MXPA05005920A

MXPA05005920A - Ligandos de proteina prion y metodos de uso.

Info

Publication number: MXPA05005920A
Application number: MXPA05005920A
Authority: MX
Inventors: Ruben G Carbonell
Original assignee: American Nat Red Cross
Priority date: 2002-12-03
Filing date: 2003-12-03
Publication date: 2006-03-17
Also published as: HK1157009A1; HK1124388A1; EP2317317A1; CN1739029A; NZ540417A; PT1573323E; CN102241741A; CN102241741B; AU2003302500A1; ES2460641T3; PT1953551E; CA2836951C; IL206129A0; AU2003302500B2; EP1573323A4; IL168904A; JP4485367B2; ATE529744T1; IL200468A; CN102297798A

Abstract

Ligandos que se enlazan a proteinas prion y metodos para utilizar los ligandos para detectar o retirar una proteina prion de una muestra, tal como un fluido biologico o una muestra ambiental. Los ligandos son capaces de enlazarse a una o mas formas de proteina prion incluyendo la proteina prion celular (PrPc) , la proteina prion infecciosa (PrPsc) y la proteina prion recombinante (PrPr). Los priones de diversas especies que incluyen humanos y hamster, se enlazan mediante los ligandos. Tambien se proporciona un metodo para tratar o retardar el desarrollo de una patologia asociada al prion en un sujeto.

Description

LIGANDOS DE PROTEÍNA PRIÓN Y MÉTODOS DE USO REFERENCIA CRUZADA A SOLICITUDES RELACIONADAS Esta solicitud reivindica el beneficio de la Solicitud Provisional de Patente de los E.U. No. 60/430,423 presentada en Diciembre 3 de 2002. CAMPO DE LA INVENCIÓN Esta invención se refiere al campo de las interacciones proteína-ligando y más particularmente se refiere a la identificación de ligandos que se enlazan a proteínas prión y métodos para utilizar los ligandos para detectar o retirar priónes de muestras biológicas. ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La proteina prión nativa o celular "PrPc" se encuentra ampliamente distribuida en todos los mamíferos y tiene una secuencia de aminoácidos y estructura proteínica particularmente bien conservadas . Se cree que las infecciones priónes se componen de una forma modificada de la proteína prión celular normal (PrPc) y se denominan "PrPsc" . Las priónes tienen algunas propiedades en común con otras infecciones patógenas, pero no parecen contener ácido nucleico. Por el contrario, se propone que se encuentra implicado un cambio post-traslacional de conformación en la conversión de la PrPc no infecciosa a la PrPsc infecciosa durante el cual las hélices alfa se transforman en láminas beta. La PrPc contiene tres hélices alfa y tiene poca - - estructura de lámina beta; en contraste, la PrPsc es rica en lámina beta. Se cree que la conversión de PrPc a PrPsc conduce al desarrollo de encefalopatías espongiformes transmisibles (TSEs) durante las cuales la PrPsc se acumula en el sistema nervioso central (CNS) y se acompaña de cambios neuropatológicos y disfunción neurológica. La PrPsc, frecuentemente referida como la forma "de desecho" de la proteína prión, se considera necesaria y posiblemente suficiente para la transmisión y patogénesis de estas enfermedades neurodegenerativas transmisibles de animales y humanos . Ejemplos específicos de TSEs incluyen encefalopatía espongiforme ovina, que afecta a ovejas y cabras; encefalopatía bovina espongiforme (BSE) , que afecta al ganado; encefalopatía transmisible de visón, encefalopatía felina espongiforme y enfermedad de desgaste crónico (C D) de cariacú, venado de cola blanca, venado de cola negra y alce. En humanos las enfermedades TSE pueden presentarse como kuru, enfermedad Creutzfeldt-Jakob (CJD) , Síndrome Gertsmann-Straüssler-Scheinker (GSS) , insomnio fatal, y enfermedad Creutzfeldt-j akob variante (vCJD) . La vCJD emergió recientemente en humanos como resultado de la BSE epidémica en Gran Bretaña y más probablemente ocasionada por el consumo de productos alimenticios derivados de ganado infectado con BSE o "enfermedad de la vaca loca" . Un número desconocido de - - personas en el Reino Unido ingirió alimentos potencialmente contaminados con tejido nervioso de ganado infectado con BSE durante mediados de los 80s hasta principios de los 90s. Debido a que el periodo de incubación para la enfermedad contraída oralmente puede ser de más de 20 años en humanos, la incidencia real de la vCJD puede no ser aparente por muchos años. A la fecha, se sabe que más de 130 personas han contraído la enfermedad, principalmente en el Reino Unido; sin embargo, se han reportado casos en Canadá, Francia, Hong Kong, Irlanda, Italia y los EU. La exportación de productos alimenticios bovinos del Reino Unido alrededor del mundo indica una posible presencia global de BSE y de aquí la probabilidad de vCJD. Consistente con estas observaciones se encuentra la detección de BSE en la mayoría de los países Europeos, Japón e Israel. Consecuentemente, es de profunda importancia la capacidad para detectar y retirar la proteína prión infecciosa de una variedad de materiales incluyendo productos alimenticios. Históricamente, el diagnóstico de las TSEs se basaba en la concurrencia de signos clínicos de la enfermedad y podía confirmarse solo mediante el examen biológico post-mortem del tejido cerebral. Una característica de todas las TSEs es la falta de una respuesta inmune calculable del huésped al agente. Por tanto, no se producen anticuerpos y no puede utilizarse ninguna prueba serológica convencional - - para identificar a los animales infectados. Recientemente, la identificación de la protelna pri n anormal en el cerebro ha mejorado la capacidad para el diagnóstico de la enfermedad. Además de la ingestión de productos infectados de origen bovino, la transfusión sanguínea y el trasplante de órganos representan otra forma potencial de transmisión de vCJD entre humanos. Se desconoce actualmente la probabilidad de transmisión de la vCJD en humanos por transfusión sanguínea, pero en base a los datos de modelos animales experimentales incluyendo la transmisión de ovejas experimentalmente infectadas por vía oral con BSE y ovejas naturalmente infectadas con encefalopatía espongiforme ovina, parece ser una posibilidad muy probable . A diferencia de otras TSEs humanas, la PrPsc se encuentra presente en el sistema linforreticular de pacientes con vCJD, incrementando así la probabilidad de que el agente infeccioso se encuentre en la sangre y la transmisión a través de transfusión sanguínea. Otros factores que elevan la preocupación acerca del riesgo de transmisión por medio de transfusión incluyen el número desconocido, pero presumiblemente alto de personas expuestas a BSE y la falta de una prueba preclínica de diagnóstico para la vCJD. Además, la virulencia de la vCJD parece aumentar después de la adaptación de las especies en primates y ratones, sugiriendo que la transmisión de humano a - - humano puede ser más eficiente que de vacas a humanos. Por tanto, existe una necesidad urgente de métodos para prevenir la transmisión de vCJD mediante transfusión sanguínea. Tales medidas pueden incluir la identificación temprana de los donantes infectados y el aplazamiento, retiro e inactivación de los agentes de TSE en productos alimenticios y para la salud derivados de animales pretendidos para consumo o aplicaciones en animales o humanos, productos de derivados sanguíneos derivados de humanos y bovinos, y trasplantes de órganos. Desafortunadamente, la PrPsc es notablemente resistente a métodos químicos y físicos de inactivación, y un método selectivo de inactivación es elusivo. El retiro del prión a través de la interacción específica con ligandos parece más promisorio. Se ha identificado ya una cantidad de ligandos que se enlazan a la proteína prión. Se han seleccionado bibliotecas de péptidos combinatorias para ligandos que se enlazan a la secuencia de repetición de octapéptidos (PHGGGWGQ (SEQ ID NO:220) ) encontrada en todas las proteínas prión de mamífero conocidas y se descubrió una serie de ligandos, como se describe en la PCT/US01/11150. Otros materiales incluyen una variedad de polímeros, por ejemplo, amino polimetacrilato de TosoBioSep, resinas de intercambio de ion generalmente (ver Patente de EU No. 5,808,011 para Gawryl et al), ligandos que interactúan con la placa amiloide, por ejemplo, Congo Red (Ingrosso, L., - - et al . , Congo red prolongs the incubation period in scrapie-infected hámsters (El rojo Congo prolonga el período de incubación en hámsters infectados de encefalopatía espongiforme ovina). J. Virology 69:506-508 (1995)), 4-yodo, 4-desoxi doxorrubicina (Tagliavini, F . , et al . , Effectiveness of anthracycline against experimental prión diseases in Syrian hámsters (Efectividad de la antraciclina contra enfermedades prión experimentales en hámsters Sirios) . Science 276:1119-1122 (1997)), anfotericina B, porfirinas y ftalocianinas (Priola, S.A., et al., Porphyrin and Phtalocianine antiscrapie compounds (Compuestos antiencefalopatía espongiforme ovina de porfirina y ftalocianina) Science 287:1503-1506 (2000)), metales (Stockel et al., Biochemistry 37, 7185-7193 (1998)), péptidos que interactúan con la PrP para formar complejos (ver la Patente de E.U. 5,750,361 para Prusiner et al y Soto C, et al., Reversión of prión protein conformational changes in synthetic b-sheet breaker peptides (Reversión de los cambios de conformación de la proteína prión en péptidos rompedores sintéticos de lámina beta), Lancet 355:192-197 (2000)), heparina y otros polianiones polisulfatados (Caughey B., et al., Binding of the Protease-sensitive form of prión protein PrP to Sulphated Glycosaminoglycan and Congo Red, (Enlace de la forma sensitiva a la proteasa de la protelna prión PrP a Glicosaminoglicano Sulfatado y Rojo Congo) , J. Virology - - 68:2135-2141 (1994)), anticuerpos (Kascsak, R.J., et al., Immunodiagnosis of prión disease (Inmunodiagnóstico de la enfermedad prión), Xmmunological Invest. 26:259-268 (1997)), y otras proteínas, e.g., plasminógeno (Fischer, M.B., et al., Binding of disease-associated prión protein to plasminogen (Enlace de la proteina prión asociada a la enfermedad al plasminógeno) tature 408:479-483 (2000)). Actualmente, ningún ligando se ha caracterizado totalmente ni se ha encontrado que sea capaz de enlazarse a prión de una amplia variedad de medios, aunque algunos pueden ser útiles en circunstancias especificas (ver, Patente de E.U. No. 5,808,011 para Gawryl et al). A la fecha, las enfermedades TSE humanas son 100% fatales. Desafortunadamente, aunque se ha reportado un número de compuestos que incluyen anfotericinas, polianiones sulfatados, colorante Rojo Congo y antibióticos de antraciclina como agentes terapéuticos prospecto, todos han demostrado solo un modesto potencial para impedir la propagación de prión, y ninguno ha mostrado tener ningún efecto en el retiro de priónes pre-existentes de un huésped infectado. Por tanto, permanece una urgente necesidad de nuevos agentes terapéuticos. Se cree que el montaje y desmontaje de proteínas normalmente solubles en formas alteradas en conformación e insolubles es un proceso causativo en una variedad de otras - - enfermedades, muchas de las cuales son enfermedades neurológicas . La relación entre el establecimiento de la enfermedad y la transición de la proteína normal a la alterada en su conformación se entiende vagamente. Ejemplos de tales proteínas ínsolubles además de prión incluyen: péptido beta-amiloide en placas amiloides de la enfermedad de Alzheimer y angiopatía cerebral amiloide (CAA) ; depósitos de alfa-sinucleina en los cuerpos Lewy de la enfermedad de Parkinson, tau en marañas neurofibrilares en la demencia frontal temporal y la enfermedad de Pick; superóxido dismutasa en la esclerosis lateral amiotrófica; y huntingtina en la enfermedad de Huntington. Frecuentemente estas proteínas altamente insolubles forman agregados compuestos de fibrilos no ramificados con la característica común de una conformación de lámina emplacada beta. En el sistema nervioso central, el amiloide puede encontrarse presente en vasos sanguíneos meníngeos (depósitos cerebrovasculares) y en parenquíma cerebral (placas) . Los estudios neuropatológicos en modelos humanos y animales indican que las células próximas a los depósitos amiloides se interrumpen en sus funciones normales. Se desconoce el mecanismo preciso mediante el cual se forman las placas neuríticas y la relación de la formación de placas con los procesos neurodegenerativos asociados a la enfermedad. Son necesarias metodologías que puedan separar _ _ fácilmente o que pueden distinguir entre dos o más diferentes formas de conformación de una proteína, por ejemplo, PrPc y PrPsc, para comprender el proceso de conversión y para encontrar estructuras que interactúen específicamente con la forma asociada a la enfermedad. Las metodologías actuales para separar o distinguir entre las isoformas incluyen: movilidad diferencial en geles de poliacrilamida en presencia de un caotropo tal como urea, i.e., geles de gradiente transversal de airea (TUG) sensibilidad diferencial al tratamiento con proteasa, por ejemplo, proteinasa K (PK) y la detección del producto de la digestión resistente a PK de la PrPsc referida a una PrPres; estabilidad de temperatura diferencial; solubilidad relativa en detergentes no iónicos; y la capacidad de las estructuras fibrilares para enlazarse a ciertos químicos, por ejemplo, Rojo Congo e isoflavin S. Sin embargo, permanece una necesidad no cumplida de identificar reactivos de alta afinidad que sean específicos para la proteína alterada en su conformación y especialmente para las formas asociadas con la enfermedad. Tales reactivos serían útiles para desarrollar posibles equipos de diagnóstico, separación y purificación de las diferentes formas de proteína, para el retiro de las formas infecciosas de la enfermedad a partir de agentes terapéuticos, productos biológicos, vacunas y alimentos, y para la terapia.

