″PrPr″指通过重组技术表达的朊病毒蛋白。
术语″PrP″指一般的朊病毒蛋白。
这里使用的术语“残基”指通过酰胺键或酰胺键模拟物掺入到寡肽中的氨基酸(D或L)或氨基酸模拟物。这样,氨基酸可以是天然存在的氨基酸,或者,除非另有限制,还可包括以与天然存在的氨基酸相似的方式起作用的天然氨基酸的已知类似物(即氨基酸模拟物)。此外,酰胺键模拟物包括本领域技术人员公知的肽骨架修饰。
术语“基本相同”意思是多肽包含至少66%或更多相同氨基酸的序列。多肽序列基本相同的另一个指征是一种肽是否与针对所公开的肽产生的抗体有免疫学反应性。因此,本发明的肽包括与针对所公开的免疫原性肽所产生的抗体有免疫学反应性的肽和其它化学物质。
这里使用的术语“能够结合”指两个或多个分子在其中所述两个或多个分子能够形成复合体、例如蛋白质-配基复合体的条件下相互结合而形成复合体,例如,配基与蛋白或肽的结合。
结合PrP的特定氨基酸序列的配基
这里所描述的朊病毒结合配基都是小分子,优选肽。配基结合来源于朊病毒蛋白的肽、多肽,或者整个朊病毒分子。如在这里使用的,术语“肽”没有暗示特定的长度。优选地,这里所描述的配基结合具有下列氨基酸序列中的一个或多个的朊病毒蛋白:
RYPxQ(SEQ ID NO:221),其中x是G,P或N
XxYYux(SEQ ID NO:222),其中x是任何氨基酸,u是R或Q
更优选地,配基结合具有下列氨基酸序列中的一个或多个的朊病毒蛋白:
RYPGQ(SEQ ID NO:1)
DRYYRD(SEQ ID NO:2)
QAYYQR(SEQ ID NO:3)
QVYYRP(SEQ ID NO:4)
当用于探测组合文库以筛选结合朊病毒的配基时,具有上面提供的一个或多个氨基酸序列的标记肽是有用的。优选地,当用于筛选文库以寻找朊病毒配基时,将肽在氨基末端放射标记和乙酰化,在羧基末端酰胺化。
这里所描述的配基的氨基酸序列缺少在WO 01/77687中公开的氨基酸序列,其结合朊病毒蛋白的八肽重复序列。
在第一个优选的实施方案中,配基是具有可结合SEQ ID NO:1的氨基酸序列的蛋白或肽。在下面表1中所示的氨基酸序列(SEQ IDNO:5-13)是可结合SEQ ID NO:1的氨基酸序列的实例。因此,在第一个优选的实施方案的配基中包括了具有下表1所示序列中的一个或多个序列的配基。在6聚体文库中筛选可结合SEQ ID NO:1的6聚体,鉴定出了表1中所示的氨基酸序列。用丙氨酸(A)作为树脂和文库的组合肽之间的间隔子来构建文库,在表1包括的序列中表示为最后的A。本领域技术人员将会理解这里提供的配基不限于具有表1所示示范性序列的那些配基。
表1
结合SEQ ID NO:1的6氨基酸序列
SEQ ID NO | 序列 |
5 | KIHKFLA |
6 | GTHDFQA |
7 | KFGSTHA |
8 | FVNEIEA |
9 | GLHFKSA |
10 | GRVLHHA |
11 | QKNSEWA |
12 | HAYFTHA |
13 | WPKGAVA |
在第二个优选的实施方案中,配基是具有可结合SEQ ID NO:2的氨基酸序列的蛋白或肽。在下表2中所示的氨基酸序列(SEQ IDNOS:14-22)是结合SEQ ID NOS:2的氨基酸序列的实例。因此,在第二个优选的实施方案的配基中包括了具有在表2所示序列中的一个或多个序列的配基。在6聚体文库中筛选可结合SEQ ID NO:2的6聚体,鉴定出了表2所示的氨基酸序列。用丙氨酸(A)作为树脂和文库的组合肽之间的间隔子来构建文库,在序列中表示为最后的A。赖氨酸(K)出现11次,组氨酸(H)出现7次,二者都高于分布平均值-3。因此,优选含有赖氨酸(K)或组氨酸(H)的6聚体。本领域的技术人员将会理解这里所提供的配基不限于具有表2所示示范性序列的那些配基。
表2
可结合SEQ ID NO:2的6-氨基酸序列
SEQ ID NO | 序列 |
14 | RPWKKAA |
15 | PKHIWPA |
16 | HKLWGVA |
17 | GGYKPYA |
18 | ENVSQNA |
19 | HTYYNGA |
20 | KKKSDHA |
21 | HHLKGTA |
22 | KKHGVWA |
在第三个优选的实施方案中,配基是具有可结合SEQ ID NO:3的氨基酸序列的蛋白或肽。在下表3中所示的氨基酸序列(SEQ ID NO:23-31)是可结合SEQ ID NO:3的氨基酸序列的实例。因此,在第三个优选实施方案的配基中包括了具有表3所示序列中的一个或多个序列的配基。在6聚体文库中筛选可结合SEQ ID NO:3的6聚体,鉴定出了在表3中所示的氨基酸序列。用丙氨酸(A)作为树脂和文库的组合肽之间的间隔子来构建文库,在序列中表示为最后的A。若在鉴定中序列并不明确,在表中则针对单个位置给出一个或多个氨基酸,例如,如在SEQ ID NO:29中所示的(A/G)。这些序列中组氨酸(H)出现10次,在8种肽中的6种中均存在,明显高于平均分布值-3。除了SEQ ID NO:23之外的所有肽在pH 7时有净正电荷。因此,优选含有组氨酸(H)的6聚体和在pH 7时带有净正电荷的肽。本领域技术人员将会理解这里所提供的配基不限于具有在表3中所示示范性序列的那些配基。
表3
结合SEQ ID NO:3的6-氨基酸序列
SEQ ID NO | 序列 |
23 | DGTQAHA |
24 | APHRNNA |
25 | HHGHNIA |
26 | HTWHGQA |
27 | HVFVTWA |
28 | THHFYIA |
29 | KLGWG(A/G)A |
30 | GSKKKEA |
在第四个优选的实施方案中,配基是具有可结合SEQ ID NO:4的氨基酸序列的蛋白或肽。在下表4中所示的氨基酸序列(SEQ ID NO:31-47)是可结合SEQ ID NO:4的氨基酸序列的实例。因此,在第四个优选实施方案的配基中包括了具有表4中所示序列中的一个或多个序列的配基。在6聚体文库中筛选可结合SEQ ID NO:4的6聚体,鉴定出了表4中所示的氨基酸序列。用丙氨酸(A)作为树脂和文库的组合肽之间的间隔子来构建文库,在序列中表示为最后的A。本领域的技术人员将会理解这里所提供的配基不限于具有表4中所示示范性序列的那些配基。若在鉴定中序列不明确,则在单个位置给出一个或多个氨基酸,例如SEQ ID NO:33中所示的(W/G)。不能明确鉴定出SEQ ID NO:37中第二位的氨基酸。序列“LL”(两个亮氨酸)出现在SEQ ID NOS:31,32,41,43和45中,其密切的类似物LI,VL,II(异亮氨酸或缬氨酸)出现在SEQ ID NOS:33,36,38,40和44中。LL不出现在朊病毒衍生肽或蛋白的任何其它筛选中。此外,17种肽中的15种含有芳香族氨基酸,如苯丙氨酸、色氨酸或酪氨酸(F,W或Y)。7种肽序列呈电荷中性,但具有带正电的末端氨基。因此,优选在序列中含有一个或多个亮氨酸(L)或亮氨酸类似物、如异亮氨酸或缬氨酸(I或V)(优选LL,LI,VL或II)的6聚体;含有芳香族氨基酸如苯丙氨酸、色氨酸或酪氨酸(F,W或Y)的6聚体;以及呈电荷中性、但具有带正电的末端氨基的六聚体。
表4
可结合SEQ ID NO:4的6-氨基酸序列
SEQ ID NO | 序列 |
31 | PLLVVWA |
32 | WLLVGGA |
33 | (W/G)QVLVYA |
34 | RRHQRQA |
35 | LPWTFGA |
36 | IFIIITA |
37 | P(X)IEPHA |
38 | EWGIIWA |
39 | GWYIYFA |
40 | TLILFHA |
41 | FLLSNHA |
42 | WQIRFFA |
43 | VLLVFEA |
44 | GWVLEIA |
45 | FLLIDTA |
46 | GFLFKFA |
47 | PWTIYIA |
结合仓鼠PrPc的配基
在另一个实施方案中,配基是以特异性和选择性结合在特定物种、例如人类或其它哺乳动物(如仓鼠)中发现的一种或多种形式的朊病毒蛋白的肽。下面提供了结合朊病毒蛋白(PrPc)的示范性配基,所述配基具有不同的氨基酸序列长度,2聚体,3聚体,4聚体,5聚体和6聚体,优选具有6kDa或更低的分子量。
在SEQ ID NOS:48-50中显示了可结合仓鼠天然朊病毒(haPrPc)的示范性二聚体配基,其列于表5A中。配基优选含有色氨酸(W)。优选的配基是电荷中性的,但在pH 7时具有带正电荷的末端氨基。优选的配基是含有色氨酸(W)的2聚体。萘基-丙氨酸(na)取代色氨酸也导致这些序列中PrP的结合。将文库直接合成在树脂(Toyopearl氨基树脂Tosoh Bioscience LLC,Monctgomerville,PA)上,没有间隔子。在筛选中2次(2x)发现SEQ ID NO:50。
表5A
结合haPrPc的2-氨基酸序列
SEQ ID NO | 序列 |