- - SUMARIO DE LA INVENCIÓN Se proporcionan ligandos que se enlazan a proteínas prión y sus aplicaciones. Los ligandos son péptidos que se enlazan con selectividad y especificidad a analitos prión. Los ligandos son capaces de enlazarse a una o más formas de proteína prión incluyendo proteína prión celular (PrPc) , proteína prión infecciosa (PrPsc) , y proteína prión recombinante (PrPr) . Los priónes de diversas especies, incluyendo humanos y hámsters, se enlazan por los ligandos. También se proporcionan composiciones que contienen los ligandos de enlace de la proteína prión en un soporte tal como una resina o una membrana. Los ligandos son útiles para detectar o retirar una proteína prión de una muestra, tal como un fluido biológico o una muestra ambiental. Los ligandos se utilizan para detectar o retirar toda la proteína prión de la muestra o pueden elegirse selectivamente para detectar o retirar un sola forma de proteína prión y en consecuencia pueden utilizarse para distinguir entre la proteína prión infecciosa y no infecciosa en la muestra de pacientes afectados con TSEs humanas y animales afectados con encefalopatía espongiforme ovina, BSE y CWD. También se proporciona un método para tratar o retardar el desarrollo de una patología asociada a prión en un sujeto. Por ejemplo, los ligandos de la invención pueden - - ser útiles para tratar patologías tales como CJD, vCJD, GSS, insomnio fatal, encefalopatía espongiforme ovina, BSE y GWD. Tales ligandos pueden actuar inhibiendo la polimerización de la PrPsc o inhibiendo la interacción de la PrPsc y la PrPc retardando en consecuencia el desarrollo posterior de la PrPsc . Otro aspecto de la invención proporciona un método para identificar ligandos adicionales, particularmente ligandos específicos para las formas alteradas en su conformación de proteínas, de las cuales algunas se encuentran involucradas en el desarrollo de enfermedades . La metodología descrita también es apropiada para el descubrimiento, evaluación o selección de grandes números de drogas candidato potenciales que se enlazan directamente a la PrPsc . Otras características y ventajas de la invención serán aparentes a partir de la siguiente descripción detallada y modalidades preferidas . BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS FIGURA 1. Señales quimioluminiscentes de perlas de una biblioteca combinatoria que se enlaza a haPrPc y haPrPsc de homogenado cerebral . Se detectó PrPc y PrPsc a través del enlace de un anticuerpo monoclonal específico (3F4) y anticuerpos secundarios conjugados de alcalina fosfatasa específicos para 3F4. La luz producida por un sustrato - - quimioluminiscente específico para alcalina fosfatasa se detectó en película de autorradiografía. Los sitios de las señales generadas a partir de las perlas de una biblioteca combinatoria se enumeran. Los ligandos en las perlas se secuenciaron subsecuentemente. Estas perlas no produjeron una señal previo a la transferencia y desnaturalización pero emitieron una fuerte señal después de la transferencia y desnaturalización de proteínas enlazadas y el marcado con anticuerpo 3F4 conjugado con enzimas. FIGURA.2. Enlace de huPrPc a partir de extractos de cerebro humano normal a resinas de afinidad en un formato de columna. Se preparó homogenado cerebral y perlas y se equilibraron ya sea en fosfato (PBS) o amortiguadores de citrato fosfato dextrosa (CPD) . La fuerza de la señal en los inmunoanálisis es una función de la fuerza del enlace de la PrPc a la resina. La vía 1 contiene marcador de peso molecular (MW) ; la vía 2, 20 µ? de homogenado cerebral humano normal al 0.1%. Las vías 3-8, PrPc eluída de perlas. FIGURA 3. Enlace de huPrPsc a partir de extractos de cerebro humano infectado con CJD a resinas de afinidad en un formato por lotes. La figura es un inmunoanálisis que muestra la cantidad de prión eluida de perlas después del contacto con un homogenado conteniendo huPrPsc de un paciente con CJD esporádica. Las perlas se lavaron después del contacto con el homogenado que ya sea se trató con PK para - - revelar la presencia de PrPres o permaneció no tratado. Se calentó en amortiguador conteniendo SDS para liberar la proteína enlazada, y las muestras se disolvieron mediante SDS-PAGE seguido por inmunoanálisis . El enlace de huPrPsc y PrPc a las resinas se demuestra por la presencia de bandas específicas de PrP después de probar con un anticuerpo monoclonal 3F4. Las secuencias de péptido se indican en la parte superior del gel . Las muestras digeridas con PK se identifican como (+) , no digeridas como (-) . FIGURA 4. Enlace de huPrPsc a partir de extractos de cerebro humano infectado con CJD a resinas de afinidad en un formato de columna. Las secuencias de péptido se indican en la parte superior del gel . Las muestras previamente digeridas con PK se identifican como + y no digeridas como - . Los controles incluyeron 20 µ.1 de homogenado cerebral al 1%. PrPc y PrPsc se detectaron específicamente utilizando anticuerpo monoclonal 3F4 y se visualizaron mediante la detección de una señal quimioluminiscente . FIGURA 5. Diagrama de la preparación de la transferencia "bead blot" . Las perlas se ordenan en un gel después de la incubación con materiales de inicio. La proteína enlazada se transfiere de las perlas y se captura en la membrana a través de transferencia capilar del amortiguador como se indicó. FIGURA 6. Retiro de la PrPres a partir de RBCCs - - infectados por diversas resinas de afinidad. Se fijaron concentrados de células de sangre roja (RBCCs) con homogenado cerebral de hámsters infectados con encefalopatía espongiforme ovina y se pasaron en sucesión a través de columnas de resinas con diversos ligandos de afinidad. Las proteínas enlazadas a la resina se analizaron mediante electroforesis de gel. El patrón de carga de gel se muestra en la Tabla 11. DESCRIPCIÓN DETALLADA Se describen en la presente los ligandos que se enlazan a proteínas prión y sus aplicaciones. Los ligandos son proteínas, péptidos o polipéptidos que se enlazan con especificidad y afinidad a proteínas prión. Preferentemente, los ligandos tienen un peso molecular de 6 kDa o menor. Los ligandos son útiles en métodos para detectar proteína prión en una muestra, tal como un fluido biológico derivado de humano o animal o una muestra ambiental, así como métodos para diagnosticar y tratar una enfermedad prión. Por ejemplo, los ligandos de la invención pueden ser útiles para tratar patologías diagnosticadas tales como CJD, vCJD, GSS, insomnio fatal, encefalopatía espongiforme ovina, BSE y C D y otras TSEs utilizando sangre completa, componentes sanguíneos, células, suero, plasma, derivados de plasma, fluido cerebroespinal, orina, lágrimas, apéndices y otros. Los ligandos también pueden ser útiles para retirar la - - proteína prión de una muestra, tal como una muestra de sangre, componentes sanguíneos, células, suero, plasma, derivados de plasma, fluido cerebroespinal, orina, lágrimas, apéndices y otros. Los ligandos se utilizan para detectar o retirar toda la proteína prión de la muestra o pueden elegirse selectivamente para detectar o retirar una sola forma de proteína prión y en consecuencia pueden utilizarse para distinguir entre proteínas prión infecciosas y no infecciosas en la muestra. Los métodos descritos pueden utilizarse para seleccionar polímeros, compuestos sintéticos y bibliotecas de compuestos sintéticos para ligandos adicionales para priones. También se proporciona en la presente un método para identificar ligandos adicionales, particularmente los ligandos específicos para las formas alteradas de proteínas, de las cuales algunas se encuentran involucradas en el desarrollo de enfermedades . También se proporciona una metodología apropiada para el descubrimiento, evaluación o selección de grandes números de drogas candidato potenciales. Definiciones Los términos "un", "una" y "el", "la" como se utilizan en la presente se define que significan "uno o más" e incluyen el plural a menos que el contexto sea inapropiado. El término "3F4" se refiere al anticuerpo - - monoclonal específico para las formas nativas de PrPc, pero no a PrPsc o PrPres nativas. El anticuerpo tiene especificidad para las formas desnaturalizadas de PrPc, PrPsc y PrPres de hámster y humanas . Como se utilizan en la ? resente, los términos "composiciones derivadas de sangre" y composiciones sanguíneas se utilizan de manera intercambiable y significa que incluyen sangre completa, concentrado celular de sangre roja, plasma, suero, fracciones ricas en plaquetas y pobres en plaquetas, concentrados de plaquetas, células de sangre blanca, precipitados de plasma sanguíneo, precipitados y sobrenadantes de fraccionamiento de plasma sanguíneo, preparaciones de inmunoglobulina incluyendo IgA, IgE, IgG e IgM, concentrados purificados del factor de coagulación, concentrado fibrinógeno, u otras varias composiciones derivadas de humanos o animales . También incluye proteínas derivadas de sangre purificada preparadas por cualquiera de diversos métodos comunes en la técnica incluyendo intercambio de ion, afinidad, permeación de gel, y/o cromatografía hidrofobica o mediante precipitación diferencial. El término "biblioteca combinatoria" se refiere a una colección de químicos que se han sintetizado mediante técnicas de química combinatoria en fase sólida. Esta definición abarca el uso de un método de separación-par-recombinación que genera millones de péptidos aleatorios de - - una longitud definida o puede diseñarse para incluir estructuras definidas. Los bloques de construcción pueden ser aminoácidos naturales, moléculas sintéticas, análogos de aminoácidos, análogos ramificados, colorantes de triazina y lo similar. El término "variaciones conservadoras" o "variaciones conservadoras modificadas" de una secuencia particular se refiere a aminoácidos u otras estructuras cercanamente relacionadas que tienen una similitud química sustancial. Además, las sustituciones individuales, supresiones, o adiciones que alteran, agregan o suprimen un solo aminoácido o un pequeño porcentaje de aminoácidos en una secuencia codificada son variaciones conservadoramente modificadas cuando las alteraciones dan como resultado la sustitución de un aminoácido con un aminoácido químicamente similar. Las tablas de sustitución conservadora que proporcionan aminoácidos funcionalmente similares son muy conocidas en la técnica. Los siguientes seis grupos contienen cada uno aminoácidos naturales que son sustituciones conservadoras uno del otro: 1) Serina (S) , Treonina (T) ; 2) Ácido aspártico (D) , Ácido glutámico (E) ; 3) Asparagina (N) , Glutamina (Q) ; 4) Arginina (R) , Lisina ( ) ; 5) Isoleucina (I) , Leucina (L) , Metionina (M) , - - Valina (V) , Alanina (A) ; 6) Fenilalanina (F) , Tirosina (Y) , Triptofán (W) . Numerosos aminoácidos no naturales se consideran también sustituciones conservadoras de aminoácidos de origen natural. Se dice que dos polipéptidos son "idénticos" si la secuencia de residuos de aminoácidos en las dos secuencias es la misma cuando se alinea para máxima correspondencia. La óptima alineación de secuencias para su comparación puede conducirse por medio del algoritmo de homología local de Smith y Waterman, Adv. Appl . Math. 2:482 (1981), mediante el algoritmo de alineamiento de homología de Needleman y Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970), por medio de la búsqueda por el método de similitud de Pearson y Lipman, Proc. Nati. Acad. Sci. (E.U.A.) 85:2444 (1988), mediante implementación computarazada de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA y TFASTA en el Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr. Madison WI) o mediante inspecció . El término "ligando" se refiere a una molécula a la cual se enlaza una proteina, péptido o polipéptido. Los ligandos de la presente invención pueden ser preparaciones de anticuerpos, proteínas, péptidos, polipéptidos, aminoácidos, ácidos nucleicos, carbohidratos, azúcares, llpidos, moléculas orgánicas, polímeros, y/o agentes terapéuticos putativos, y lo similar.

- - Los términos "proteína" , "péptido" , "polipéptido" , y "oligopéptido" se utilizan de manera intercambiable y se definen en la presente como una cadena de aminoácidos en la cual los carbonos se encuentran enlazados a través de enlaces péptido formados por una reacción de condensación entre el grupo carbonilo de un aminoácido y el grupo amino de otro aminoácido. El aminoácido terminal en un extremo de la cadena (i.e., la terminal amino) tiene un grupo amino libre, mientras que el aminoácido terminal en el otro extremo de la cadena (i.e., la terminal carboxi) tiene un grupo carboxilo libre. Como tal, el término "término amino" (abreviado N-término) se refiere al grupo amino libre en el aminoácido en la terminal amino del péptido, o al grupo amino (grupo imino cuando participa en un enlace péptido) de un aminoácido en cualquier otro sitio dentro del péptido. De manera similar, el término "término carboxi" (abreviado C-término) se refiere al grupo carboxilo libre en el aminoácido en el término carboxi de un péptido, o al grupo carboxilo de un aminoácido en cualquier otro sitio dentro del péptido. Al sintetizarse sobre resina mediante síntesis Merrifield el grupo carboxilo C-terminal se acopla a la resina comúnmente a través de un enlace péptido para un grupo amino inmovilizado. Típicamente, los aminoácidos que componen un péptido se enumeran en orden, comenzando en la terminal amino y aumentando en la dirección de la terminal carboxi del - 0 - péptido. De este modo, cuando se dice que un aminoácido "sigue" a otro, ese aminoácido se coloca más cercano a la terminal carboxi del péptido que el aminoácido "precedente" . El término "PrPc" se refiere a la molécula nativa de proteina prión que se expresa natural y ampliamente dentro del cuerpo del mamífero. Su estructura se encuentra altamente conservada y no se asocia con un estado de enfermedad. El término "PrPsc" se refiere a la forma alterada en su conformación de la molécula de PrPc que es la que se cree infecciosa y se asocia con enfermedades TSE/prión, incluyendo vCJD, CJD, kuru, insomnio fatal, GSS, encefalopatía espongiforme ovina, BSE, CWD y otras TSEs raras de animales cautivos y experimentales. Ésta tiene la misma secuencia de aminoácidos que la PrPc celular normal, pero ha convertido algo de la hélice alfa a lámina beta y se asocia con un estado de enfermedad. El término "PrPres" se refiere a los derivados resistentes a proteinasa de la proteína PrPsc de 27-30 kDa que permanece después de la digestión parcial de PrPsc con PK. El término "PrPr" se refiere a la proteína prión expresada por medio de tecnología recombinante . El término "PrP" se refiere a la proteína prión en general.

- - El término "residuo" se utiliza en la presente para referirse a un aminoácido (D o L) o a un mimético de aminoácido que se incorpora en un oligopéptido mediante un enlace amida o un mimético de enlace amida. Como tal, el aminoácido puede ser un aminoácido de origen natural o, a menos que se limite de otra manera, puede abarcar análogos conocidos de aminoácidos naturales que funcionan de una manera similar a los aminoácidos de origen natural (i.e. miméticos de aminoácido) . Además, un mimético de enlace amida incluye modificaciones de estructura del péptido muy conocidas por los expertos en la técnica. El término "identidad sustancial" significa que un polipéptido comprende una secuencia que tiene al menos 66% o más de aminoácidos en común. Otra indicación de que las secuencias de polipéptidos son sustancialmente idénticas es si un péptido es inmunológicamente reactivo con anticuerpos creados contra el péptido descrito. De este modo, los péptidos de la invención incluyen péptidos y otros químicos inmunológicamente reactivos con anticuerpos creados contra los péptidos inmunógenos descritos. El término "capaz de enlazarse" como se utiliza en la presente se refiere al enlace de dos moléculas para formar un complejo una con la otra, por ejemplo, el enlace de un ligando a una protelna o a un péptido, bajo condiciones en las cuales las dos o más moléculas son capaces de formar un - - complejo, tal como un complejo de proteína-ligando. Ligandos que se enlazan a una secuencia de aminoácidos particular de PrP Los ligandos de enlace a prión descritos en la presente son todos moléculas pequeñas, preferentemente péptidos. Los ligandos se enlazan a péptidos, polipéptidos derivados de la proteína prión, o a la molécula prión completa. Como se utiliza en la presente, no se implica una longitud particular por el término "péptido" . Preferentemente, los ligandos descritos en la presente se enlazan a una proteína prión que tiene una o más de las siguientes secuencias de aminoácidos : RYPxQ (SEQ ID NO: 221) , en donde x es G, P o N XxYYux (SEQ ID NO: 222), en donde x es cualquier aminoácido, y u es R o Q. Más preferentemente los ligandos se enlazan a una proteína prión que tiene una o más de las siguientes secuencias de aminoácidos : RYPGQ (SEQ ID NO:l) DRYYRD (SEQ ID NO: 2) QAYYQR (SEQ ID NO: 3) QVYYRP (SEQ ID NO: 4) Los péptidos marcados que tienen una o más de las secuencias de aminoácidos proporcionadas anteriormente son útiles cuando se utilizan para sondear bibliotecas - - combinatorias para ligandos que se enlazan a priónes . Preferentemente, los péptidos se radio marcan y se acetilan en el término amino y se amidan en el término carboxi al utilizarse para seleccionar bibliotecas para ligandos prión. La secuencia de aminoácidos de los ligandos descritos en la presente carecen de las secuencias de aminoácidos descritas en la WO 01/77687, que se enlaza a la secuencia de repetición del octapéptido de la proteina prión. En una primera modalidad preferida, el ligando es una proteína o péptido que tiene una secuencia de aminoácidos que se enlaza a la SEQ ID NO : 1. Las secuencias de aminoácidos mencionadas en la Tabla 1 abajo (SEQ ID NOS: 5-13) son ejemplos de secuencias de aminoácidos que se enlazan a la SEQ ID NO:l. En consecuencia, los ligandos que tienen una o más de las secuencias mencionadas en la Tabla 1 se incluyen en los ligandos de la primera modalidad preferida. Las secuencias de aminoácidos mencionadas en la Tabla 1 se identificaron en una biblioteca de 6-mer seleccionada para 6-mers que se enlazan a la SEQ ID NO:l. La biblioteca se construyó con una alanina (A) como separador entre la resina y los péptidos combinatorios de la biblioteca y se representa como la A final en las secuencias que se incluyen en la Tabla 1. Se entenderá por los expertos en la técnica que los ligandos proporcionados en la presente no se limitan a los que tienen las secuencias ej emplificativas mencionadas en la Tabla 1. Tabla 1 Secuencias de seis aminoácidos que se enlazan a la SEQ En una segunda modalidad preferida, el ligando es una proteina o péptido que tiene una secuencia de aminoácidos que se enlaza a la SEQ ID NO:2. Las secuencias de aminoácidos mencionadas en la Tabla 2 abajo (SEQ ID NOS: 14- 22) son ejemplos de secuencias de aminoácidos que se enlazan a la SEQ ID NO:2. En consecuencia, los ligandos que tienen una o más de las secuencias mencionadas en la Tabla 2 se incluyen en los ligandos de la segunda modalidad preferida. Las secuencias de aminoácidos mencionadas en la Tabla 2 se identificaron en una biblioteca de 6-mer seleccionada para 6- mers que se enlazan a la SEQ ID NO:2. La biblioteca se construyó con una alanina (A) como separador entre la resina y los peptidos combinatorios de la biblioteca y se representa como la A final en las secuencias. El aminoácido lisina ( ) se encuentra presente once veces, y el aminoácido histidina (H) se encuentra presente siete veces, ambos se encuentran por encima de una distribución promedio de tres. En consecuencia, se prefieren seis mers que contienen el aminoácido lisina (K) o histidina (H) . Se entenderá por los expertos en la técnica que los ligandos proporcionados en la presente no se limitan a los que tienen las secuencias ej emplificativas mencionadas en la Tabla 2. Tabla 2 Secuencias de seis aminoácidos que se enlazan a la SEQ ID En una tercera modalidad preferida, el ligando es - - una proteína o péptido que tiene una secuencia de aminoácidos que se enlaza a la SEQ ID N0:3. Las secuencias de aminoácidos mencionadas en la Tabla 3 abajo (SEQ ID NOS: 23-31) son ejemplos de secuencias de aminoácidos que se enlazan a la SEQ ID N0:3. En consecuencia, los ligandos que tienen una o más de las secuencias mencionadas en la Tabla 3 se incluyen en los ligandos de la tercera modalidad preferida. Las secuencias de aminoácidos mencionadas en la Tabla 3 se identificaron en una biblioteca de 6-mer seleccionada para 6-mers que se enlazan a la SEQ ID N0:3. La biblioteca se construyó con una alanina (A) como separador entre la resina y los péptidos combinatorios de la biblioteca y se representa como la A final en las secuencias . En los casos de ambigüedad de secuencia, en la identificación se dan uno o más aminoácidos en una sola posición en la Tabla, por ejemplo, (A/G) como se muestra en la SEQ ID NO: 29. El aminoácido histidina (H) aparece diez veces en estas secuencias, se encuentra en seis de los ocho péptidos y se encuentra por encima de una distribución promedio de tres. Todos los péptidos excepto la SEQ ID NO: 23 tienen una carga positiva neta a un pH 7. En consecuencia, se prefieren seis mers que contienen el aminoácido histidina (H) y los péptidos que tienen una carga positiva neta a un pH 7. Se entenderá por los expertos en la técnica que los ligandos proporcionados en la presente no se limitan a los que tienen las secuencias ejemplificativas mencionadas en la Tabla 3. Tabla 3 Secuencias de seis aminoácidos que se enlazan a la SEQ ID En una cuarta modalidad preferida, el ligando es una proteína o péptido que tiene una secuencia de aminoácidos que se enlaza a la SEQ ID NO:4. Las secuencias de aminoácidos mencionadas en la Tabla 4 abajo (SEQ ID NOS: 31- 47) son ejemplos de secuencias de aminoácidos que se enlazan a la SEQ ID N0:4. En consecuencia, los ligandos que tienen una o más de las secuencias mencionadas en la Tabla 4 se incluyen en los ligandos de la cuarta modalidad preferida. Las secuencias de aminoácidos mencionadas en la Tabla 4 se identificaron en una biblioteca de 6-mer seleccionada para 6- mers que se enlazan a la SEQ ID NO:4. La biblioteca se construyó con una alanina (A) como separador entre la resina - - y los péptidos combinatorios de la biblioteca y se representa como la A final en las secuencias . Se entenderá por los expertos en la técnica que los ligandos proporcionados en la presente no se limitan a los que tienen las secuencias ej emplificativas mencionadas en la Tabla 4. En los casos de ambigüedad de secuencia, en la identificación se dan uno o más aminoácidos en una sola posición, por ejemplo, (W/G) como se muestra en la SEQ ID NO: 33. El aminoácido en la segunda posición de la SEQ ID NO: 37 podría no identificarse positivamente. La secuencia "LL" (dos leucinas) aparece en las SEQ ID NOS: 31, 32, 41, 43 y 45 y sus análogos cercanos LL, VL, II (isoleucina o valina) aparecen en las SEQ ID NOS: 33, 36, 38, 40 y 44. LL no aparece en ninguna otra selección para péptidos o proteínas derivadas de prión. En adición, 15 de los 17 péptidos contienen un aminoácido aromático tal como fenilalanina, triptofán o tirosina (F, W o Y) . Siente secuencias de péptidos se encuentran neutralmente cargadas, pero tienen un grupo amino terminal positivo. En consecuencia, se prefieren seis mers que contienen una o más leucinas (L) o análogos de leucina tales como isoleucina o valina (I o V) en la secuencia, preferentemente LL, LI, VL o II; seis mers que contienen un aminoácido aromático tal como fenilalanina, triptofán, o tirosina (F, W o Y) ; y seis mers que se encuentran neutralmente cargados pero tienen un grupo amino terminal positivo.

- - Tabla 4 Secuencias de seis aminoácidos que se enlazan a la SEQ Lxgandos que se enlazan a PrPc de hámster En otra modalidad, el ligando es un péptido que se enlaza con especificidad y selectividad a una o más formas de proteina prión encontradas en una especie particular, tal - - como la humana o de otro mamífero tal como un hámster. Se proporcionan abajo ligandos ej emplificativos que se enlazan a proteina prión (PrPc) que tienen diferentes longitudes de secuencia de aminoácidos, dos-mer, tres-mers, cuatro-mers, cinco-mers y seis-raers, teniendo preferentemente un peso molecular de 6 kDa o menor. Los ligandos ejemplificativos de dos mer que se enlazan a prión nativo en hámsters (haPrPc) , se mencionan en las SEQ ID NOS:48-50 listadas en la Tabla 5A, . El ligando contiene preferentemente el aminoácido triptofán (W) . El ligando preferido se carga neutralmente, pero tiene un grupo amino terminal de carga positiva a un pH 7. El ligando preferido es uno de dos mer que contiene el triptofán (W) . La sustitución de naftil-alanina (na) por triptofán también dio como resultado el enlace de PrP en estas secuencias . La biblioteca se sintetizó directamente sobre la resina (una resina de amino Toyopearl Tosoh Bioscience LLC, Monctgomerville, PA) sin separador. La SEQ ID NO: 50 se encontró dos veces (2x) en las selecciones. Tabla 5 Secuencias de dos aminoácidos que se enlazan a haPrPc 2x denota las secuencias encontradas dos veces en la - - selección Los ligandos ejemplificativos de tres mer que se enlazan a prión en hámsters ( aPrPc) , se mencionan en las SEQ ID NOS:51-61 listadas en la Tabla 5B. Un aminoácido aromático F, W o Y aparece en todos los péptidos excepto en la SEQ ID NO: 60. El aminoácido A aparece tres veces en la posición más cercana a la resina y se utilizó como separador entre la resina y la biblioteca de péptidos en las mismas bibliotecas. Ni R ni K se encuentran presentes, pero E aparece tres veces proporcionando una carga negativa a tres de las ocho secuencias . Tabla 5B - - Los ligandos ej emplificativos de cuatro mers que se enlazan a prión en hámsters (haPrPc) se mencionan en las SEQ ID NOS: 62-64 listadas en la Tabla 5C. La biblioteca se construyó con un separador alanina entre la resina y el péptido combinatorio y se encuentra presente en las secuencias abajo en la última posición. Un aminoácido aromático aparece en la primera posición de todos los péptidos seleccionados. En adición, todos los péptidos seleccionados contienen un aminoácido acídico (D o E) en la tercera o cuarta posición. XD aparece una vez, en donde X es cualquier aminoácido. Tabla 5C Secuencias de cuatro aminoácidos que se enlazan a haPrPc Los ligandos ej emplificativos de cinco mers que se enlazan a prión en hámsters (haPrPc) se mencionan en las SEQ ID NOS:65-68 listadas en la Tabla 5D. Un aminoácido aromático y un aminoácido acidico aparecen en todos los péptidos seleccionados. D o E se encuentran presentes en la posición 4 o 5 de todos los ligandos. La secuencia WXD aparece en la SEQ ID NO: 65, 67 y 68. Tabla 5D - - Secuencias de cinco aminoácidos que se enlazan a haPrPc Los ligandos ej emplificativos de seis mers que se enlazan a prión en hámsters (haPrPc) se mencionan en las SEQ ID NOS: 69-100 listadas en la Tabla 5E. La biblioteca se construyó con un separador de alanina entre la resina y el péptido combinatorio y se encuentra presente en las secuencias abajo en la última posición. Un aminoácido aromático, F, W o Y aparece en la mayoría (29 de 32) de los peptidos seleccionados como en D o E (29 de 32) . En adición, 20 peptidos tienen dos aminoácidos aromáticos en su secuencia. La secuencia de consenso "WXD" aparece en las SEQ ID NOS: 75, 79, 83, 86 y 89. Una secuencia que contiene una (F/W/Y) X(D/E) (F/W/Y) SEQ ID NO) ) aparece en las SEQ ID NOS : 71, 73, 77, 78, 91 y 95 y (F/W/Y) (O/E) X (F/W/Y) SEQ ID NO)) aparece en las SEQ ID NOS: 70, 72, 82, 91 y 95. Veinticuatro de 32 peptidos tienen un aminoácido aromático más un grupo ácido en las posiciones 1-3; 23 tienen una carga negativa neta en las posiciones 4-6. Veinte peptidos tienen tanto un aminoácido aromático como un aminoácido ácido en las posiciones 1-3 y también una carga negativa neta en las - - posiciones 4-6. TABLA Secuencias de seis aminoácidos que se enlazan a haPrPc SEQ ID NO SECUENCIA 69 WDEAEEA 70 YDSYDDA 71 NDFIDFA 72 YEPWGSA 73 EYGDWWA 74 WDYDQEA 75 D GDPFA 76 DWPEVWA 77 FHDFSEA 78 DTFWDYA 79 WNDLDNA 80 ASALVYA 81 LINAGGA 82 WESYVTA 83 WSDEGYA 84 YRWTGPA 85 YEDQWQA 86 EWADDNA 87 YEIDYGA 88 EFGYFDA 89 WGDEQDA - - Ligandos que se enlazan a PrPc de hámster y PrPsc de hámster En otra modalidad, el ligando es un péptido que se enlaza con especificidad y selectividad a dos o más formas de prión. Se proporcionan abajo ligandos que se enlazan tanto a (PrPc) como a las proteínas prión cambiadas en su conformación (PrPsc) . Los ligandos ej emplificativos de tres mere que se enlazan a prión en hámsters (haPrPc) se mencionan en las SEQ ID NOS : 101-115 listadas en la Tabla 6. Un aminoácido aromático aparece en la mayoría (15 de 18) de los péptidos seleccionados como en D o E (15 de 18) . En adición, siete péptidos tienen dos estructuras aromáticas y un aminoácido acidice La secuencia WXD aparece en las SEQ ID NOS: 105 y 115. Las estructuras seleccionadas para enlazarse de preferencia a PrPsc sobre PrPc son la SEQ ID NO: 111 y la SEQ ID NO: 114, teniendo ambas R en la posición 3. Las SEQ ID NOS: 101-115 se identificaron en una biblioteca de 3 mer para enlazarse a haPrPc y/o PrPsc a partir de homogenados de cerebro infectado con encefalopatía espongiforme ovina ya sea solo (*) o mezclado con cerebro normal de hámster.