48 | WH |
49 | WW |
50 | LW(2x) |
2x表示筛选中发现2次的序列
在SEQ ID NOS:51-61中显示了可结合仓鼠朊病毒(haPrPc)的示例性3聚体配基,其列于表5B中。芳香族氨基酸F,W或Y出现在除了SEQ ID NO:60之外的所有选择出的肽中。氨基酸A在最靠近树脂的位置出现3次,并在一些文库中用作树脂和肽文库之间的间隔子。R和K都不存在,但是E出现3次,为8种序列中的3种提供负电荷。
图5B
可结合haPrPc的3-氨基酸序列
SEQ ID NO | 序列 |
51 | WNA |
52 | EFW |
53 | LPW |
54 | YEY |
55 | WPA |
56 | FNQ |
57 | YHE |
58 | LFA |
59 | NHY |
60 | TLG |
61 | WVD |
在SEQ ID NOS:62-64中显示了可结合仓鼠朊病毒(haPrPc)的示范性4聚体配基,其列于表5C中。用在树脂和组合肽之间的丙氨酸间隔子构建文库,该丙氨酸出现在下面序列中的最后位置。芳香族氨基酸出现在所有所选肽的第一个位置处。另外,所有选择的肽在第3或第4位置上含有酸性氨基酸(D或E)。WXD出现1次,其中X是任何氨基酸。
表5C
可结合haPrPc的4-氨基酸序列
SEQ ID NO | 序列 |
62 | YWDQA |
63 | YVHEA |
64 | WFDEA |
在SEQ ID NOS:65-68中显示了可结合仓鼠朊病毒(haPrPc)的示范性5聚体配基,其列于表5D中。芳香族氨基酸和酸性氨基酸出现在所有选择的肽中。D或E出现在所有配基的第4或5位上。序列WXD出现在SEQ ID NO:65,67和68中。
表5D
可结合haPrPc的5-氨基酸序列
SEQ ID NO | SEQUENCE |
65 | LQWYDA |
66 | YTHSEA |
67 | WIDYEA |
68 | VWIDAA |
在SEQ ID NOS:69-100中显示了结合仓鼠朊病毒(haPrPc)的示范性6聚体配基,其列于表5E中。构建在树脂和组合肽之间有丙氨酸间隔子的文库,该丙氨酸在下面序列中存在于最后位置处。芳香族氨基酸F,W或Y出现在几乎全部(32个中的29个)所选的肽中,D或E也一样(32个中的29个)。另外,20个肽在其序列中有2个芳香族氨基酸。共有序列“WXD”出现在SEQ ID NOS:75,79,83,86和89中。含有(F/W/Y)X(D/E)(F/W/Y)SEQ ID NO:))的序列出现在SEQ IDNOS:71,73,77,78,91和95中,(F/W/Y)(D/E)X(F/W/Y)SEQ ID NO:))出现在SEQ ID NOS:70,72,82,91和95中。32个肽中的24个肽在1-3位上有芳香族氨基酸,外加酸性基团;23个在4-6位上有净负电荷。20个肽既在1-3位上有芳香族氨基酸外加酸性氨基酸,又在4-6位上有净负电荷。
表5E
结合haPrPc的6-氨基酸序列
SEQ ID NO | 序列 |
69 | WDEAEEA |
70 | YDSYDDA |
71 | NDFIDFA |
72 | YEPWGSA |
73 | EYGDWWA |
74 | WDYDQEA |
75 | DWGDPFA |
76 | DWPEVWA |
77 | FHDFSEA |
78 | DTFWDYA |
79 | WNDLDNA |
80 | ASALVYA |
81 | LINAGGA |
82 | WESYVTA |
83 | WSDEGYA |
84 | YRWTGPA |
85 | YEDQWQA |
86 | EWADDNA |
87 | YEIDYGA |
88 | EFGYFDA |
89 | WGDEQDA |
90 | HEEDWAA |
91 | FEDFELA |
92 | TWGIDEA |
93 | WDPTDYA |
94 | NDKIHTA |
95 | FEDFFSA |
96 | YEWAEQA |
97 | THVYFLA |
98 | (S/T/W)XDFSDA |
99 | YRTPNEA |
100 | (G/L)RSETA |
结合仓鼠PrPc和仓鼠PrPsc的配基
在另一个实施方案中,配基是以特异性和选择性结合两种或多种形式的朊病毒的肽。下面提供了可结合(PrPc)和/或构象改变的(PrPsc)朊病毒蛋白的配基。在SEQ ID NOS:101-115中显示了可结合仓鼠朊病毒(haPrPc)的示范性3聚体配基,其列于表6中。芳香族氨基酸出现在几乎全部(18个中的15个)所选的肽中,D或E也一样(18个中的15个)。另外,7个肽有两个芳香族结构和一个酸性氨基酸。序列WXD出现在SEQ ID NOS:105和115中。所选的结合PrPsc比结合PrPc优先的结构是SEQ ID NOS:111和SEQ ID NO:114,两者在位置3处都有R。在3聚体文库中鉴定了SEQ ID NO:101-115可结合来自感染瘙痒病的脑的匀浆物本身(*)或其与正常仓鼠脑的混合物中的haPrPc和/或PrPsc。
表6
结合haPrPc和haPrPsc的3-氨基酸序列
结合人PrPc的配基
下面提供了可结合(huPrPc)朊病毒蛋白的配基。在SEQ ID NOS:116-139中显示了可结合人朊病毒(haPrPc)的示范性3聚体配基,其列于表7A和B中。在三聚体序列(表7A)中,W/YXD在6个三聚体序列中的4个中出现,且6个序列中的5个有疏水性和酸性氨基酸残基。
表7A
结合huPrPc的3-氨基酸序列
SEQ ID NO | 序列 |
116 | HWD |
117 | WQD |
118 | WDD |
119 | WED |
120 | ITN |
121 | YED |
用树脂和组合肽之间的丙氨酸间隔子构建6聚体文库,该间隔子在下面序列中处于最后位置(表7B)处。氨基酸F,W或Y出现在18个6聚体肽中的13个,D或E出现在18个肽中的17个内。6个肽在1-3位上有芳香族和酸性氨基酸,而且在4-6位上也是净负电荷。另外,5个肽有2个芳香族结构和一个酸性氨基酸。WxD存在于SEQ ID NO:124中,(F/W/Y)x(D/E)(F/W/Y)(SEQ ID NO:223)存在于SEQ ID NOS:124和133中。除N-末端氨基电荷外,大多数序列具有负电荷,仅SEQ ID NO:139在中性pH携带部分净正电荷。在3聚体文库中鉴定了SEQ ID NOS:116-121可结合正常人脑匀浆物中的huPrPc。在6聚体文库中鉴定了SEQ ID NOS:122-139可结合缺乏血小板的人血浆或富含血小板的人血浆(*)来源的huPrPc。
表7B
结合huPrPc的6-氨基酸序列
SEQ ID NO | 序列 |
22 | VADEEA |
23 | YYVDAA |
24 | QDFNLA |
25 | DNPIDA |
26 | FNEHEA |
27 | WGADGA |
28 | VIYSHA |
29 | HILEEA* |
30 | PHENFA* |
31 | EDNGGA |
32 | DSEGPA |
33 | FQEFTA |
34 | EGDEIA |
35 | IYAETA |
36 | RVRETA |
37 | EEPQWA* |
38 | EGEEFA* |
39 | T/L)FNIHA* |
*结合富含血小板的血浆来源的huPrPc
结合人重组PrP的配基
下面提供了可结合重组朊病毒蛋白(PrPr)的配基。在SEQ ID NOS:54,105,140-153中显示了可结合重组人朊病毒(huPrPr)的示范性3聚体配基,其列于表8中。氨基酸W,F或Y出现在所有选取的16个肽中,D或E出现在16个肽的13个中。共有序列WXD出现在SEQ ID NOS:105,143和145中。一些肽以前被鉴定出可结合PrPc,SEQ ID NOS:149和153在本次筛选中两次被鉴定出来。在3聚体文库中鉴定了SEQ IDNOS:54 105,140-153可结合用(*)0.5%十二烷基肌氨酸钠或(**)PBS稀释的huPrPr(Prionics AG,Switzerland,Cat.#03-040)。在表8中,每柱中将2.5mg干重的组合文库的树脂接触稀释在0.5%十二烷基肌氨酸钠(*)或含有1%BSA的磷酸缓冲盐水(**)稀释的0.5μg/mlPrPr。在筛选中2次发现的序列表示为2x。
表8
与huPrPr结合的3-氨基酸序列
SEQ ID NO | 序列 |
54 | YEY** |
105 | WQD*和**(2x) |
140 | YDW* |
141 | NYT* |
142 | SYT* |
143 | WAD* |
144 | QWG* |
145 | WGD* |
146 | EYF* |
147 | WEH* |
148 | LYD* |