Tabla 6 Secuencias de tres aminoácidos que se enlazan a haPrPc haPrPsc 111 VQR Rosa brillante Muy fuerte 112 YID Rosa brillante Fuerte 113 RWD* Rosa brillante Fuerte 114 DVR* Blanco Fuerte 115 WSD* Roj o Fuerte Ligandos que se enlazan a PrPc humana Se proporcionan abajo ligandos que se enlazan a la proteína prión (huPrPc) . Los ligandos ej emplificativos de tres mers que se enlazan a prión en humanos (huPrPc) se mencionan en las SEQ ID NOS:116-139 listadas en las Tablas 7A y B. De las secuencias trímero (Tabla 7A) , W/YXD aparece en cuatro de las seis secuencias trímero, y cinco de las seis tienen un residuo aminoácido hidrofobico y acídico. Tabla 7? Secuencias de tres aminoácidos que se enlazan a huPrPc La biblioteca de seis mer se construyó con un separador alanina entre la resina y el péptido combinatorio y se encuentra presente en las secuencias abajo en la última - - posición (Tabla 7B) . Los aminoácidos F, W o ? aparecen en 13 de los 18 péptidos de 6 mer y D o E en 17 de los 18 peptidos. Seis peptidos tienen un aminoácido aromático y uno ácido en las posiciones 1-3 y también son negativos netos en las posiciones 4-6. En adición, cinco péptidos tienen dos estructuras aromáticas y un aminoácido ácido. WxD se encuentra presente en la SEQ ID NO: 124 y (F/W/Y)x(D/E) (F/W/Y) (SEQ ID NO: 223) se encuentra presente en las SEQ ID NOS: 124 y 133. Excluyendo la carga del amino N-terminal la mayoría de las secuencias son negativas netas y solo la SEQ ID NO: 139 contiene una carga positiva neta parcial a un pH neutro. Las SEQ ID NOS: 116-121 se identificaron en una biblioteca de 3 mers para enlazarse a huPrPc a partir de homogenados de cerebro humano normal. Las SEQ ID NOS: 122-139 se identificaron en una biblioteca de 6 mers para enlazarse a huPrPc humana derivada tanto de plasma pobre en plaquetas como de plasma rico en plaquetas (*) . Tabla 7B Secuencias de seis aminoácidos que se enlazan a huPrPc SEQ ID NO SECUENCIA 22 BADEA 23 YYVDAA 24 QDFNLA 25 DNPIDA 26 FNEHEA - - *huPrPc enlazada derivada de plasma rica en plaquetas Ligandos que se enlazan a PrP recombinante humana Se proporcionan abajo ligandos que se enlazan a proteína prión recombinante (PrPr) . Los ligandos ej emplificativos de tres mers que se enlazan a prión recombinante en humanos (huPrPr) se mencionan en las SEQ ID NOS: 54, 105, 140-153 listadas en la Tabla 8. Los aminoácidos W, F, o Y aparecen en todos los 16 péptidos seleccionados y D o E en 13 de los 16 péptidos. La secuencia de consenso WXD aparece en las SEQ ID NOS: 105, 143 y 145. Algunos péptidos se han identificado previamente por enlazarse a PrPc y se identificaron las SEQ ID NOS: 149 y 153 en esta selección.

- - Las SEQ ID NOS : 54-105, 140-153 se identificaron en una biblioteca de 3 mer por enlazarse a huPrPr (Priónics AG, Suiza, Cat. #03-040) diluida en (*) sarcosil al 0.5% o (**) PBS . En la Tabla 8, 2.5 mg de peso seco de resina de una biblioteca combinatoria por columna se expusieron a 0.5 mg/ml de PrPr diluida en sarcosil al 0.5% (*) o en salina amortiguada con fosfato (**) conteniendo BSA al 1%. Las secuencias encontradas dos veces en la selección se denotan 2x. Tabla 8 Secuencias de tres aminoácidos que se enlazan a huPrPr SEQ ID NO SECUENCIA 54 YEY** 105 QD* Y ** (2x) 140 YDW* 141 NYT* 142 SYT* 143 WAD* 144 QWG* 145 WGD* 146 EYF* 147 WEH* 148 LYD* 149 DYY** (2x) 150 FYE** - - (*) PrPr humana diluida en sarcosil al 0.5% (**) PrPr humana diluida en PBS 2x denota las secuencias encontradas dos veces en la selección. Ligandos de seis mer que se enlazan a PrPc humana, PrPsc humana o a ambas Los ligandos de seis mer que se enlazan a la proteína prión (PrPc) , proteína prión (PrPsc) o a ambas, se proporcionan en la TABLA 9A. La biblioteca de seis mer se construyó con un separador alanina entre la resina y el péptido combinatorio y se encuentra presente en las secuencias abajo en la última posición. Los ligandos pueden enlazarse de preferencia a huPrPsc. Los ligandos ej emplificativos se mencionan en las SEQ ID NOS : 154-173 que se listan en la Tabla 9A. Todos los ligandos excepto la SEQ ID NO: 156 contenían un aminoácido aromático y 15 de 20 contenían un aminoácido acídico. Aquellas con mayor especificidad para huPrPsc sobre PrPc son las SEQ ID NOS: 154, 155 y 156. La detección de ligandos con una especificidad aumentada para PrPsc en un homogenado cerebral derivado de un paciente con CJD esporádica, se obtuvo a través de la proteolisis selectiva de PrPc previo a la transferencia de - - proteína de las perlas a la membrana. Esta biblioteca incluyó el aminoácido aromático no natural 2-naftil-alanina (na) . Tabla 9A Secuencias de seis aminoácidos que se enlazan a huPrPc, huPrPsc o ambas homogenado cerebral de CJD esporádica (huPrPsc) al 0.5% sin tratamiento con P ** homogenado cerebral de huPrPsc al 5% sin tratamiento con PK *** homogenado cerebral de huPrPsc al 0.5% con tratamiento con PK, pero sin desarrollo de color **** homogenado cerebral de huPrPsc al 5% con tratamiento con PKm pero sin desarrollo de color na denota 2-naftil alanina Ligandos que se enlazan a PrPsc humana Se proporcionan abajo ligandos que se enlazan a proteína prión cambiada en su conformación (PrPsc) . Las bibliotecas de seis mer se construyeron con un separador alanina entre la resina y el péptido combinatorio y se incluyen en las secuencias abajo en la última posición. Los ligandos ejemplificativos se mencionan en las SEQ ID N0S:174- 194, listadas en la Tabla 9B . Las SEQ ID NOS: 188, 189, 190 y 191 mostraron todas la mayor diferenciación de señal (señal de color blanco y de luz fuerte) . Las SEQ ID NOS: 174-194 se identificaron en una biblioteca de 6 mer por enlazarse a huPrPsc de homogenado cerebral de CJD esporádico fijado en plasma humano. Las perlas con ligandos con la más alta especificidad para PrPsc fueron blancas al colorearse para - - PrPc, pero produjeron una fuerte señal quimioluminiscente después de la desnaturalización. Tabla 9B Secuencias de seis aminoácidos que se enlazan a huPrPsc * perlas de 100-300 µta seleccionadas con homogenado cerebral derivado de cerebro con CJD esporádica (huPrPsc) con - - tratamiento con PK ** perlas de 100.300 µt? seleccionadas con huPrPsc sin tratamiento con PK *** perlas de 65 µt? seleccionadas con huPrPsc sin tratamiento con PK Ligandos de tres mer que se enlazan a PrPc humana, PrPsc .humana o a ambas Se proporcionan abajo ligandos de tres mer que se enlazan a la proteína prión (huPrPc) , proteina prión cambiada en su conformación (PrPsc), o a ambas. Los ligandos pueden enlazarse preferentemente a huPrPsc. Los ligandos ej emplificativos se mencionan en las SEQ ID NOS: 195-212, listadas en la Tabla 9C. En esta selección, el homogenado cerebral de CJD esporádica se diluyó en CPD y se utilizó como la uente de huPrPsc . HYD se descubrió 3 veces en esta selección. Las perlas rojas significaron el enlace de PrPc,-8 de las 13 secuencias contenían H. Se encontraron los aminoácidos F, W o Y en todas las 13 y R o K aparecieron solo una vez . Tres de las cuatro perlas que se enlazaron de preferencia a PrPsc (fuerte señal) en relación a PrPc (perla blanca) contenían K o R. XD apareció en las SEQ ID NOS: 200 y 208. Las SEQ ID NOS: 195-212 se identificaron en una biblioteca de 3 mer por enlazarse a huPrPc y/o a huPrPsc tratada con PK. Tabla 9C - - Secuencias de tres aminoácidos que se enlazan a huPrPc, huPrPsc o a ambas (resistentes a PK) huPrPsc al 0.5% en sarcosil al 0.05% más tratamiento con PK ** huPrPsc al 1.0% en sarcosil al 1.0% sin tratamiento con - - PK *** uPrPsc al 1.0% en sarcosil al 0.1% con tratamiento con PK **** as perlas se seleccionaron a partir del gel antes de la transferencia; para las SEQ ID NOS: 204 y 205, las perlas incubadas en huPrPsc al 0.1% en sarcosil al 0.01% con tratamiento con PK se seleccionaron después de lavar y se tomaron directamente del gel . Ligandos de tres mer que se enlazan a PrPc humana, PrPsc humana o ambas Se proporcionan abajo ligandos de tres mer que se enlazan a la proteina prión (PrPc) , a la proteína prión cambiada en su conformación (PrPsc) o a ambas. Los ligandos pueden enlazarse de preferencia a huPrPsc . Los ligandos ejemplificativos se mencionan en las SEQ ID NOS: 147, 152, 206, 213 y 214, listadas en la Tabla 9D. Estas secuencias se identificaron en una biblioteca de 3 mer por enlazarse a huPrPsc y/o a huPrPc a partir de homogenado cerebral de CJD esporádica diluido en (*) amortiguador CPD o (**) PBS . Tabla 9D Secuencias de tres aminoácidos que se enlazan a huPrPc, huPrPsc o ambas SEQ ID NO Secuencia 147* WEH 152* YDY - - (*) homogenado cerebral de CJD esporádica diluido en amortiguador CPD (**) homogenado cerebral de CJD esporádica diluido en PBS Síntesis de Ligandos Los ligandos descritos en la presente pueden producirse mediante síntesis clínica. Una variedad de métodos de síntesis de proteínas son comunes en la técnica, incluyendo la síntesis utilizando un sintetizador de péptido. Ver por ejemplo, Peptide Chemistry, ? Practical Textbook, Bodasnsky, Ed. Springer-Verlag, 1988; Merrifield, Science 232:241-247 (1986). Preferentemente, los péptidos se sintetizan, se purifican y después se acoplan a una resina o a una membrana utilizada para la selección. Alternativamente, los péptidos se sintetizan directamente sobre una resina, y los péptidos enlazados a la resina se purifican entonces. Los péptidos se purifican a fin de que se encuentren sustancialmente libres de precursores químicos u otros químicos utilizados en técnicas estándar de purificación de péptidos. El lenguaje "sustancialmente libre de precursores químicos u otros químicos" incluye preparaciones de un péptido en las cuales el péptido se - - separa de precursores químicos u otros químicos que se encuentran involucrados en la síntesis del péptido. La síntesis química de los péptidos facilita la incorporación de aminoácidos modificados o naturales, incluyendo aminoácidos D y otras moléculas orgánicas pequeñas . El reemplazo de uno o más de los aminoácidos L en un péptido con la isoforma del aminoácido D correspondiente puede utilizarse para incrementar la resistencia de los péptidos a la hidrólisis enzimática, y para mejorar una o más de las propiedades de los péptidos activos, tales como el enlace a prión o al ligando. El péptido prión y los ligandos de péptido descritos en la presente pueden ser polímeros de los aminoácidos L o D, o una combinación de ambos. También se encuentran incluidos ligandos en los cuales los análogos de los ligandos del péptido descritos en la presente se encuentran presentes en enlaces no peptidilo. Por ejemplo, en varias modalidades, los ligandos del péptido son péptidos de isómero D-retro-inverso . El término "isómero retro-inverso" se refiere a un isómero de un péptido lineal en el cual la dirección de la secuencia se revierte y la quiralidad de cada residuo de aminoácido se invierte. Ver, por ejemplo, Jameson et al., Nature , 368:744-746 (2994). El resultado neto de la combinación de D-enantiomeros y síntesis de reversa es que las posiciones de los grupos caxbonilo y amino en cada enlace de amida se - - encuentran intercambiados, mientras que la posición de los grupos de cadena lateral en cada carbono alfa se preserva. A menos que se defina de otra manera, se presume que cualquier secuencia de aminoácido L dada de la invención puede convertirse en un péptido de isómero D-retro-inverso . Pueden introducirse enlaces transversales covalentes en la secuencia de péptidos para restringir la estructura de la columna del péptido. Esta estrategia puede utilizarse para desarrollar análogos de péptido con potencia incrementada, la selectividad y estabilidad. La macrociclización se logra frecuentemente formando un enlace de amida entre los términos N y C del péptido, entre una cadena lateral y el término N o C, por ejemplo, con K3Fe(CN)6 a pH 8.5 (Samson et al., Endocrinology, 137:5185-5185 (1996)) o entre dos cadenas laterales de aminoácidos. Ver, por ejemplo, DeGrado, Adv. Protein Chem. 39:51-124 (1988). Un número de otros métodos pueden introducir también restricciones de conformación en secuencias de péptidos a fin de mejorar su potencia, estabilidad y selectividad. Estos incluyen el uso de ácidos C cx-metilamino (ver, por ejemplo, Rose et al., Adv. Protein Chem, 37:1-109 (1985)) o ácidos N- a-metilamino (ver, por ejemplo, Aubry et al., Int. J. Pept. Protein Res., 18:195-202 (1981)). Si se desea, pueden encontrarse presentes dos o más ligandos en múltiples copias. Copias idénticas de uno o más - - péptidos pueden encontrarse presentes (por ejemplo, omodímeros, homotrímeros, etc.), o pueden encontrarse presentes múltiples copias de péptidos variando en secuencia (por ejemplo, heterodímeros, heterotrímeros, etc.). En una alternativa, los ligandos se sintetizan utilizando metodología recombinante de ácido nucleico. Generalmente, esto implica crear una secuencia de ácido nucleico que codifica los ligandos, colocar el ácido nucleico en un cásete de expresión bajo el control de un promotor particular, expresar la proteina en un huésped, aislar la proteína expresada y, si se requiere, re-naturalizar la proteína. Se conocen por los expertos en la técnicas suficientes técnicas para guiar al experto a través de tales procedimientos . Una vez expresados, los ligandos recombinantes pueden purificarse de acuerdo con procedimientos estándar, incluyendo precipitación de sulfato de amonio, columnas de afinidad, cromatografía de columna, electroforesis de gel y lo similar. Se prefieren composiciones sustancialmente puras de aproximadamente 50 a 95% de homogeneidad, y de aproximadamente 80 a 95% o mayor homogeneidad son más preferidas para su uso como agentes terapéuticos. Opcionalmente, los ligandos se combinan en proteínas mosaico. Típicamente, de 2 a 20 de los ligandos se fusionan en un solo polipéptido mediante técnicas - - recombinantes o sintéticas. En procedimientos recombinantes, las proteínas mosaico se producen ligando ácidos nucleicos sintéticos o recombinantes que codifican para péptidos inmunogénicos . Estos ácidos nucleicos pueden ligarse enzimátic mente (por ejemplo, utilizando una enzima ADN ligasa) o sintéticamente. Alternativamente, puede sintetizarse un solo ácido nucleico que codifica para péptidos de ligando múltiple. En cualquiera de los casos, el ácido nucleico resultante codifica múltiples ligandos, todos en el mismo marco de lectura. De este modo, el polipéptido traducido comprende ligandos que se enlazan a prión. Cuando los ligandos se producen mediante procedimientos automatizados químicos sintéticos, los concatámeros de los péptidos pueden acoplarse directamente. Esto se lleva a cabo químicamente uniendo los péptidos utilizando métodos químicos estándar. Alternativamente, puede producirse sintéticamente un polipéptido que codifica para péptidos de ligando múltiple. Identificación de ligandos En adición a los ligandos antes mencionados en las tablas, pueden identificarse ligandos adicionales como sigue. Se sintetizan y se seleccionan bibliotecas dde péptidos por su habilidad para enlazarse a analitos prión. Los ligandos pueden ser de cualquier longitud. Sin embargo, se prefieren - - longitudes de dos a seis aminoácidos . Los péptidos sintéticos se inmovilizan en perlas, y las perlas se empacan en una columna de cromatografía. analito prión pas entonces a través de la columna y el analito enlazado se detecta utilizando métodos convencionales tales como mediante un anticuerpo marcado específico para la proteina prión. Las perlas a las cuales se ha enlazado el analito se identifican como 1igandos adecuados. Uso de Ligandos para Retirar Priones Los ligandos que enlazan priónes o fragmentos de priónes son útiles para una variedad de aplicaciones analíticas, de preparación, y de diagnóstico. Los ligandos que enlazan priónes pueden inmovilizarse en un soporte tal como una perla o membrana, y utilizarse para enlazar y retirar priónes de una muestra. Se deja que la fase sólida a la cual se enlazan los ligandos haga contacto con la muestra, tal como un fluido biológico, bajo condiciones suficientes para ocasionar la formación de un compuesto de prión-ligando, y la proteína prión en la muestra se enlaza al ligando. La fase sólida se separa entonces de la muestra, retirando así la proteína prión enlazada al ligando, que se une a la fase sólida, de la muestra. Por ejemplo, las resinas y membranas para retirar contaminantes son muy conocidas en la técnica tal como las descritas en la Patente de E.U. No. 5,834,318 para Baumbach et al., y la PCT/US01/11150.

- - Ejemplos de muestras biológicas incluyen, pero no se limitan a, sangre, composiciones derivadas de sangre o suero. Las muestras biológicas adicionales incluyen fluido cerebroespinal, orina, saliva, leche, fluido de conducto, lágrimas o semen. Otras muestras pueden contener colágeno, extractos cerebrales y glandulares . Muchos métodos para inmovilizar moléculas a una variedad de superficies sólidas se conocen en la técnica. Por ejemplo, la superficie sólida puede ser una membrana (por ejemplo, nitrocelulosa) , un plato de microtitulación (por ejemplo, PVC, polipropileno, o poliestireno) , un tubo de ensayo (de vidrio o plástico), una varilla medidora (e.g., de vidrio, PVC, polipropileno, poliestireno, látex y lo similar) , un tubo de microcentrifuga, o una perla de vidrio, sílice, plástica, metálica o de polímero. El componente deseado puede encontrarse unido covalentemente o unido no covalentemente a través de un enlace no especifico. Una amplia variedad de polímeros orgánicos e inorgánicos, tanto naturales como sintéticos pueden emplearse como el material para la superficie sólida. Los polímeros ilustrativos incluyen polietileno, polipropileno, poli (4-metilbuteno) , poliestireno, polimetacrilato, poliacrilato, poli (etileno tetreftalato) , rayón, nilón, poli (vinil butirato) , polivinildeno difluoruro (PVDF) , siliconas, poliformaldehído, celulosa, celulosa acetato, nitrocelulosa y - - lo similar. Otros materiales que pueden emplearse, incluyen papel, vidrios, cerámicas, metales, metaloides, materiales semiconductores, cementos o lo similar. En adición, pueden utilizarse sustancias que forman geles, tales como las proteínas (por ejemplo, gelatinas) , lipopolisacáridos, silicatos, agarosa y poliacrilamidas . También son adecuados los polímeros que forman varias fases acuosas, tales como dextranos, polialquilen glicoles o surfactantes, tales como fosfolípidos, sales de alquil amonio de cadena larga (12-24 átomos de carbono) y lo similar. Cuando la superficie sólida es porosa, pueden emplearse diversos tamaños de poro dependiendo de la naturaleza del sistema. En adición, el péptido puede incorporarse durante la polimerización de la superficie sólida. Al preparar la superficie, puede emplearse una pluralidad de diferentes materiales, por ejemplo, laminados, para obtener diversas propiedades. Por ejemplo, pueden utilizarse recubrimientos de proteína, tales como gelatina, para evitar el enlace no específico, simplificar la conjugación covalente y mejorar la detección de señal o lo similar. Si se desea un enlace covalente entre un compuesto y la superficie, la superficie será comúnmente polifuncional o será capaz de polifuncionalizarse . Los grupos funcionales que pueden encontrarse presentes en la superficie y - - utilizarse para el enlace incluyen ácidos carboxílicos , aldehidos, grupos amino, grupos ciano, grupos etilénicos, grupos hidroxilo, grupos mercapto y lo similar. La manera de enlazar una amplia variedad de compuestos a diversas superficies es muy conocida y se ilustra ampliamente en la literatura . Las proteínas prión también pueden separarse de otras proteínas en una muestra utilizando cromatografía de afinidad. Los ligandos de acuerdo con la invención pueden unirse a un soporte sólido, tal como una resina o una membrana, y utilizarse para enlazar y retirar el prión de la solución. En este ejemplo, el ligando puede acoplarse a un soporte sólido, por ejemplo, un soporte inerte tal como una membrana o una resina, y la proteína prión se enlaza al agente inmovilizado. El agente/prión inmovilizado puede detectarse por medio de anticuerpos. Si se desea, una o más de las secuencias obtenidas de la selección inicial puede inmovilizarse en una resina, tal como polimetacrilato o agarosa. Otros tipos de resina que pueden utilizarse incluyen, por ejemplo, sefarosa, agarosa reticulada, polisacáridos reticulados compuestos, celita, PVDF, acrilato, poliestireno y celulosa. Las membranas, tales como, nylon y celulosa, también pueden utilizarse. La resina puede ser una resina de polimetacrilato. Uso de Ligandos para Detectar Priónes Los ligandos descritos en la presente también son útiles en un método para detectar la presencia de o cuantificar, una proteína prión en una muestra biológica. Una muestra biológica tal como, pero sin limitarse a, las descritas anteriormente, se pone en contacto con un ligando bajo condiciones suficientes para ocasionar la formación de un complejo entre la proteína prión y el ligando. El complejo se detecta entonces mediante métodos convencionales, detectando así la presencia del prión en la muestra biológica. El complejo se detecta marcando el ligando, combinando el ligando marcado con la muestra, y detectando el complejo ligando-prion marcado. El ligando se marca durante la producción del ligando, tal como durante la síntesis del péptido, o una marca se conjuga al ligando uniéndola al ligando, ya sea covalentemente o no covalentemente . Alternativamente, una molécula de enlace específica para el ligando, tal como un anticuerpo, se marca y el complejo se detecta indirectamente . Se conoce una amplia variedad de marcas y técnicas de conjugación y se reportan extensamente en la literatura tanto científica como de patente. Las marcas adecuadas incluyen radionucleótidos, enzimas, sustratos, cofactores, inhibidores, residuos fluorescentes, residuos quimioluminiscentes, partículas magnéticas y lo similar.