149 | DYY**(2x) |
150 | FYE** |
151 | EYY** |
152 | YDY** |
153 | WDH**(2x) |
(*)用0.5%十二烷基肌氨酸钠稀释的人PrPr
(**)用PBS稀释的人PrPr
2x表示在筛选中发现2次的序列
结合人PrPc,人PrPsc或二者的6聚体配基
表9A中提供了结合朊病毒蛋白(PrPc)、构象改变的朊病毒蛋白(PrPsc)或二者的6聚体配基。用树脂和组合肽之间的丙氨酸间隔子构建6聚体文库,该间隔子在下面序列中处于最后位置处。该配基可优先结合huPrPsc。在SEQ ID NOS:154-173中显示了示范性配基,其列于表9A中。除了SEQ ID NO:156外,所有配基都含有芳香族氨基酸,20个肽中的15个含有酸性氨基酸。那些对huPrPsc的特异性比PrPc的特异性更高的是SEQ ID NO:154,155和156。通过在将蛋白从珠转移到膜上之前对PrPc的选择性蛋白水解可检测对散发CJD患者来源的脑匀浆物中PrPsc的特异性增高的配基。这种文库包括非天然芳香族氨基酸2-萘基-丙氨酸(na)。
表9A
结合huPrPc,huPrPsc或二者的6-氨基酸序列
SEQ IN NO | 序列 |
154* | RES(na)NVA |
155* | ES(na)PRQA |
156* | VARENIA |
157* | RWEREDA |
158** | EWWETV |
159** | SVYQLDA |
160** | (na)HEFYGA |
161** | HE(na)(na)LVA |
162** | A(na)VPV(na)A |
163** | YFDYWLA |
164** | FE(na)HRQA |
165** | WRHEPAA |
166*** | SS(na)KKDA |
167*** | R(na)DKEAA |
168**** | (na)HEIFPA |
169**** | KWYHHRA |
170**** | HWWPHNA |
171**** | HWQVFYA |
172**** | FHE(na)EIA |
173**** | HADF(na)QA |
*未用PK处理的0.5%散发CJD(huPrPsc)脑匀浆物
**未用PK处理的5%huPrPsc脑匀浆物
***用PK处理、但未显色的0.5%huPrPsc脑匀浆物
****用PK处理、但未显色的5%huPrPsc脑匀浆物
na表示2-萘基-丙氨酸
结合人PrPsc的配基
下面提供了可结合构象改变的朊病毒蛋白(PrPsc)的配基。用在树脂和组合肽之间的丙氨酸间隔子构建6聚体文库,所述间隔子在下面序列中处于最后位置。在SEQ ID NOS:174-194中显示了示范性配基,其列于表9B中。SEQ ID NOS:188,189,190和191都显示信号的最大差异(白色和强光信号)。在6聚体文库中鉴定了SEQ ID NOS:174-194,其可结合掺入到人血浆中的散发CJD患者脑匀浆物的huPrPsc。含有对PrPsc具有最大特异性的配基的珠对PrPc染色是白色的,但是在变性之后产生强化学发光信号。
表9B
结合huPrPsc的6-氨基酸序列
SEQ ID NO | 序列 |
174* | ALHFETA |
175* | DDPTGFA |
176* | VAPGLGA |
177* | IFRLIEA |
178* | GLERPEA |
179* | IVVRLWA |
180* | WHNPHYA |
181* | LIYKSDA |
182** | EKPIFNA |
183** | HWSEPAA |
184** | GHNWKEA |
185** | YWHHDDA |
186** | GYPKENA |
187** | PVYWLYA |
188*** | FGEHTPA |
189*** | FQGTREA |
190*** | TGTNRYA |
191*** | KWATRYA |
192*** | NSTKFDA |
193*** | LIYKEEA |
194*** | EHATYRA |
*用经PK处理的散发CJD脑来源的脑匀浆物(huPrPsc)筛选的100-300μm珠
*用未经PK处理的huPrPsc筛选的100-300μm珠
***用未经PK处理的huPrPsc筛选的65μm珠
结合人PrPc,人PrPsc或二者的3聚体配基
下面提供了可结合朊病毒蛋白(PrPc)、构象改变的朊病毒蛋白(PrPsc)或两者的3聚体配基。配基可优先结合huPrPsc。在SEQ ID NOS:195-212中显示了示范性配基,其列于表9C中。在这个筛选中,将散发CJD脑匀浆物在CPD中稀释,并用作huPrPsc的来源。在这个筛选中3次发现HYD。红色珠表示结合PrPc;13个序列中有8个含有H。在所有13个序列中都发现氨基酸F、W或Y,而R或K只出现1次。相对于PrPc(白色珠)而优先结合PrPsc(强信号)的5个珠中有3个含有K或R。WXD出现在SEQ ID NOS:200和208中。在3聚体文库中鉴定了SEQ ID NOS:195-212可结合经PK处理的huPrPc和/或huPrPsc。
表9C
结合huPrPc、huPrPsc或两者的3-氨基酸序列(耐受PK)
SEQ ID NO | 序列 |
195* | HND |
196* | HER |
197* | HGD |
198* | HSD |
199* | HFD |
200**** | WND |
201**** | YEH |
202**** | HWD |
203**** | YHD |
204**** | YDW |
205**** | WDY |
206** | HYD(3x) |
207** | HWD |
208** | WTD |
209*** | FPK |
210*** | HWK |
211*** | WEE |
212*** | LLR |
*在0.05%十二烷基肌氨酸钠中的0.5%huPrPsc,经PK处理
**在0.1%十二烷基肌氨酸钠中的1.0%huPrPsc,未经PK处理
***在0.1%十二烷基肌氨酸钠中的1.0%huPrPsc,经PK处理
****转移前从凝胶中选择珠;对于SEQ ID NOS:204和205,在洗涤和直接从凝胶中取出之后,对在0.01%十二烷基肌氨酸钠中的经PK处理的0.1%huPrPsc孵育的珠进行选择。
结合人PrPc、人PrPsc或两者的3聚体配基
下面提供了可结合朊病毒蛋白(PrPc)、构象改变的朊病毒蛋白(PrPsc)或两者的3聚体配基。配基可优先结合huPrPsc。在SEQ ID NOS:147,152,206,213,和214中显示了示范性配基,其列于表9D中。在3聚体文库中鉴定出了这些序列,用于结合在(*)CPD缓冲液或(**)PBS中稀释的散发CJD脑匀浆物的huPrPsc和/或huPrPc。
表9D
结合huPrPc、huPrPsc或两者的3-氨基酸序列
SEQ ID NO | 序列 |
147* | WEH |
152* | YDY |
206* | HYD |
213** | SYF |
214** | EYY |
(*)在CPD缓冲液中稀释的散发CJD脑匀浆物
(**)在PBS缓冲液中稀释的散发CJD脑匀浆物
配基的合成
这里所描述的配基可通过化学合成生产。许多蛋白合成方法在现有技术中是常用的,包括应用肽合成仪的合成。参见例如PeptideChemistry,A Practical Textbook,Bodasnsky,编辑.Springer-Verlag,1988;Merrifield,Science 232:241-247(1986)。优选地,合成肽,纯化,然后偶联到树脂或膜上用于筛选。可选择地,在树脂上直接合成肽,然后纯化树脂结合型肽。
纯化肽,使得它们基本上没有在标准肽纯化技术中所使用的化学前体或其它化学物质。表述“基本上没有化学前体或其它化学物质”包括肽的制品,其中肽已与在肽合成中所涉及的化学前体或其它化学物质分离开。
肽的化学合成便于修饰的或非天然氨基酸的掺入,包括D-氨基酸和其它小的有机分子。通过用相应的D-氨基酸同I型置换肽中一个或多个L-氨基酸,可以增加肽对酶促水解作用的抗性,以及提高活性肽的一个或多个特性,如朊病毒或配基结合。这里所描述的朊病毒肽和肽配基可以是L-或D-氨基酸或者两者组合的多聚体。也包括其中本文所述的肽配基类似物存在于非肽酰键中的配基。
例如,在各种的实施方案中,肽配基是D-逆-反向(D-retro-inverso)异构体肽。术语“逆-反向异构体(retro-inverso isomer)”指线性肽的异构体,其中序列的方向被颠倒并且倒转每个氨基酸残基的手性。参见例如Jameson等,Nature,368:744-746(1994)。D-对映异构体和反向合成结合的净结果是每个酰胺键中羰基和氨基的位置发生互换,而每个α-碳处的侧链基团的位置保持不变。除非另外说明,据推测本发明的任何给定L-氨基酸序列都可被制成D-逆-反向(retro-inverso)异构体肽。
可将额外的共价交联引入到肽序列中,以约束肽主链的结构。这种策略可用于开发效力、选择性和稳定性增强的肽类似物。通常通过在肽N和C末端之间、在侧链和N或C末端之间(例如在pH 8.5用K3Fe(CN)6处理;Samson等,Endocrinology,137:5182-5185(1996))或在两个氨基酸侧链之间形成酰胺键来进行大环化。参见例如DeGrado,Adv.Protein Chem.,39:51-124(1988)。
为了改善其效力、稳定性和选择性,许多其它方法也可将构象约束引入到肽序列中。这些方法包括使用Cα-甲基氨基酸(参见例如Rose等,Adv.Protein Chem.,37:1-109(1985))或Nα-甲基氨基酸(参见例如Aubry等,Int.J.Pept.Protein Res.,18:195-202(1981))。
如果需要的话,两个或多个肽配基可以多拷贝存在。可存在一个或多个肽的相同拷贝(例如均二聚体,均三聚体等),或者可存在序列上不同的肽的多个拷贝(例如杂二聚体,杂三聚体等)。
在另一个可供选择的方法中,使用重组核酸方法合成配基。通常,这涉及产生编码配基的核酸序列,将核酸置于表达盒中处于特定启动子的控制下,在宿主中表达蛋白,分离所表达的蛋白,以及如果需要,这使蛋白复性。本技术领域技术人员熟知足以指导技术人员进行这种方法的技术。
一旦得到表达,则可根据标准方法纯化重组配基,包括硫酸铵沉淀、亲和柱、柱层析、凝胶电泳等。优选约50到95%均一的基本上纯的组合物用作治疗性试剂,最优选大约80到95%或更高均一度的组合物。
可选择地,将配基合并成嵌合蛋白。典型地,通过重组或合成技术将配基中的2到20种融合成单一多肽中。
在重组方法中,通过连接编码免疫原性肽的合成或重组核酸制备嵌合蛋白。可用酶促(例如,使用DNA连接酶)或合成法连接这些核酸。可选择地,可合成编码多个配基肽的单一核酸。在任一实例中,所得到的核酸将编码多个配基,它们都处在相同的读框中。因此,翻译的多肽包含朊病毒结合配基。
若通过自动化学合成方法制备配基,则可直接偶联肽的多联体。这可通过使用标准化学方法将肽连接起来而以化学方式进行。可选择地,可以合成生产编码多配基肽的多肽。
配基鉴定
除了在上述表格中所示的配基外,可根据下列方法鉴定另外的配基。合成肽文库,对其筛选结合朊病毒分析物的能力。配基可以是任何长度。然而,优选长2到6个氨基酸。将合成的肽固定在珠上,将珠填充到层析柱中。然后使朊病毒分析物通过柱,使用常规方法,如通过对朊病毒蛋白特异的标记抗体,检测结合的分析物。有分析物结合其上的珠被鉴定为合适的配基。
使用配基除去朊病毒
结合朊病毒或朊病毒片段的配基可用于多种分析、制备和诊断应用中。可将朊病毒结合配基固定在支持物如珠或膜上,用于结合或除去样品中的朊病毒。在足以形成朊病毒-配基复合物以及样品中的朊病毒蛋白结合配基的条件下,使结合了配基的固相接触样品,如生物学流体。然后将固相与样品分离,从而从样品中除去结合到附着于固相的配基上的朊病毒蛋白。例如,用于除去污染物的树脂和膜在现有技术中是公知的,如在美国专利No.5,834,318(Baumbach等)和PCT/USO 1/11150中所描述的那些。
生物学样品的例子包括、但不限于血液、血源性组合物或血清。另外的生物学样品包括脑脊液、尿液、唾液、乳汁、导管液、泪液或精液。其它的样品可包含胶原、脑和腺体提取物。
在现有技术已知许多将分子固定到各种固体表面的方法。例如,固体表面可以是膜(例如,硝酸纤维)、微量滴定皿(例如,PVC、聚丙烯或聚苯乙烯)、试管(玻璃或塑料的)、dipstick(例如,玻璃、PVC、聚丙烯、聚苯乙烯、乳胶等)、微量离心管、或者玻璃、二氧化硅、塑料、金属或聚合物珠。期望的成分可共价结合,或通过非特异性结合而非共价附着。
很多种有机和无机聚合物(包括天然的和合成的)都可用作固体表面的材料。可作例证的聚合物包括聚乙烯、聚丙烯、聚(4-甲基丁烯)、聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸酯、聚丙烯酸酯、聚(对苯二甲酸亚乙酯)、人造丝、尼龙、聚丁酸乙烯酯、聚偏二氟乙烯(PVDF)、硅氧烷、聚甲醛、纤维素、乙酸纤维素、硝酸纤维素等。可使用的其它材料包括纸、玻璃、陶瓷、金属、类金属(metalloid)、半导体材料、水泥等。另外,可使用形成凝胶的材料,如蛋白(例如,明胶)、脂多糖类、硅酸盐、琼脂糖以及聚丙烯酰胺。形成几种水相的聚合物,如葡聚糖、聚(亚烷基)二醇,或表面活化剂,如磷脂,长链(12-24碳原子)烷基铵盐等也是合适的。若固体表面多孔,则视系统的性质可使用各种孔径大小。另外,可在固体表面的聚合期间掺入肽。
在制备表面中,可使用多种不同材料,例如片层,以获得各种性质。例如,可使用蛋白涂层,如明胶,以避免非特异性结合,简化共价缀合,以及增强信号检测等。
如果期望化合物和表面之间发生共价结合,则表面通常将会是多功能性的,或是能够被多功能化。可在表面上存在且用于连接的官能团可包括羧酸、醛、氨基、氰基、烯类基团、羟基、巯基等。将很多种化合物连接到各种表面上的方式在现有技术中是公知的,并且已被充分阐明。
也可以通过亲和层析将朊病毒蛋白与样品中的其它蛋白分离开。根据本发明的配基可以附着到固体支持物,如树脂或膜上,并用于结合和从溶液中除去朊病毒。在这种情况下,配基可偶联到固体支持物,例如惰性支持物如膜或树脂上,朊病毒蛋白和固定化的试剂结合。可通过抗体的手段检测固定化试剂/朊病毒。如果期望的话,可将从初步筛选中获得的一个或多个序列固定在树脂如聚甲基丙烯酸酯或琼脂糖上。可使用的其它类型的树脂包括例如琼脂糖凝胶、交联的琼脂糖、复合交联的多糖、硅藻土、PVDF、丙烯酸酯、聚苯乙烯和纤维素。也可使用膜,如尼龙和纤维素。树脂可以是聚甲基丙烯酸酯树脂。
使用配基检测朊病毒
这里所描述的配基也可用于检测生物学样品中朊病毒蛋白的存在或对其定量的方法中。在足以使朊病毒蛋白和配基之间形成复合体的条件下,将生物学样品,例如、但不限于上面所列出的那些和配基接触。然后通过常规的方法检测复合体,从而检测生物学样品中朊病毒的存在情况。
通过标记配基,使标记的配基和样品结合,以及检测标记的配基-朊病毒复合体,从而检测复合体。在配基产生期间、如在肽合成期间标记配基,或者通过将其与配基共价或非共价地连接而将标记与配基缀合。可选择地,标记对配基特异的结合分子,如抗体,并间接检测复合体。已知有很多种标记和缀合技术,它们在科技和专利文献中被广泛报道。合适的标记包括放射性核苷酸、酶、底物、辅因子、抑制剂、荧光部分、化学发光部分、磁性颗粒等。
检测可通过任何已知方法进行,如免疫印迹、Western分析、凝胶迁移率变动分析、荧光原位杂交分析(FISH)、放射活性或生物发光标记示踪、核磁共振、电子顺磁共振、停流光谱术、柱层析、毛细管电泳、或其它基于大小或电荷或两者的改变而追踪分子的方法。在测定中使用的具体标记或可检测的基团不是本发明的关键方面。可检测的基团可以是具有可检测的物理或化学性质的任何材料。这些可检测的标记已得到充分开发,总的来说,可将在这些方法中有用的任何标记应用于本发明的方法中。因此,标记是通过分光术、光化学、生物化学、免疫化学、电学、光学或化学方法可检测到的任何组成。在本发明中有用的标记包括荧光染料(例如,异硫氰酸荧光素、德克萨斯红、罗丹明等)、放射标记(例如,3H、125I、35S、14C或32P)、酶(例如,LacZ CAT、辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶和其它在EIA或在ELISA中通常用作可检测酶的酶类)、显色标记如胶体金或有色玻璃或塑料(例如,聚苯乙烯、聚丙烯、乳胶等)珠。可根据本领域公知的方法将标记直接或间接偶联到试验中的期望组分上。如上所指出的,可使用很多种标记,其中标记的选择依所需的灵敏度、化合物缀合的难易、稳定性的需要、可用的仪器、以及处理规定而定。
常常通过间接方式附着非放射活性标记。一般而言,将配基分子(例如,生物素)共价结合到分子上。然后配基结合抗配基(例如链霉亲和素)分子,其本身是可检测的或共价结合到信号系统上,如可检测的酶、荧光化合物或化学发光化合物。可使用许多配基和抗配基。若配基有天然的抗配基,例如生物素、甲状腺素和皮质醇,则其可与标记的天然抗配基联合使用。可选择地,可将任何半抗原或抗原化合物与抗体结合使用。
也可将分子直接缀合产生信号的化合物,例如缀合酶或荧光基团。作为标记的感兴趣的酶将主要是水解酶,尤其是磷酸酶、脂酶和糖苷酶,或者氧化还原酶,尤其是过氧化物酶。荧光化合物包括荧光素及其衍生物、罗丹明及其衍生物、丹酰、伞形酮(umbelliferone)等。化学发光化合物包括荧光素和2,3-二氢酞嗪二酮(2,3-dihydrophthalazinediones),例如鲁米诺(luminol)。