- - La detección puede proceder mediante cualquier método conocido, tal como inmunoanálisis , inmunotransferencia, ensayos de desplazamiento de la movilidad de gel, análisis de hibridación fluorescentes in situ (FISH) , rastreo de marcadores radiactivos o bioluminiseentes , resonancia magnética nuclear, resonancia paramagnética de electrón, espectroscopia de flujo detenido, cromatografía de columna, electroforesis capilar, u otros métodos que rastrean una molécula en base a una alternación en tamaño o carga o ambas. La marca particular o grupo detectable utilizado en el ensayo no es un aspecto crítico de la invención. El grupo detectable puede ser cualquier material que tenga una propiedad física o química detectable. Tales marcas detectables se han desarrollado mucho, y en general, cualquier marca útil en tales métodos puede aplicarse al método presente. De este modo, una marca es cualquier composición detectable por medios espectroscopicos, fotoquímicos , bioquímicos, inmunoquímicos , eléctricos, ópticos, o químicos. Las marcas útiles en la presente invención incluyen colorantes fluorescentes (por ejemplo, isotiocianato fluorescente, rojo Texas, rodamina, y lo similar), radiomarcas (por ejemplo, 3H. 1251, 35S, 14C o 32P) , enzimas (por ejemplo, LacZ, CAT, peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina y otras, comúnmente utilizadas como enzimas detectables ya sea en EIA o en un ELISA) ,y marcas colorimétricas tales como oro coloidal o vidrio o plástico coloreado (por ejemplo, poliestireno, polipropileno, látex, etc.) . La marca puede acoplarse directamente o indirectamente al componente deseado del ensayo de acuerdo con los métodos muy conocidos en la técnica. Como se indicó anteriormente, puede utilizarse una amplia variedad de marcas, dependiendo la selección de la marca de la sensibilidad requerida, la facilidad de conjugación del compuesto, los requerimientos de estabilidad, la instrumentación disponible y las condiciones de desecho. Las marcas no radiactivas se unen frecuentemente mediante medios indirectos. Generalmente, una molécula de ligando (por ejemplo biotina) se enlaza covalentemente a la molécula. El ligando se enlaza entonces a un anti-ligando (por ejemplo, estreptavidina) , ya sea inherentemente detectable o covalentemente enlazado a un sistema de señal, tal como una enzima detectable, un compuesto fluorescente, o un compuesto quimioluminiscente . Puede utilizarse un número de ligandos y anti-ligandos . Cuando un ligando tiene un anti-ligando natural, por ejemplo, biotina, tirosina y cortisol, éste puede utilizarse en conjunción con los anti-ligandos marcados de origen natural. Alternativamente, puede utilizarse cualquier compuesto hapténíco o antigénico en combinación con un anticuerpo. Las moléculas también pueden conjugarse - - directamente a compuestos que generan señales, por ejemplo, mediante conjugación con una enzima o fluoróforo. Las enzimas de interés como marcas serán principalmente hidrolasas, particularmente fosfatasas, esterasas y glicosidasas, u oxirreductasas, particularmente peroxidasas . Los compuestos fluorescentes incluyen fluorescencias y sus derivados, rodamina y sus derivados, dansilo, umbeliferona, etc. Los compuestos quimioluminiscentes incluyen luciferina y 2,3-dihidroftalazinadionas, por ejemplo, luminol . Los medios para detectar marcas son muy conocidos por los expertos en la técnica. De este modo, por ejemplo, cuando la marca es una marca radiactiva, los medios de detección incluyen un contador de escintilación o película fotográfica como en autorradiografía . Cuando la marca es una marca fluorescente, puede detectarse excitando el fluorocromo con la longitud de onda de luz apropiada y detectando la flurescencia resultante, por ejemplo, por microscopía, inspección visual, a través de película fotográfica, por el uso de detectores electrónicos tales como dispositivos de carga acoplada (CCDs) o fotomultiplicadores y lo similar. De manera similar, las marcas enzimáticas se detectan proporcionando los sustratos apropiados para la enzima y detectando el producto de reacción resultante. Finalmente, las marcas colorimétricas simples pueden detectarse simplemente observando el color asociado con la marca. De - - este modo, en varios ensayos de varilla de inmersión, el oro conjugado frecuentemente aparece como rosa, mientras que varias perlas conjugadas aparecen del color de la perla. Los ligandos de la invención también pueden utilizarse para detectar objetivos extraídos en solución a partir de un material sólido. Por ejemplo, una muestra sólida puede extraerse con un solvente acuoso, uno orgánico, o un fluido crítico y el sobrenadante resultante puede ponerse en contacto con el ligando. Ejemplos de muestras sólidas incluyen productos derivados de animales, particularmente los que se han expuesto a agentes que transmiten priónes, por e emplo, harina de huesos derivada de fuentes bovinas . Los ligandos en algunas modalidades pueden utilizarse para detectar la presencia de proteína prión en la tierra. Otras muestras sólidas incluyen tejido cerebral, tejido córneo, materia fecal, harina de huesos subproductos de res, subproductos de oveja, venado y alce, subproductos de venado y alce, y otros animales y productos derivados de animales . Alternativamente, los complejos de prión-ligando pueden tratarse con PK. PrPc es altamente sensible a PK, mientras que PrPsc se digiere parcialmente para formar PrPres . La molécula PrPres en sí se altamente resistente a la proteólisis. De este modo, el tratamiento de PK digerirá PrPc y convertirá la PrPsc sensible a PK en PrPres. Después del retiro de K, la PrPres puede desnaturalizarse y detectarse por anticuerpos, tales como 3F . En otra modalidad, los ligandos de acuerdo con la invención pueden utilizarse para la concentración selectiva de PrPsc sobre PrPc . Uso de Ligandos para Cuantificar Priones Un complejo de ligando-prión, o alternativamente, un anticuerpo para el ligando o complejo ligando-prión, puede detectarse y cuantificarse mediante cualquiera de un número de medios muy conocidos por los expertos en la técnica. Estos incluyen métodos bioquímicos analíticos tales como espectrofotometría, radiografía, electroforesis, electroforesis capilar, cromatografía líquida de alto desempeño (HPLC) , cromatografía de capa delgada (TLC) , cromatografía de hiperdifusión, y lo similar, y varios métodos inmunológicos tales como reacciones de precipitación de fluido Q de gel, inmunodif sión (única o doble) , inmunoelectroforesis, radioinmunoanálisis ( IAs) , análisis de inmunoabsorbencia enlazada por enzimas (ELISAs) , ensayos inmunofluorescentes, y lo similar. Reducción de Enlace no Específico El experto en la técnica apreciarán que frecuentemente es deseable reducir el enlace no específico en los ensayos y durante el retiro de analito de una muestra. Cuando el ensayo implica un ligando u otro agente e captura inmovilizado en un sustrato sólido, es deseable minimizar la cantidad de enlaces no específicos al sustrato sólido. Los medios para reducir tal enlace no específico son muy conocidos por los expertos en la técnica. Típicamente, esto implica recubrir el sustrato con una composición proteinácea. En particular, se utilizan ampliamente composiciones de proteína tales como albúmina de suero bovino y humano (BSA) , leche en polvo desgrasada, y gelatina. Otros Formatos de Ensayo También puede utilizarse análisis de inmunotransferencia para detectar y cuantificar la presencia de proteína prión en una muestra. La técnica implica generalmente separar los productos de muestra mediante electroforesis de gel en base al peso molecular en presencia de SDS, transferir las proteínas separadas a un soporte sólido adecuado (tal como un filtro de nitrocelulosa, un filtro de nylon, o un filtro de nylon derivado) , e incubar la muestra enlazada con los ligandos descritos en la presente. Los ligandos se enlazan específicamente a un péptido prión fijo al soporte sólido. Estos ligandos se marcan directamente o, alternativamente, pueden detectarse subsecuentemente utilizando anticuerpos marcados que se enlazan específicamente al ligando. Otros formatos de ensayo incluyen inmunoanálisis de liposomas (LLAs) , que utilizan liposomas diseñados para - - enlazar moléculas específicas (por ejemplo, ligandos) y liberan reactivos o marcadores encapsulados . Los químicos liberados se detectan entonces de acuerdo con técnicas est ndar. Composiciones Farmacéuticas Los ligandos descritos en la presente son útiles en aplicaciones terapéuticas y profilácticas para el tratamientos de TSEs ocasionadas por infección de un mamífero con organismos prión. Por ejemplo, en una modalidad, se proporciona un método para tratar TSEs en un mamífero administrando al mamífero una cantidad efectiva de una composición farmacéutica que contiene un vehículo farmacéuticamente aceptable y un ligando sintético o aislado como se describe en la presente. El ligando puede prevenir la polimerización de PrPsc a través de la inhibición del enlace de PrPsc a PrPsc. En adición, puede prevenir la inhibición del enlace de PrPsc a PrPc disminuyendo así la conversión mediada por PrPsc de PrPc a PrPsc retardando en consecuencia el establecimiento de los síntomas clínicos . Además, los ligandos en sí pueden modificarse por la adición de un agente reactivo para dirigir esa molécula al sitio de acumulación de PrPsc. Tales composiciones son adecuadas para su uso en una variedad de sistemas de suministro de drogas . Las enfermedades que van a tratarse de acuerdo con el método, incluyen, pero no se limitan a, BSE, encefalopatía transmisible de visón, encefalopatía felina espongiforme, CWD, CJD, GSS, insomnio fatal, y vCJD. Las composiciones farmacéuticas se pretenden para administración parenteral, tópica, oral o local. Preferentemente, las composiciones farmacéuticas se administran parenteralmente, por ejemplo, por via intravenosa, subcutánea, intradérmica, intranasal o intramuscular. De este modo, la invención proporciona composiciones que comprenden una solución de los agentes descritos anteriormente disueltos o suspendidos en un vehículo aceptable, preferentemente un vehículo acuoso. Puede utilizarse una variedad de vehículos acuosos, por ejemplo, agua, agua amortiguada, salina al 0.4%, glicina al 0.3%, ácido hialurónico, sellador de fibrina y lo similar. Estas composiciones pueden esterilizarse mediante técnicas de esterilización muy conocidas, o pueden filtrarse en forma estéril . Las soluciones acuosas resultantes pueden empacarse para su uso como son, o liofilizarse, combinando la preparación liofilizada con una solución estéril previo a la administración. Las composiciones pueden contener sustancias auxiliares farmacéuticamente aceptables según se requiere para aproximar condiciones fisiológicas, tales como ajuste del pH y agentes amortiguadores, agentes de ajuste de tonicidad, agentes humectantes y lo similar, por ejemplo, acetato de sodio, lactato de sodio, cloruro de sodio, cloruro de potasio, cloruro de calcio, monolaurato de sorbitán, oleato de trietanolamina, etc. Para composiciones sólidas, pueden utilizarse vehículos sólidos no tóxicos convencionales que incluyen, por ejemplo, grados farmacéuticos de manitol, lactosa, almidón, estearato de magnesio, sacarina de sodio, talco, celulosa, glucosa, sucrosa, carbonato de magnesio y lo similar. Para administración oral, una composición no tóxica farmacéuticamente aceptable se forma incorporando cualquiera de los excipientes normalmente empleados tales como los vehículos previamente listados, y generalmente aproximadamente 1% a 95% de ingrediente activo y más preferentemente a una concentración de aproximadamente 25% a 75%. Para administración en aerosol, los polipéptidos se suministran preferentemente en forma finamente dividida junto con un surfactante y propelente. El surfactante, por supuesto, debe ser no tóxico y preferentemente soluble en el propelente. Representativos de tales agentes son los esteres o esteres de ácidos grasos que contienen de 6 a 22 átomos de carbono, tales como los ácidos caproico, octanoico, láurico, palmítico, esteárico, linoleico, olestérico y oleico con un alcohol polihídrico alifático o su anhídrido cíclico. Pueden utilizarse ésteres mezclados tales como glicéridos mezclados o naturales. También puede incluirse un vehículo, según se - - desee, por ejemplo, con lecitina para suministro intranasal . La cantidad administrada variará dependiendo de lo que se administra, el estado del mamífero que recibe el tratamiento y la forma de administración. En aplicaciones terapéuticas, las composiciones se administran a un mamífero que ya sufre de infección prión en una cantidad suficiente para inhibir la propagación de los priones, o al menos disminuir parcialmente los síntomas de la enfermedad y sus complicaciones . Una cantidad adecuada para lograr esto se define como "dosis terapéuticamente efectiva" . Las cantidades efectivas para este uso dependerán de la severidad de la enfermedad, la composición particular, y el peso y estado general del receptor. Generalmente, la dosis se encontrará en el rango de aproximadamente 1 mg a aproximadamente 5 mg por día, preferentemente de aproximadamente 100 mg por día, para un paciente de aproximadamente 70 kg. En adición, el ADN o AKN que codifica los ligandos puede introducirse en mamíferos para obtener la respuesta terapéutica deseada al ligando que codifica el ácido nucleico . La invención se describirá en mayor detalle a modo de ejemplos específicos. Los siguientes ejemplos se ofrecen para propósitos ilustrativos, y no pretenden ni limitar ni definir la invención de ninguna manera.