检测标记的方法是本领域技术人员公知的。因此,例如,若标记是放射活性标记,则检测的方法包括闪烁计数器,或在放射自显影中使用照相胶片。若标记是荧光标记,则其可通过用适当波长的光激发荧光染料并检测得到的荧光,例如通过显微镜、视觉检查、通过照相胶片、通过使用电子探测器如电荷偶联装置(CCDs)或光电倍增管等来检测。类似地,通过提供酶的适当底物并且检测得到的反应产物可检测酶标记。最后,可通过简单地观察与标记有关的颜色而检测简单的显色标记。因此,在各种试纸条(dipstick)测定中,缀合的金常常呈现粉红色,而不同的缀合珠则呈现珠的颜色。
本发明的配基也可用于检测从固体材料中提取到溶液中的靶。例如,固体样品可用水性、有机溶剂或临界流体提取,可将得到的上清液与配基接触。固体样品的实例包括动物源性产品,特别是已接触传播朊病毒的介质的产品,例如来自牛来源的骨粉。在一些实施方案中,配基可用于检测土壤中是否存在朊病毒蛋白。其它固体样品包括脑组织、角膜组织、粪便物、骨粉、牛肉副产品、绵羊、绵羊副产品、鹿和麋鹿、鹿和麋鹿副产品、以及其它动物和动物来源产品。
可选择地,朊病毒-配基复合体可用PK处理。PrPc对PK高度敏感,而PrPsc被部分消化而形成PrPres。PrPres分子本身高度抗蛋白水解。因此,PK处理将消化PrPc,并且将PK敏感型PrPsc转化为PrPres。除去PK后,可将PrPres变性并通过抗体如3F4检测。
在另一个实施方案中,根据本发明的配基可用于优于PrPc而选择性浓缩PrPsc。
使用配基对朊病毒定量
配基-朊病毒复合体,或者可选择地,针对配基或配基-朊病毒复合体的抗体可通过本领域技术人员公知的许多方法中的任何一种进行检测和定量。这些方法包括分析性生物化学方法,如分光光度法、放射术、电泳、毛细管电泳、高效液相层析(HPLC)、薄层层析(TLC)、高扩散层析等,以及各种免疫学方法如流体或凝胶沉淀反应、免疫扩散(单相或双相)、免疫电泳、放射免疫测定(RIAs)、酶联免疫吸附测定(ELISAs)、免疫荧光测定等。
减少非特异性结合
本领域的技术人员将会意识到常常期望在试验中和在从样品中除去分析物期间减少非特异性结合。若试验涉及固定在固体基质上的配基或其它捕获剂,则期望将与固体材料非特异性结合的量减少到最低。减少这种非特异性结合的方法是本领域技术人员公知的。典型地,这涉及用蛋白质性组成包被基质。具体地,已广泛地应用了蛋白质组合物,如牛和人血清白蛋白(BSA)、脱脂奶粉以及明胶。
其它测定形式
也可使用蛋白印迹分析检测样品中是否存在朊病毒蛋白以及定量。该技术通常涉及在SDS存在时基于分子量而通过凝胶电泳分离样品产物,将被分离的蛋白转移到合适的固体支持物(如硝酸纤维素滤膜,尼龙滤膜或衍生化的尼龙滤膜)上,以及用这里所描述的配基孵育被结合的样品。配基特异性结合固定在固体支持物上的朊病毒肽。直接标记这些配基,或者可变通地,可随后使用特异性结合配基的标记抗体进行检测。
其它测定形式包括脂质体免疫测定(LIAs),其使用设计成结合特异性分子(例如,配基)并释放包被的试剂或标记的脂质体。然后根据标准技术检测所释放的化学物质。
药物组合物
这里所描述的配基可用于治疗由朊病毒微生物感染哺乳动物所导致的TSEs的治疗性和预防性应用中。例如,在一个实施方案中,提供了通过向哺乳动物施用有效量的含有药学上可接受的载体和本文所述的合成或分离配基的药物组合物,从而治疗哺乳动物TSE s的方法。配基可通过抑制PrPsc结合PrPsc而防止PrPsc的聚合。另外,它可防抑制PrPsc结合PrPc,从而降低PrPsc介导的PrPc向PrPsc的转化,因此延迟临床症状的发生。而且,配基本身可通过添加反应性试剂而进行修饰,以使该分子靶向PrPsc聚集的部位。这种组合物适合于在各种药物输送系统中使用。
将根据该方法治疗的疾病包括、但不限于BSE、感染性貂脑病、猫海绵状脑病、CWD、CJD、GSS、致命性失眠症、以及vCJD。
药物组合物可经肠胃外、局部、口服或局部施用。优选地,经肠胃外施用该药物组合物,例如静脉内、皮下、真皮内、鼻内或肌内。因此,本发明提供了施用的组合物,其中包含在可接受的载体(优选水性载体)中溶解或悬浮的上述试剂的溶液。可使用多种水性载体,例如水、缓冲水、0.4%盐水、0.3%甘氨酸、透明质酸、血纤蛋白粘合剂等。这些组合物可通过常规的公知灭菌技术灭菌,或者可过滤除菌。可包装或冷冻干燥所得到的水溶液,在施用前将冷冻干燥的制品与无菌溶液合并。组合物可根据需要而含有药学上可接受的辅助材料以接近生理条件,如pH调节和缓冲液剂、张力调节剂、润湿剂等,例如醋酸钠、乳酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、脱水山梨糖醇单月桂酸酯、油酸三乙醇胺等。
对于固体组合物,可使用常规的无毒性固体载体,其包括例如药学级的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、滑石粉、纤维素、葡萄糖、蔗糖、碳酸镁等。对于口服施用,可通过掺入通常使用的赋形剂中的任何一种,如前面所列举的那些载体,而形成药学上可接受的无毒性组合物,通常活性成分为大约1%到95%,更优选地为大约25%到75%的浓度。
对于气溶胶施用,优选以被很好隔开的形式与表面活性剂和推进剂一起提供多肽。表面活性剂当然必须是无毒性的,优选可溶于推进剂。这种试剂的代表是含有6到22个碳原子的脂肪酸的酯或部分酯,如己酸、辛酸、月桂酸、棕榈酸、硬脂酸、亚油酸、亚麻酸、olesteric和油酸与脂肪族多元醇或其环状酸酐的酯。可使用混合酯,如混合型或天然甘油酯。如果期望的话,也可包括载体,例如用于鼻内输送的卵磷脂。
施用的量将依据施用的材料、接受治疗的哺乳动物的状态以及施用的方式而变化。在治疗性应用中,向已经感染朊病毒的哺乳动物以足以抑制朊病毒传播或者至少部分阻止疾病的症状及其并发症的量施用组合物。将适于达到这个目的的量定义为“治疗有效剂量”。对于这个用途有效的量将会视疾病的严重程度、具体的组合物、以及接受者的体重和总体状态而定。一般而言,对一个大约70公斤的患者来说,剂量将在每天约1mg到约5mg的范围内,优选每天约100mg。
另外,可将编码配基的DNA或RNA引入到哺乳动物中,以获得对该核酸所编码配基的期望的治疗反应。
本发明将通过具体的实施例更详细描述。提供下面的实施例是为了说明目的,并非旨在以任何方式限制或定义本发明。
实施例1
朊病毒结合配基的鉴定
根据下列方法鉴定本文所示表中所描述的朊病毒结合配基:
肽文库合成:
可用于鉴定本文所述朊病毒结合配基的肽和肽文库使用以Buettner等1996年所描述的方法为基础的标准Fmoc化学,通过Peptides International(Louisville,KY)或CommonwealthBiotechnologies(Richmond,VA)直接在Toyopearl氨基树脂(TosoBioSep,Montgomeryville,PA)上合成。用上述方案所获得的肽密度通常在0.1-0.5毫摩尔/克树脂的范围内。合成了包括1,2,3,4,5和6个氨基酸的文库。4,5和6个氨基酸的文库在氨基Toyopearl上合成,其中含有tBoc和Fmoc丙氨酸的混合物作为氨基酸和树脂上的氨基之间的间隔子。肽从Fmoc丙氨酸开始合成,并tBoc是乙酰化的。经常在该文库的第一个位置发现存在“A”以及配基的氨基末端氨基酸。这很可能是由于在肽合成期间的部分脱酰、去保护作用和/或在测序期间的Edman降解所致。
在一些实施方案中,事先与含有PrP的溶液接触后,将每个都携带独特配基的多个拷贝的单个珠固定在琼脂糖内。由于可在珠的表面合成大量配基,因此有可能产生大量珠粒,其中理论上每个珠都带有独特配基。使用所描述的方法筛选这些配基用于起始引导物。一旦鉴定出了引导物,则基于引导物配基合成另外的配基(亚文库)。对这些亚文库的筛选可得到具有改良特性的额外配基。通过重复合成和筛选的过程,有可能鉴定出优选的配基。
肽文库结合筛选
将文库中不同量的珠(5-500mg干燥珠)置于Bio-抛弃型层析柱(Bio-Rad Laboratories,Cat.#732-6008)中,用20个柱体积(CV)的溶于水中的20%MeOH冲洗,以除去可能的杂质和肽合成中使用的有机溶剂。然后洗涤珠,用20CV的1x TBS,pH 7.6(通过将10x TBS稀释10倍制备1x TBS,BioSource International,Camarillo,CA Cat.#616US-000)平衡。然后停止水流,在1ml新鲜1x TBS中悬浮珠,让其再膨胀15分钟。通过重力排干TBS,关闭柱。为防止检测材料与树脂的非特异性结合,将添加了0.5%BSA(Sigma,Cat#A-7030)的溶于TBS的1ml BlockerTM酪蛋白溶液(Pierce,Rockford,11.Cat.#37532)加到珠上。在柱的两端覆盖后,在4℃轻轻振荡下封闭过夜。排干封闭液,向树脂中加入1ml含有PrPr、PrPc和/或PrPsc的检测材料。将柱的两端紧紧关闭,置入水平位置,室温下轻轻振荡3小时。排干含有PrP的材料,先用10ml含有0.05%Tween20的TBS、再用10ml TBS,在重力作用下驱动冲洗珠。
结合型PrPc的检测
使用在含有1%酪蛋白的TBS中1∶8,000稀释的小鼠单克隆抗体3F4(Signet,Dedham,MA)进行正常PrPc的检测。该单克隆抗体可结合haPrPc、huPrPc和huPrPr,但对haPrPsc或huPrPsc的亲和力极小或者没有;然而,它却结合变性的haPrPsc和huPrPsc。将1ml稀释的3F4抗体加入到来自事先接触过含有PrPc的材料的组合文库的珠中。在室温下将珠和3F4轻轻振荡1小时。排干含有未结合型抗体的溶液,用10ml TBS和含有0.1%Tween 20的10ml TBS冲洗珠。然后在0.5%酪蛋白/0.5%BSA的TBS中1∶2,000稀释的1ml碱性磷酸酶标记山羊抗小鼠IgG(γ)(KPL,Gaithersburg,MD Cat#741806)中孵育珠。在室温下轻轻振荡1小时进行孵育。排干含有未结合型二抗的溶液,并用10ml TBS和10ml T-TBS冲洗珠。然后,根据生产商所描述的方法制备1ml ImmunoPure Fast液,即碱性磷酸酶的底物(Pierce,Rockford,IL,cat#34034),并加到珠中。孵育在室温下进行约15分钟或者直到珠开始变为浅粉红色,几乎没有暗红色珠出现。排干底物溶液并用10ml TBS冲洗珠。
检测包埋在琼脂糖中的PrP结合珠
根据下列步骤进行在琼脂糖中包埋的PrP结合珠的鉴定。首先,通过用9ml溶解在水中的1%琼脂糖(Life Technologies,GrandIsland,NE,cat.#15510-027)覆盖49cm2盘的表面,制备琼脂糖的基层,所述琼脂糖已预先熔化并冷却至约60℃。使琼脂糖凝固。根据上面所描述的方法将珠和含有朊病毒蛋白的检验材料接触,并用TBS冲洗。其次,根据凝胶中珠的期望浓度而调整珠的浓度。发现珠在每毫升为1.9mg干重量时分布很好。将90μl珠浆液加到800μl已溶于水、熔化并冷却到40℃的0.5%低熔点琼脂糖(BioWhittaker,Rockland,ME cat.#50111)中。将混合物非常短暂地轻轻涡旋,并倒在基层的表面上。将含有PrP的材料的等分试样在其边角处直接置于凝胶中,作为下面步骤的阳性对照。使凝胶在4℃凝固。
在琼脂糖中包埋的PrP结合珠的化学发光检测
将珠包埋到凝胶中后,加入CDP-Star溶液(Applied Biosystems,Bedford,MA cat.#MS100R)以覆盖凝胶表面,然后根据生产商的指导手册中所描述的方法将其孵育5分钟。对凝胶中剩余的底物溶液排干,然后放入一个透明密封的塑料袋中,对放射自显影胶片曝光30分钟。胶片通过与凝胶中的红色珠进行点比对而鉴定出PrPc或PrPr的位置。这些胶片随后用于将胶片与在蛋白变性转移到硝酸纤维素膜后获得的额外胶片进行比对。
蛋白从包被的珠转移到确酸纤维素膜的方案
这种转移方法学从珠中洗脱蛋白,并通过毛细管作用将它们转移到硝酸纤维素膜或PVDF膜上。一张3MM滤纸发挥从槽中通过凝胶转移缓冲液(其可以是适合实验的具体需要的任何缓冲液)的作用。该3MM滤纸灯芯预先用转移缓冲液湿润,放在表面上,纸的末端浸在缓冲液槽中。将凝胶放到湿润的3MM上,软琼脂面朝上,确保在滤纸和凝胶之间没有气泡。将一张剪成凝胶大小的膜((ECL-标准硝酸纤维素Hybond Amersham,Germany,cat.#RPN303D)在转移液中湿润,并放置在凝胶的上面。用移液管在膜上滚动以除去气泡。然后将两张预先湿润的3MM纸放在膜上,用移液管滚动以除去气泡。将一叠干纸巾或其它吸收性纸放在顶部,压300g重量。可尽可能长地进行转移。
化学发光(ECL)检测方案
将膜从凝胶的顶部取下来,漂洗,置入含有10ml溶于加有Tween的TBS(T-TBS)的5%(w/v)脱脂奶粉(Giant Fod Inc.,Landover,MD)的塑料容器中。在4℃下将膜与奶粉轻轻振荡孵育长达16小时,或者室温下孵育2小时,以防止抗体和膜的非特异性结合。在用奶粉封闭后,将膜与10ml溶于含5%奶粉的加有Tween的TBS(T-TBS)、按1∶8000稀释的一抗3F4一起孵育。在室温(20℃-25℃)下继续轻轻振荡孵育1.5小时。然后弃去一抗溶液,用T-TBS漂洗膜2次,接着在T-TBS中洗涤15分钟,然后在新鲜的T-TBS中洗涤2次5分钟。所有的洗涤都在轻轻振荡下进行。然后将每张膜与10ml溶于含5%奶粉的T-TBS、以1∶10000稀释的辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗(KPL,Gaithersburg,MD)在室温下轻轻振荡孵育1.5小时。然后弃去二抗溶液,如上所述漂洗和洗涤膜。一些实验使用碱性磷酸酶标记的二抗用于检测一抗。
根据生产商的使用说明,通过制备“化学发光底物”(Supersignal,Pierce Rockford Il cat#34080)进行化学发光检测。将10毫升混合物加到每张膜上,蛋白质面朝上。用手轻轻旋转底物5分钟,将底物饱和的膜取出,并放在3MM滤纸上以快速吸干,然后包于SheetProtector(Boise Cascade Office Products,#L2A9113-NG)中。将膜的蛋白质面对放射自显影胶片曝光不同时间,使胶片显影。
对来自瘙痒病仓鼠脑的PrPsc特异的三聚体结合物的检测
利用PrPc和PrPsc之间不同的生物化学性质以及与抗体即3F4的结合差异,筛选选择性结合PrPsc的配基。单克隆抗体3F4与变性的PrPsc相结合的亲和力显著高于与未非变性的PrPsc相结合的亲和力(Safir,J.等Eight Prion Strains Have PrPsc Molecules WithDifferent Conformations.1998.Nature Medicine 4:1157-1165)。
在PBS中制备10%(w/v)的未感染和感染瘙痒病的仓鼠脑组织匀浆物,冻存于-80℃(Robert Rohwer博士惠赠,VA Medical Center,Baltimore)。使用前将其在湿冰上解冻,将1.2ml(未感染的)和0.5ml(感染的)组织匀浆物在终浓度为0.5%(w/v)十二烷基肌氨酸钠的存在下溶解,室温下轻轻振荡30分钟。将样品在14,000rpm离心5分钟,收集含有PrPc(未感染型)以及PrPc和PrPsc的混合物(感染型)的上清。相对于PrPc,在感染瘙痒病的仓鼠脑组织中过多地显示有PrPsc。通过将1ml溶于0.5%十二烷基肌氨酸钠的10%正常仓鼠脑组织匀浆物与0.33ml瘙痒病感染型脑材料以及3.67ml含有1%酪蛋白和1%BSA(Sigma,St.Louis,MO)的TBS缓冲液(Pierce,Rockford,IL)相混合,制备用于分析的5ml脑材料。正常和瘙痒病感染型脑组织匀浆物的终比率是3∶1,显示PrPc和PrPsc的量几乎大致相等。将此材料与三聚体珠文库接触并根据步骤进行试验。洗涤后,对珠进行不同处理。在一种方法中,将它们与PK孵育以消化结合到珠上的PrPc,在另一种方法中,对它们染色以分析PrPc的存在情况。这是通过将珠和3F4抗体孵育、洗涤、然后加入缀合了磷酸酶的3F4特异性二抗,洗涤并加入磷酸酶底物以使结合PrPc、3F4、二抗或磷酸酶的珠显色来完成。因此,那些结合PrPc的珠呈红色。一旦包埋在凝胶中,则在一些实验中加入对磷酸酶特异的另一种化学发光底物,从红色珠中产生光信号。根据上面所描述的方法,在存在6M盐酸胍(其也导致朊病毒蛋白的变性)时将PrPc、PrPsc和PrPres从琼脂糖中转移出来。PrPsc在捕获膜上的变性和固定便于PrPc以及PrPsc的免疫检测。若将这些点与以前染色的珠比对,则可能有不同群的珠。那些直接结合检测试剂如3F4的珠和那些结合PrPc加PrPsc或单独结合PrPc的珠将被染成红色。那些只结合或优先结合PrPsc的珠将在膜上产生信号,但将不会被染成红色。这些被选作PrPsc特异性珠,尽管他们被进一步验定为理论上可能在朊病毒蛋白上阻断结合3F4的位点结合PrPc和/或PrPsc两者的珠。在图1中,将三聚体文库中在第一次化学发光检测(变性步骤前)时不产生信号、但在第二次化学发光检测(变性步骤后)时产生信号、因此是用于测序的候选的珠用数字标记。
这里在表中列举本实施例中所描述的方法学的各种形式。
例如,在下面的表10A和B中,在存在掺入到正常人血浆中的散发CJD脑材料时筛选6聚体文库(100-300μm和65μm)。使珠接触收集到CPD中的掺入到正常人血浆中的0.5%脑组织匀浆物,然后用100μg/ml PK处理。为了证实PK没有完全消化来自珠中的肽,在测序前用1%(w/v)酪蛋白和5%(w/v)人血清白蛋白以及100μg/ml PK处理树脂。