- - Ej emplo 1 Identificación de Ligandos de enlace Prión Los ligandos de enlace a prión descritos en las Tablas mencionadas en la presente se identificaron como sigue. Síntesis de Biblioteca de Péptidos Los péptidos y las bibliotecas de péptidos útiles para la identificación de los ligandos de enlace a prión descritos en la presente se sintetizaron ya sea por Peptides International (Louisville, KY) o Commonwealth Biotechnologies (Richmon, VA) directamente en amino resina Toyopearl (TosoBioSep Montgomeryville, PA) utilizando química de Fmoc estándar en base a los métodos descritos por Buettner et al. , 1996. Las densidades del péptido logradas con el esquema anterior se encontraron típicamente en el rango de 0.1-0.5 mmol/gramos de resina. Las bibliotecas que comprenden 1, 2, 3, 4, 5, y 6 aminoácidos se sintetizaron. Las bibliotecas de 4, 5 y 6 aminoácidos se sintetizaron en amino Toyopearl y contenían una mezcla de tBOC y Fmoc alanina como separador entre el aminoácido y el grupo amino en la resina. Los péptidos se sintetizaron a partir de Fmoc alanina y el tBoc se acetiló. La presencia de ???" se encontró frecuentemente en la primera posición de esta biblioteca, junto con el aminoácido amino terminal del ligando. Esto se debió probablemente a la desacilación parcial durante la síntesis - - del péptido, la desprotección y/o la degradación Edman durante el secuenciado. En algunas modalidades, las perlas individuales, portando cada una múltiples copias de un ligando único, se inmovilizan en agarosa después del contacto previo con una solución que contiene PrP. Debido a que un gran número de ligandos puede sintetizarse sobre la superficie de las perlas, es posible producir números enormes de perlas cada uno de los cuales teóricamente contiene un ligando único. Estos ligandos se seleccionan utilizando los métodos descritos para las guías iniciales. Una vez que se ha identificado una guía, los ligandos adicionales (sub-bibliotecas) se sintetizan en base al ligando guía. La selección de estas sub-bibliotecas puede conducir a los ligandos adicionales con características mejoradas. A través de un proceso de repetición de síntesis y selección es posible identificar los ligandos preferidos. Selección de enlace de biblioteca de péptidos Se colocaron cantidades variables de perlas (5-500 mg de perlas secas) de una biblioteca en una columna de cromatografía Bio.Spin® desechable (Bio-Rad Laboratories, Cat# 732-6008) , y se lavaron con 20 volúmenes de la columna (CV) de MeOH al 20% en H20 para retirar posibles impurezas y solventes orgánicos utilizados en la síntesis del péptido. Las perlas se lavaron entonces y se equilibraron utilizando 20 CV de IxTBS, pH 7.6 (lx TBS se preparó por una dilución de 10 veces de lOx de TBS, BioSource International, Camarillo, CA Cat # 616US-000) . El flujo se detuvo entonces y las perlas se suspendieron en 1 mi de IxTBS fresco y se dejaron aumentar de volumen durante 15 minutos adicionales . Se drenó el TBS mediante gravedad y la columna se cerró. Para prevenir el enlace no específico del material de prueba a la resina se aplicó a las perlas 1 mi de solución Blocker™, caseina en TBS (Pierce Rockford, II, Cat. # 37532) con BSA al 0.5% agregado (Sigma Cat # A-7030) .Después de cubrir ambos extremos de la columna, se efectuó el bloqueo durante la noche a 4°C bajo agitación suave. La solución de bloqueo se drenó, y se agregó a la resina 1 mi del material de prueba conteniendo PrPr, PrPc y/o PrPsc. La columna se cerro apretadamente en ambos extremos colocada en posición horizontal, y se agitó suavemente a temperatura ambiente durante tres horas. El material conteniendo PrP se drenó y las perlas se lavaron bajo gravedad, se condujeron con 10 mi de TBS conteniendo Tween 20 al 0.05% seguido por 10 mi de TBS . .Detección de PrPc enlazada La detección de PrPc normal se efectuó utilizando anticuerpo monoclonal de ratón 3F4 (Signet, Dedham, ??) diluido 1:8,000 en TBS conteniendo caseina al 1%. El anticuerpo monoclonal se enlaza a HaPrPc, huPrPc y uPrPr - - pero tiene una afinidad extremadamente débil o ninguna para haPrPsc o huPrPsc, sin embargo, se enlaza a haPrPsc y huPrPsc desnaturalizado. Un mililitro del anticuerpo 3F4 diluido se agregó a las perlas de una biblioteca combinatoria previamente expuesta al material conteniendo PrPc . Las perlas se agitaron suavemente con 3F4 a temperatura ambiente, durante una hora. La solución conteniendo el anticuerpo no enlazado se drenó y las perlas se lavaron con 10 mi de TBS y 10 mi de TBS conteniendo Tween 20 al 0.1%. Las perlas se incubaron entonces en 1 mi de IgG de Cabra Anti-ratón marcado con fosfatasa alcalina (g) (KPL, Gaithe sburg, MD Cat # 741806) diluido 1:2,000 en caseína al 0.5%/BSA al 0.5% en TBS. La incubación se llevó a cabo con agitación suave durante 1 hora a temperatura ambiente. La solución conteniendo anticuerpo secundario no enlazado se drenó y las perlas se lavaron con 10 mi de TBS y 10 mi de T-TBS . Enseguida, se preparó 1 mi de solución ImmunoPure Fast, un sustrato para fosfatasa alcalina (Pierce, Rockford, IL. cat #34034) como se describió por el fabricante y se aplicó a las perlas. La incubación procedió a temperatura ambiente durante aproximadamente 15 minutos o hasta que las perlas comenzaron a volverse rosa claro, y aparecieron algunas perlas rojo oscuro. La solución de sustrato se drenó y las perlas se lavaron con 10 mi de TBS. Detección de perlas de enlace a PrP embebidas en agarosa - - La identificación de las perlas de enlace a PrP embebidas en agarosa se efectuó como sigue. Primero, la capa base de agarosa se preparó cubriendo la superficie de una charola de 49 cm2 con 9 mi de agarosa al 1% (Life Technologies, Grand Island, NE, cat #15510.027) disuelta en agua, que se fundió previamente y se enfrió a aproximadamente 60 °C. La agarosa se dejó solidificar. Las perlas se pusieron en contacto con el material de prueba conteniendo proteína prión y lavado en TBS como se describió anteriormente. Enseguida, la concentración de las perlas se ajustó de acuerdo con la concentración deseada de las perlas en el gel . Se encontró una buena distribución de las perlas a 1.9 mg de peso en seco equivalente/mi . Se agregaron 90 mi de la mezcla de perlas a 800 mi de agarosa al 0.5% de bajo punto de fusión (BioWhittaker, Rockland, ME cat. #50111) que se hablan disuelto en agua, se fundieron y se enfriaron a aproximadamente 40 °C. La mezcla se sometió a vórtice suavemente muy brevemente y se vació sobre la superficie de la capa base. Un alícuota del material que contiene PrP se colocó directamente en el gel en su esquina y sirvió como control positivo para los siguientes procedimientos . El gel se dejó solidificar a 4°C. Detección Quimioluminiscente de Perlas de enlace a PrP Embebidas en Agarosa Después de embeber las perlas en el gel, se agregó una solución de CDP-Star (Applied Biosystems, Bedford, MA. cat. #MS100R) para cubrir la superficie de los geles que se incubaron entonces durante 5 minutos como se describió por el protocolo de instrucciones del fabricante. Los geles se drenaron de solución de sustrato surplus, después se colocaron en una transparencia, se sellaron en una bolsa de plástico y se expusieron a película de autorradiografia durante 30 minutos. Las películas identificaron la localización de PrPc o PrPr mediante puntos alineados con las perlas rojas en el gel . Estas películas se utilizaron subsecuentemente para alinear las películas adicionales obtenidas después de la transferencia de desnaturalización de proteínas a una membrana de nitrocelulosa . Protocolo para Transferencia de Proteínas de las Perlas Embebidas a Membrana de Nitrocelulosa Esta metodología de transferencia extrae proteínas de las perlas y las transfiere a través de la acción capilar sobre nitrocelulosa o membrana PVDF . Una pieza de 3 de papel filtro actúa para absorber el amortiguador de transferencia (que puede ser cualquier amortiguador adecuado a las necesidades particulares del experimento) desde un tanque a través del gel . El cordón de 3MM se pre humedece con amortiguador de transferencia y se coloca en una superficie con los extremos del papel inmersos en el tanque de amortiguador. El gel se coloca, con el agar blando hacia arriba, en el 3MM húmedo, asegurándose de que no haya burbujas entre el papel y el gel . Una pieza de membrana (nitrocelulosa ECL-estándar Hybond Amersham, Alemania, cat #RPN303D) cortada al tamaño del gel se humedece en el amortiguador de transferencia y se coloca en la parte superior del gel . Se rueda una pipeta sobre la membrana para eliminar las burbujas. Dos piezas de papel 3MM pre humedecido se colocan entonces en la membrana y se ruedan con una pipeta para retirar las .burbujas de aire. Una pila de toallas de papel seco u otro papel absorbente se coloca en la parte superior y se pesó con un peso de 300 g. La transferencia puede proceder tanto como sea necesario. Protocolo para detección de q imioluminiscencia (ECL) Las membranas se retiran de la superficie de los geles, se enjuagan, y se colocan en contenedores plásticos con 10 mi de leche seca desgrasada al 5% (peso/v) Giant Fod Inc., Landover, MD en TBS más T een (T.TBS) . Las membranas se incuban con la leche con agitación suave durante hasta 16 horas a 4°C, o dos horas a temperatura ambiente, para prevenir el enlace no específico de los anticuerpos a las membranas. Después de bloquear con leche, las membranas se incuban con 10 mi de una dilución primaria de 1:8, 000 de anticuerpo, 3F4, en leche al 5% en TBS más Tween (T.TBS) . La incubación se deja continuar con agitación suave durante 1.5 horas a temperatura ambiente (20-25cC) . La solución primaria - - de anticuerpo se descarta entonces y las membranas se enjuagan dos veces con T-TBS, después se lavan durante 15 minutos en T-TBS, después dos veces durante cinco minutos en T-TBS fresco. Todos los lavados se efectúan con agitación suave. Cada membrana se incuba entonces durante 1.5 horas a temperatura ambiente con agitación suave con 10 mi de una dilución de 1:10,000 de anticuerpo secundario marcado con peroxidasa rábano picante (HRP) (KPL, Gaithersburg, MD) en leche al 5% en T-TBS . La solución secundaria de anticuerpo se descarta entonces y las membranas se enjuagan y se lavan como anteriormente. Algunos experimentos utilizaron anticuerpo secundario marcado con fosfatasa alcalina para la detección del anticuerpo primario. La detección quimioluminiscente se logra preparando "Sustrato Quimioluminiscente" (Supersignal , Pierce Rockford IL. cat #34080) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se agregan diez milímetros de la mezcla a cada membrana, con la proteina hacia arriba. El sustrato se mezcla suavemente manualmente durante 5 minutos, y las membranas saturadas de sustrato se retiran y se colocan en papel filtro 3MM para drenar rápidamente, después se envuelven en Sheet /Protector (Boise Cascade Office Products, #L2A9113-NG) . El lado de la proteina de las membranas se expone a película de autorradiografía durante varios períodos de tiempo y las películas se revelan.

- - Detección de Enlazadores de Trímero Específicos para PrPsc de Cerebro de Hámster con Encefalopatía Espongiforme Las diferentes propiedades bioquímicas entre PrPc y PrPsc y el enlace de anticuerpos, es decir 3F4, se separaron para seleccionar ligandos que se enlazan selectivamente a PrPsc. El anticuerpo monoclonal 3F4 se enlaza a PrPsc desnaturalizada con una afinidad considerablemente más alta que a PrPsc no desnaturalizada. (Safir, J. et al., Eight Prion Strains Have PrPsc Molecules With Different Conformations , (Ocho Especies Prion Tienen Moléculas PrPsc con Diferentes Configuraciones) 1998, Nature Medicine 4 : 1157-1165) . Se prepararon homogenados al diez por ciento (peso/v) de cerebros de hámster no infectados e infectados con encefalopatía espongiforme en PBS y se almacenaron congelados a -80 °C (cortesía del Dr. Robert Rohwer, VA Medical Center, Baltimore) . Previo al uso se congelaron en hielo húmedo, y los homogenados 1.2 mi (no infectado) y 0.5 mi (infectado) , se solubilizaron en presencia de sarcosil a una concentración final de 0.5% (peso/v) con agitación suave durante 30 minutos a temperatura ambiente. Las muestras se centrifugaron a 14,000 rpm durante cinco minutos, y se colectaron los sobrenadantes conteniendo PrPc (no infectada) y una mezcla de PrPc y PrPsc (infectada) . La PrPsc se sobre representa tejido cerebral de hámster infectado con - - encef lopatía espongiforme en relación a PrPc . Se prepararon cinco mililitros de material cerebral para análisis combinando 1 mi de homogenado cerebral al 10% de hámster normal en sarcosil al 0.5% con 0.33 mi de material cerebral infectado con encefalopatía espongiforme y 3.67 mi de amortiguador TBS (Pierce, Rockford IL) conteniendo 1% de caseína y 1% de BSA (Sigma, St . Louis, MO) . La proporción final del homogenado cerebral infectado con encefalopatía espongiforme fue de 3:1 lo que dio cantidades equivalentes muy aproximadas de PrPc y PrPsc . Este material se puso en contacto con la biblioteca de perla trímero procesada de acuerdo con los procedimientos. Después del lavado, las perlas se trataron de diversas maneras. En un método, se incubaron con PK para digerir el enlace de PrPc a las perlas, en otro, se colorearon para la presencia de PrPc. Esto se logró incubando las perlas con anticuerpo 3F4, lavando, después agregando anticuerpo secundario conjugado con fosfatasa específico para 3F4, lavando y agregando un sustrato de fosfatasa para visualizar las perlas que se enlazan a PrPc, 3F4, anticuerpo secundario o fosfatasa. De este modo, aquellas perlas que se enlazan a PrPc fueron rojas. Una vez embebidas en el gel se agregó un segundo sustrato quimioluminiscente específico para fosfatasa, en algunos experimentos, para producir una señal luminosa de las perlas rojas. PrPc, PrPsc y PrPres se transfirieron de la - - agarosa como se describió anteriormente en presencia de 6 M guanidinio/HCl , que también ocasionó la desnaturalización de la proteína prión. La desnaturalización e inmovilización de PrPsc en la membrana de captura facilitó la inmunodetección de PrPsc asi como de PrPc. Al alinear estos puntos con las perlas previamente coloreadas, son posibles diferentes poblaciones de perlas . Las perlas que se enlazan directamente a reactivos de detección tales como 3F4 y las que se enlazan a PrPc más PrPsc, o a PrPc sola se colorean en rojo. las perlas que se enlazan solo o preferentemente a PrPsc producen una señal en la membrana, pero no se colorean de rojo. Estas se seleccionaron como perlas específicas para PrPsc aunque se probaron además como perlas que en teoría pueden enlazarse tanto a PrPc como a PrPsc en el sitio en la proteína prión que evitó el enlace de 3F4. En la Figura 1, las perlas de la biblioteca trímero que no produjeron la señal en la primera detección quimioluminiscente (antes de la etapa de desnaturalización) , pero produjeron la señal en la segunda detección quimioluminiscente (después de la etapa de desnaturalización) , y en consecuencia fueron candidatos para secuenciado, y se les asignaron números. Varias versiones de la metodología descritas en este Ejemplo se dan en las Tablas mencionadas en la presente. Por ejemplo, en las Tablas 10 A y B abajo, se efectuó la selección de bibliotecas de 6 mer (100-300 mm y 65 mm) en presencia de material cerebral con CJD esporádica fijo en plasma humano normal . Las perlas se expusieron a homogenado cerebral al 0.5% fijo en plasma humano normal colectado en CPD, y después se trataron con PK 100 mg/ml. Para confirmar que PK no digiere completamente los péptidos de las perlas, las resinas se trataron con caseína al 1% (peso/v) y albúmina de suero humano al 5% (peso/v) y 100 mg/ml de PK previo al secuenciado.

- - Tabla 10A Secuencias de seis aminoácidos que se enlazan a uPrPc, huPrPsc o ambas NA Media 172 **** FHE (na)EIA NA Media 173 ¦k -k -k -k HADF (na) QA * homogenado cerebral de CJD esporádica al 0.5% (huPrPsc) sin tratamiento con PK ** huPrPsc al 5% sin tratamiento con PK *** huPrPsc al 0.5% sin tratamiento con PK pero sin desarrollo de color **** huPrPsc al 5% con tratamiento con PK pero sin desarrollo de color "NA" indica que se no se produjo, na indica naftil-alanina Tabla 10B Secuencias de seis aminoácidos que se enlazan a huPrPsc SEQ ID NO Material Producción de luz Seleccionado Secuencia Color después de de desnaturalización perla Blanco 174 HuPrPsc+PK ALHFETA Débil * Blanco 175 DDPTGFA Débil 176 * Blanco VAPGLGA * Blanco Débil 177 IFRLIEA * Blanco Débil 178 GLERPEA Rosa Débil 179 * IWRL A Rosa Débil 180 * WHNPHYA Rosa Débil 181 * LIY SDA Blanco Débil 182 huPrPsc no EKPIFNA * * Ro o Débil 183 HWSEPAA ** Rosa Fuerte 184 GHN KEA * * Rosa Fuerte 185 YWHHDDA ** Rosa Fuerte 186 GYP ENA 187 * * Blanco Fuerte PVYWLYA Blanco Débil 188 huPrPsc no FGEHTPA Blanco Fuerte 189 * * FQGTREA Blanco Fuerte 190 ¦k -h -k TGTNRYA Blanco Fuerte 191 *** WATRYA Rosa Fuerte 192 *** NSTKFDA Rosa Fuerte 193 * * -k LIYKEEA Blanco Fuerte 194 *** EHATYRA Blanco Débil 215 (Control) *** * DRDLTFA Blanco Débil 216 (Control) **** H WWIIA Blanco Débil 217 (Control) **** EVKIGNA * 100-300 µt perlas seleccionadas con homogenado cerebral de CJD esporádica (huPrPsc) con tratamiento con PK ** 100-300 µp? perlas seleccionadas con huPrPsc sin tratamiento con PK *** 65 µt perlas seleccionadas con huPrPsc sin tratamiento con PK **** perlas de control que demostraron carencia de digestión significativa del ligando después de la incubación con PK en ausencia de Pr . En la Tabla 10C, abajo, la selección de la biblioteca de 3 mer se efectuó en presencia de homogenado cerebral preparado de un paciente con CJD esporádica (huPrPsc) y las perlas se trataron con PK antes de la inmunodetección de enlazadores específicos de Prp. En este ensayo, 10 mg de resina por columna se incubaron con 1 mi de homogenado cerebral al 0.5% (peso/peso) o al 1% (peso/volumen) diluido en CPD y conteniendo sarcosil al 0.05% o al 0.1% (v/v) , respectivamente, y 0.2 mM del inhibidor de - - proteasa (PMSF) . Se efectuaron los lavados apropiados descritos en el protocolo general, y las perlas se trataron con 1 mi de P (100 mg/ml) a 37 °C durante una hora. Después siguieron los procedimientos generales descritos anteriormente. Las secuencias obtenidas en dos experimentos se listan en la Tabla 10C. Se indica la concentración apropiada del material homogenado cerebral presente durante la incubación para cada grupo de secuencias . En la Tabla 10D, se incubó la resina de una biblioteca combinatoria en la cantidad de 5 mg de peso seco por columna con 1 mi de homogenado cerebral al 0.1% (peso/v) diluido en PBS o CPD y conteniendo sarcosil al 0.01% (v/v) y 0.2 mM de PMSF. Todos los procedimientos se efectuaron de acuerdo con los protocolos antes mencionados .