表10A
结合huPrPc、huPrPsc或两者的6-氨基酸序列
*未用PK处理的0.5%散发CJD脑组织匀浆物(huPrPsc)
**未用PK处理的5%huPrPsc
***经PK处理的0.5%huPrPsc,无颜色产生
****经PK处理的5%huPrPsc,无颜色产生
“NA”指示未做,na指示萘基丙氨酸
表10B
结合huPrPsc的6-氨基酸序列
SEQ ID NO | 筛选的材料 | 序列 | 珠颜色 | 变性后的光信号 |
174 | HuPrPsc+PK* | ALHFETA | 白色 | 弱 |
175 | * | DDPTGFA | 白色 | 弱 |
176 | * | VAPGLGA | 白色 | |
177 | * | IFRLIEA | 白色 | 弱 |
178 | * | GLERPEA | 白色 | 弱 |
179 | * | IVVRLWA | 粉红色 | 弱 |
180 | * | WHNPHYA | 粉红色 | 弱 |
181 | * | LIYKSDA | 粉红色 | 弱 |
182 | 无PK的HuPrPsc** | EKPIFNA | 白色 | 弱 |
183 | ** | HWSEPAA | 红色 | 弱 |
184 | ** | GHNWKEA | 粉红色 | 强 |
185 | ** | YWHHDDA | 粉红色 | 强 |
186 | ** | GYPKENA | 粉红色 | 强 |
187 | ** | PVYWLYA | 白色 | 强 |
188 | 无PK的huPrPsc*** | FGEHTPA | 白色 | 弱 |
189 | *** | FQGTREA | 白色 | 强 |
190 | *** | TGTNRYA | 白色 | 强 |
191 | *** | KWATRYA | 白色 | 强 |
192 | *** | NSTKFDA | 粉红色 | 强 |
193 | *** | LIYKEEA | 粉红色 | 强 |
194 | *** | EHATYR | 白色 | 强 |
215(对照) | **** | DRDLTFA | 白色 | 无 |
216(对照) | **** | HNWWIIA | 白色 | 无 |
217(对照) | **** | EVKIGNA | 白色 | 无 |
*用经PK处理的散发型CJD脑组织匀浆物(huPrPsc)筛选100-300μm珠
**用未经PK处理的huPrPsc筛选100-300μm珠
***用未经PK处理的huPrPsc筛选65μm珠
****对照珠显示在缺乏PrP时与PK孵育后无配基的显著消化
在下面的表10C中,在存在从患散发CJD(huPrPsc)的患者中制备的脑组织匀浆物时筛选3聚体文库,在PrP特异性结合物的免疫检测前用PK处理珠。在这个试验中,将每柱10mg树脂与1ml在CPD中稀释并分别含有0.05%或0.1%(w/v)十二烷基肌氨酸钠以及0.2mM蛋白酶抑制剂(PMSF)的0.5%(w/v)或1%(w/v)脑组织匀浆物一起孵育。进行在一般方案中所描述的适当洗涤,将珠在37℃用1ml PK(100μg/ml)处理1小时。然后进行上述一般步骤。表10C中列举了在两个实验中所获得的序列。对每组序列标明了在孵育期间脑组织匀浆材料使用的适当浓度。
在表10D中,将组合文库的树脂以每柱5mg干重的量与1ml在PBS或CPD中稀释并含有0.01%(w/v)十二烷基肌氨酸钠和0.2mM PMSF的0.1%(w/v)脑组织匀浆物一起孵育。所有的操作都根据上面提到的方案来完成。
表10C
结合huPrPc、huPrPsc、或两者的3-氨基酸序列
SEQ ID NO | 筛选的材料 | 序列 | 珠颜色 | 变性后的光信号 |
195 | huPrPsc+PK* | HND | 白色 | 中等 |
196 | * | HER | 红色 | 中等 |
197 | * | HGD | 红色 | 强 |
198 | * | HSD | 红色 | 强 |
199 | * | HFD | 红色 | 强 |
200 | **** | WND | 红色 | 无 |
201 | **** | YEH | 红色 | 无 |
202 | **** | HWD | 红色 | 无 |
203 | **** | YHD | 红色 | 无 |
204 | **** | YDW | 红色 | 无 |
205 | **** | WDY | 红色 | 无 |
218(对照) | ***** | SIV | 白色 | 无 |
219(对照) | ***** | AYP | 白色 | 无 |
206 | 无PK的huPrPsc** | HYD(3x) | 红色 | 强 |
207 | ** | HWD | 红色 | 强 |
208 | ** | WTD | 红色 | 强 |
209 | huPrPsc+PK*** | FPK | 白色 | 中等 |
210 | *** | HWK | 白色 | 中等 |
211 | *** | WEE | 白色 | 中等 |
212 | *** | LLR | 白色 | 中等 |
*溶于0.05%十二烷基肌氨酸钠中的、经PK处理的0.5%huPrPsc
**溶于0.1%十二烷基肌氨酸钠的、未经PK处理的1.0%huPrPsc
***溶于0.1%十二烷基肌氨酸钠的、经PK处理的1.0%huPrPsc
****在转移前从凝胶中选择珠
*****在洗涤后获取珠
3x表示3次检测到的序列
表10D
结合huPrPc、huPrPsc、或两者的3-氨基酸序列
SEQ ID NO | 筛选的材料 | 序列 | 珠颜色 | 变性后的光信号 |
147 | 溶于CPD的huPrPsc* | WEH | 红色 | 强 |
152 | * | YDY | 红色 | 强 |
206 | * | HYD | 红色 | 强 |
213 | 溶于PBS的huPrPsc** | SYF | 白色 | 弱 |
214 | ** | EYY | 红色 | 强 |
实施例2
配基的第二次筛选
下面的实施例提供了关于在第一次筛选期间从不同文库中所选择的配基进行第二次筛选的信息,以进一步证实所述配基结合PrP。
在图2中显示了正常人脑的PrPc与三聚体树脂的结合。每柱每种树脂(氨基、HYD(SEQ ID NO:206))、RWD(SEQ ID NO:113)、SYA(SEQ ID NO:108)、SYF(SEQ ID NO:213)、和YEY(SEQ ID NO:154))使用10mg。氨基树脂是基础聚合物,肽在其上合成,该树脂对朊病毒蛋白有些亲和力。树脂用PBS或CPD在pH 7.4平衡。冰冻的正常人脑组织用作huPrPc的来源。其首先在湿冰上解冻。将在PBS或CPD中制备的10%脑组织匀浆物样品用1%十二烷基肌氨酸钠溶解,并通过14,000rpm离心5分钟澄清。回收上清液,稀释100倍使脑组织匀浆和十二烷基肌氨酸钠的终浓度分别为0.1%和0.01%。将1毫升这种材料加到柱上并收集流过柱的液体。用20ml PBS或CPD洗涤珠,如下所述使用1mg珠(干重)通过蛋白印迹评价PrPc结合。
洗涤后,将大约1mg干重量的珠在100ul缓冲液中悬浮,并在含有2%β巯基乙醇的30μl Laemml i缓冲液中在100℃加热10分钟。将珠在14,000rpm离心1分钟,通过蛋白印迹和探针探测PrP来评价上清液。在降低的变性条件下在NuPAGE 12%Bis-Tris凝胶(Invitrogen Life Technologies,Carlsbad,CA,USA)上分离样品,电印迹到硝酸纤维素膜(Invitrogen Life Technologies,Carlsbad,CA,USA)上。使用稀释为1∶10,000的单克隆抗体3F4使特异性PrP条带显色。使用含有用于辣根过氧化物酶检测的化学发光试剂的SuperSignal West Pico检测系统(Pierce,Rockford,IL,USA)使印迹显影。在X-OmatTMBlue XB-1胶片(Eastman Kodak Company,Rochester,NY)上记录信号,每柱使用(SEW ID NO:113),SYA(SEQID NO:108),WEY(SEQ ID NO:102),WSD(SEQ ID NO:115),YID(SEQ ID NO:112),YFE(SEQ ID NO:106),YEY(SEQ ID NO:154),和WQD,并根据上述的一般方案进行处理。用PBS,pH 7.4平衡柱。将来自散发CJD患者的冰冻脑组织用于制备PrPsc。它也含有PrPc。在PBS中制备10%脑组织匀浆物样品,用1%十二烷基肌氨酸钠处理,通过14,000rpm离心5分钟澄清。回收上清液,并稀释100倍使脑组织匀浆和十二烷基肌氨酸钠终浓度分别为0.1%和0.01%。将1ml这种材料加到珠上,并分批在室温下孵育3小时。然后用20ml PBS洗涤珠,在37℃下将1mg珠(干重)与PBS或含PK(100μg/ml)的PBS孵育1小时。这些条件可完全消化PrPc。因此,这会有助于区分PrPsc和PrPc特异性配基。按照实施例1中所描述的方法常规处理珠以用于蛋白印迹。
在图4中显示了从散发型CJD患者的脑组织匀浆物中获得的PrPsc以流过的方式结合树脂。在实验中每种树脂(氨基、RWERED(SEQID NO:157)、LW(SEQ ID NO:50)、EYY(SEQ ID NO:214)、HYD(SEQ ID NO:206))、RWD(SEQ ID NO:113)、SYA(SEQ ID NO:108)、SYF(SEQ ID NO:213)、和YEY(SEQ ID NO:154))使用50mg。使用Captiva 96孔滤板(CaptiVac Vacuum Sistem,ANSYSTechnologies,Inc,Cat.#796)替代单个柱。根据上述一般方案制备树脂。树脂用CPD pH 7.4平衡。将散发型CJD患者的冰冻脑组织用作huPrPc和huPrPsc的来源。在CPD中制备10%脑组织匀浆物样品,用1%十二烷基肌氨酸钠处理,在14,000rpm离心5分钟澄清。回收上清液,稀释10倍以使脑组织匀浆物和十二烷基肌氨酸钠的终浓度分别为1%和0.1%。向每孔加入250μl此材料。使该材料在重力作用下经过树脂,接触时间约4分钟,收集流过的液体。用2.5ml CPD洗涤树脂。在37℃下将1mg珠(干重)与PK(100μg/ml)孵育1小时。之后根据上述方法进行珠的常规处理以用于蛋白印迹。
尽管可在本发明的实施或检测中使用与这里所描述的那些相似或等同的方法和材料,但合适的方法和材料如上文所述。将这里所提到的所有出版物、专利申请、专利和其它引用的参考文献完整并入作为参考。另外,这些材料、方法和实施例只是说明性的,并非旨在限制。
提供前面的说明以描述与本发明有关的各种实施方案。可对这些实施方案和/或结构进行各种修饰、增加和删除,而不背离本发明的范围和精神。
实施例3
显现结合于树脂上的PrPc
为了显现PrPc与亲和树脂的结合,使正常脑匀浆物结合柱形式的氨基DVR(SEQ ID NO:114)树脂,通过产色的底物显现蛋白在珠的内部和外部的位置。将在Toyopearl 650-M氨基树脂上合成的0.5ml亲和配基DVR(SEQ ID NO:114)柱填充到PIKSI柱(ProMeticBioSciences Ltd,Montreal,Quebec,Canada)中。由蠕动泵控制,以0.5ml/分的流速,将稀释在工作缓冲液(WB)(20mM柠檬酸,140mM氯化钠,pH 7.0)中的1.5ml 1%正常仓鼠脑组织匀浆物(HaBH)加到柱中。加载HaBH后,用5ml WB洗涤柱。从柱中移出珠,用剃刀片砍碎以暴露珠的内部,在室温下通过旋转振荡与在1%酪蛋白缓冲液(Pierce,Rockford,IL)中1∶4000稀释的一抗3F4孵育1小时。用TBS,pH 7.4(Invitrogen Life Technologies,Carlsbad,CA,USA)洗涤珠,与在1%酪蛋白中1∶1000稀释的碱性磷酸酶标记的山羊抗小鼠二抗(KPL,Gaithersburg,MD)在室温下旋转孵育1小时。用10mlTBS,pH 7.4洗涤珠,然后用5ml TBS,pH 9.5洗涤。将珠与BCIP/NBT碱性磷酸酶底物(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)孵育几个小时并在立体显微镜下观察。珠的外表面被染成褐色/蓝色,但内表面仍保持白色,提示蛋白质结合在珠的外面。
实施例4
从血红细胞浓缩物中除去PrPsc
向血红细胞浓缩物(RBCCs)以高于可能在感染动物血液中内源性存在的数量级的浓度掺入感染了瘙痒病的仓鼠的脑组织匀浆物。为了评价当以高浓度存在时亲和配基结合和从RBCCs中除去PrP的能力,将有掺入的RBCCs连续通过具有不同亲和配基的树脂柱。
将10单位O型阴性红血细胞浓缩物(RBCCs)在Pall Leukotrapfilters(Pall,East Hills,NY)上除去白细胞,合并,并掺入溶于0.1%十二烷基肌氨酸钠的0.1%瘙痒病仓鼠脑组织匀浆物。以2ml/分钟,振荡加入掺入物。将有掺入的RBCCs再分成每份300ml的10等份,每份装入到转移袋(Fenwal Products,Baxter HealthcareCorporation,Deerfild,IL)中。
串连装配5个柱,每个都含有10ml特定树脂,从而使流经第一个柱的含有未结合材料的液体施加到第二个柱上。连续进行这种步骤直到所有的5个柱都接触过RBCCs。使300ml有掺入的RBCCs通过第一个柱,收集流过柱的液体,流经第二个柱,等等,直到所有的柱都接触过RBCCs。收集柱中的珠,洗涤100μl珠样品,并分为两份。一份在37℃与1mg/ml蛋白酶K(在表11,与蛋白酶K孵育的样品表示为+PK,未与蛋白酶K孵育的样品表示为-PK)孵育1小时。通过在2×样品缓冲液(NuPAGE,Helixx Technologies Inc.,Toronto,Ontario,Canada)中煮沸珠,从珠中洗脱与+PK和-PK珠两者都结合的蛋白质。将每个样品以10μl的量加样到12%Bis-Tris SDS-PAGE凝胶(Invitrogen)上并电泳45分钟。将蛋白质从凝胶转移到膜上,使用小鼠抗人PrP抗体3F4作为一抗,缀合了碱性磷酸酶的山羊抗小鼠抗体作为二抗,用Western Breeze化学发光检测(Invitrogen)在蛋白质印迹中检测PrP蛋白。通过洗脱树脂结合型蛋白而获得的凝胶上的条带指示在来源于前面柱子的流过液(或在第一个柱子时指起始材料)的珠上存在PrPres。
对于阴性对照,乙酰化的SYA(Ac-SYA)(SEQ ID NO:108)树脂,在柱1-5的珠上发现了PrPres,表明这种树脂不结合PrPsc。在柱1上发现大量PrPres,在DVR(SEQ ID NO:114)和SYA(SEQ ID NO:10)的柱2上数量降低,在柱3的珠上仅有少量PrPres存在。这显示这些树脂在三个柱或30ml树脂中除去了所有的PrPres,可达到蛋白印迹检测的极限。树脂YVHEA(SEQ ID NO:63)和(D)ES(na)PRQ-EACA(SEQ ID NO:226-EACA)也显示从柱1到柱3上PrPres的量降低;然而,柱3上结合的PrPres比在前2个树脂中的更多。在WFVEA(SEQID NO:225)的每个柱上发现了等量的PrPres,表明此树脂在每个柱上结合少量PrPres,但结合以及除去所有朊病毒蛋白的程度不能达到检测的极限。由于掺入物比在动物血中内源性观察到的PrP的量高几倍,因此这些结果表明这些树脂中的某些类型即使不能除去血液中存在的所有内源性PrPres,也能除去其中的绝大部分。
表11
在实施例4中样品的凝胶电泳上样方式
MWM表示分子量标记
Claims (13)
1.一种从样品中除去朊病毒蛋白的方法,包括:
在足以导致在朊病毒蛋白和配基之间形成复合体的条件下,将样品与配基相接触,其中所述配基是能够结合选自PrPc,PrPsc和PrPr的朊病毒蛋白的具有SEQ ID NO:114的氨基酸序列的肽;以及
从样品中除去复合体。
2.权利要求1的方法,其中所述配体具有小于6kDa的分子量。
3.权利要求1的方法,其中所述样品是生物学样品。
4.权利要求3的方法,其中所述生物学样品选自血液、白细胞、单核细胞、血小板浓缩物、血浆、血清、脑脊液、尿液、唾液、乳汁、眼泪、精液、粪便、扁桃体、淋巴结、胶原、脑提取物和腺体提取物。
5.权利要求1的方法,其中在与样品接触前将配基附着到固体支持物上。
6.权利要求5的方法,其中所述固体支持物选自膜和树脂。
7.权利要求5的方法,其中所述固体支持物是选自聚甲基丙烯酸酯、琼脂糖、琼脂糖凝胶、交联琼脂糖、复合交联多糖、硅藻土、聚乙烯基D、丙烯酸酯氟化物、聚苯乙烯和纤维素中的树脂。
8.权利要求5的方法,其中所述固体支持物是聚甲基丙烯酸酯树脂。
9.权利要求5的方法,其中所述固体支持物是选自尼龙和纤维素的材料的膜。
10.用于结合朊病毒蛋白的组合物,包含:配基,其中所述配基是具有SEQ ID NO:114的氨基酸序列的肽;以及固体支持物,其中所述配基附着到所述固体支持物上。
11.权利要求10的组合物,其中所述固体支持物选自膜和树脂。
12.权利要求10的组合物,其中所述配基能结合朊病毒蛋白的天然形式(PrPc)和/或朊病毒蛋白的构象改变形式(PrPsc)。
13.权利要求10的组合物,其中所述配基具有小于6kDa的分子量。
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