Tabla 10C Secuencias de tres aminoácidos que se enlazan a huPrPc, huPrPsc, o ambas * huPrPsc al 0.5 % en sarcosil al 0.05% más tratamiento con PK ** huPrPsc al 1.0% en sarcosil al 0.1% sin tratamiento con PK *** huPrPsc al 1.0% en sarcosil al 0.1% con tratamiento PK **** las perlas se seleccionaron del gel antes de la transferencia ***** _as perlas se tomaron después del lavado 3x denota las secuencias detectadas tres veces - - Tabla 10D Secuencias de tres aminoácidos que se enlazan a huPrPc, huPrPsc, o ambas Ejemplo 2 Selección secundaria de Ligandos Los siguientes ejemplos proporcionan información de la selección secundaria de ligandos seleccionados de las diversas bibliotecas durante la selección primaria para confirmar adicionalmente que los ligandos se enlazan a PrP. El enlace de PrPc de cerebro humano normal a las resinas trímero se muestra en la Figura 2. Se utilizaron diez mg de cada resina (Amino, HYD (SEQ ID NO-.206) , RWD (SEQ ID NO: 113, SYA (SEQ ID NO:108), SYF (SEQ ID NO:213) y YEY (SEQ ID NO: 154) por columna. La resina amino es el polímero base del cual se sintetizan los péptidos y tiene alguna afinidad a la proteina prión. Las resinas se equilibraron ya sea con PBS o CPD a ph 7.4. Se utilizó tejido cerebral - - humano normal congelado como fuente de huPrPc. Se enfrió primero en hielo húmedo. Una muestra de homogenado cerebral al 10% preparado en PBS o en CPD se solubilizó con sarcosil al 1% y se clarificó mediante centrifugación a 14,000 rpm durante cinco minutos. El sobrenadante se recuperó y se diluyó 100 veces hasta una concentración final de homogenado cerebral y sarcosil de 0.1% y 0.01% respectivamente. Se aplicó un milímetro de este material a la columna y el flujo se colectó. Las perlas se lavaron con 20 mi de PBS o CPD, y 1 mg de perlas (peso seco) se utilizó para evaluación del enlace a PrPc mediante inmunotransferencia como se describió aba o . Después del lavado, se suspendió aproximadamente 1 mg equivalente en peso seco de perlas en 100 mi de amortiguador, y se calentó a 100°C durante 10 minutos en 30 mi de amortiguador Laemmli conteniendo /3-mercaptoetanol al 2%. Las perlas se centrifugaron a 14,000 rpm durante un minuto, y el sobrenadante se evaluó mediante inmunotransferencia y se probó para PrP. Las muestras se disolvieron en NuPAGE 12% gel Bis-Tris (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA, EUA) bajo condiciones reducidas de desnaturalización, y se electro transfirieron a una membrana de nitrocelulosa (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA, EUA) . Se visualizaron bandas específicas de PrP utilizando anticuerpo monoclonal 3F4 diluido 1:10,000.

- - Las marcas se revelaron utilizando el sistema de detección SuperSignal West Pico (Pierce, Rockford, IL, EUA) conteniendo reactivo quimioluminiscente para la detección de peroxidasa rábano picante. Las señales se registraron en película X-Omattm Blue XB-1 (Eastman Kodak Company, Rochester, NY, y se utilizó (SEQ ID N0:113), SYA (SEQ ID NO:108), WEY (SEQ ID NO:102), WSD (SEQ ID N0:115), YID (SEQ ID N0:112), YFE (SEQ ID NO: 106), YEY (SEQ ID NO:154) y WQD) por columna y se procesó de acuerdo con el protocolo general antes descrito . Las columnas se equilibraron con PBS, pH 7.4. Se utilizó tejido cerebral congelado de un paciente con CJD esporádica para la preparación de PrPsc. También contenía PrPc. La muestra de homogenado cerebral al 10% se preparó en PBS tratado con sarcosil al 1% y se clarificó mediante centrifugación a 14,000 rpm durante cinco minutos. El sobrenadante se recuperó y se diluyó 100 veces hasta dar una concentración final de homogenado cerebral y sarcosil de 0.1% y 0.01% respectivamente. Se aplicó un milímetro de este material a las perlas y se incubó a temperatura ambiente en un formato por lote durante tres horas. Las perlas se lavaron después con 20 mi de PBS y 1 mg de perlas (peso seco) se incubaron con PBS o con PK (100 mg/ml) en PBS a 37 °C durante 1 hora. Estas condiciones digirieron completamente la PrPc. Por tanto, esto ayudó a discriminar entre los ligandos específicos para PrPsc y PrPc. Se siguió el procesamiento común de las perlas para inmunotransferencia como se describe en el Ejemplo 1. El enlace de PrPsc en un homogenado de cerebro tomado de un paciente de CJD esporádica a las resinas en un formato de flujo se muestra en la Figura 4. Se utilizaron cincuenta mg de cada resina (Amino, RWERED (SEQ ID NO:157), LW (SEQ ID NO:50), EYY (SEQ ID NO: 214), HYD (SEQ ID NO:206), RWD (SEQ ID NO-.1.13), SYA (SEQ ID NO: 108), SYF (SEQ ID N0:213) y YEY (SEQ ID NO: 154) en el experimento. Se utilizó Filter Píate Captiva de 96-pozos (CaptiVac Vacuum Sistem, ANSYS Technologies, Inc. Cat # 796) en lugar de columnas individuales . Las resinas se prepararon de acuerdo al protocolo general descrito anteriormente. Las resinas se equilibraron con CPD a ph 7.4. Se utilizó tejido cerebral congelado de un paciente con CJD esporádica como fuente de huPrPc y huPrPsc. Una muestra de homogenado cerebral al 10% se preparó en CPD tratado con sarcosil al 1% y se clarificó mediante centrifugación a 14,000 rpm durante cinco minutos. El sobrenadante se recuperó y se diluyó 100 veces hasta una concentración final del homogenado cerebral y sarcosil de 1% y 0.1% respectivamente. Se aplicó a cada pozo 250 mi de este material. El material se dejó pasar a través de la resina bajo gravedad con un tiempo de contacto de aproximadamente cuatro minutos y se colectó el flujo. Las resinas se lavaron con 2.5 mi de CPD. Un miligramo de perlas (peso seco) se - - incubó con P (100 mg/ml) a 37°C durante una hora. Se siguió el procesamiento común de las perlas para inmunotransferencia como se describe arriba. Aunque pueden utilizarse métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en la presente en la práctica o prueba de la presente invención, se describen arriba métodos y materiales adecuados . Todas las publicaciones, solicitudes de patente, patentes y otras referencias citadas mencionadas en la presente se incorporan por referencia en su totalidad. En adición, los materiales, métodos y ejemplos son solo ilustrativos y no pretenden ser limitantes . Se proporciona la descripción anterior para describir varias modalidades referentes a la invención. Pueden hacerse diversas modificaciones, adiciones y supresiones a estas modalidades y/o estructuras sin apartarse del alcance y espíritu de la invención. Ejemplo 3 Visualización de PrPc enlazada a resinas Para visualizar el enlace de PrPc a las resinas de afinidad, se enlazó homogenado cerebral normal a resina amino DVR (SEQ ID NO: 114) en un formato de columna, y se visualizó la localización de la proteina en el interior y el exterior de las perlas mediante un sustrato cromogénico. Se empacó una columna de 0.5 mi del ligando de afinidad DVR (SEQ ID N0:114), que se sintetizó en resina amino Toyopearl 650-M, en una columna PIKSI (ProMetic BioSciences Ltd. Montreal, Québec Canadá) . A la columna se aplicaron 1.5 mi de homogenado de cerebro de hámster normal al 1% (HaBH) diluido en un amortiguador de función ( B) (20 mM citrato, 140 mM NaCl pH7.0) a una proporción de flujo de 0.5 ml/min. que se controló por medio de una bomba peristáltica. Después de cargar el HaBH las columnas se lavaron con 5 mi de WB. Las perlas se retiraron de la columna, se dividieron con una navaja para exponer el interior de las perlas, y se incubaron con anticuerpo primario 3F4 diluido 1:4000 en amortiguador de caseína al 1% (Pierce Rockford IL) durante 1 hora a temperatura ambiente con agitación mediante rotación. Las perlas se lavaron con TBS, ph 7.4 (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA, EUA) y se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente con rotación con un anticuerpo de cabra anti-ratón secundario marcado con alcalina fosfatasa (KPL, Gaithersburg, MD) diluido 1_1000 en caseína al 1%. Las perlas se lavaron con 10 mi de TBS a pH 7.4m, después de 5 mi de TBS a ph 9.5. Las perlas se incubaron con sustrato de alcalina fosfatasa BCIP/NBT (Sigma Aldrich St . Louis MO) durante varias horas y se observaron bajo un estereomicroscopio . La superficie exterior de las perlas se coloreó de café/azul pero la superficie interior permaneció blanca, indicando que la proteína se enlazó al exterior de las perlas. Ejemplo 4 Retiro de PrPsc de Concentrados Celulares de Sangre Roja Los concentrados de sangre ro a (RBCCs) se fijaron con homogenado cerebral de hámster infectados con encefalopatía espongiforme a órdenes de concentraciones de una magnitud mayor que la probable encontrada endógenamente en la sangre de animales infectados. Los RBCCs fijados pasaron en sucesión a través de las columnas de resinas con varios ligandos de afinidad a fin de evaluar la capacidad de los ligandos de afinidad para enlazarse y remover la PrP, cuando se encuentran presentes a altas concentraciones de RBCCs . Se leucorreduj eron diez unidades de concentrados celulares de sangre roja tipo O negativo (RBCCs) en filtros Pall Leukotrap (Pall East Hills NY) , se vaciaron y se fijaron con homogenado cerebral de hámster con encefalopatía espongiforme al 0.1% en sarcosil al 0.1%. El fijado se agregó a 2 ml/min con agitación. Los RBCCs fijados se subdividieron en 10 porciones iguales de 300 mi cada una en bolsas de transferencia (Fenwall Products, Baxter Healthcare Corporation, Deerfield, IL) . Cinco columnas conteniendo cada una 10 mi de una resina específica, se colocaron en serie, de modo que el flujo de la columna uno, conteniendo material no enlazado, se - - aplicó a la columna 2. Esto continuó hasta que las 5 columnas se expusieron a RBCCs. A través de la columna uno, pasaron 300 mi de RBCCs fijados, se colectó el flujo y corrió a través de la columna dos, y asi sucesivamente, hasta que todas las columnas se expusieron a RBCCs. Las perlas en la columna se colectaron, y se lavaron 100 mi de muestras de perlas, y se dividieron en dos porciones. Una porción se incubó con Proteinaza (en la Tabla 11, muestra incubada con proteinaza K. se denota -PK, muestra no incubada con proteinaza se denota -PK) a 1 mg/ml durante 1 hora a 37°C. Las proteínas que se enlazaron a ambas perlas +PK y -PK se eluyeron de las perlas calentando en amortiguador de muestra 2X (NuPAGE, Helixx Technologies Inc. Toronto, Ontario, Canadá) . Cada muestra en cantidad de 10 mi se cargó en un gel Bis-Tris SDS-PAGE al 12% (Invitrogen) y se electróforo durante 45 minutos. Las proteínas del gel se transfirieron a una membrana y la proteína PrP se detectó en una inmunotransferencia utilizando anticuerpo 3F4 PrP de ratón anti-humano como anticuerpo primario, anticuerpo conjugado de fosfatasa alcalina de cabra anti-ratón como anticuerpo secundario y se detectó con detección quimioluminiscente Western Breeze (Invitrogen) . Las bandas en el gel, obtenidas eluyendo la proteína enlazada a la resina, indican la presencia de PrPres en las perlas derivadas del flujo de la columna previa (o material de inicio en el caso de la columna - - 1) - Se encontró PrPres en perlas de las columnas 1-5 para el control negativo, resina de SYA acetilada (Ac-SYA (SEQ ID NO: 108), indicando que esta resina no se enlazó a PrPsc . PrPres se encontró en altas cantidades en la columna 1, y en cantidades disminuidas en la columna 2 para DVR (SEQ ID NO:114) y SYA (SEQ ID NO: 10), con solo una pequeña cantidad de PrPres presente en las perlas de la columna 3. Esto indicó que estas resinas remueven toda la PrPres al límite de la detección de la inmunotransferencia en las 3 columnas, o 30 mi de resina. Las resinas YVHEA (SEQ ID NO:63) y (D) ES (na) PRQ-EACA (SEQ ID N0:226-EACA) muestran también cantidades disminuidas de PrPres en las columnas 1 a 3; sin embargo, existe más PrPres enlazada en la columna 3 que en las dos resinas previas . Una cantidad equivalente de PrPres se encuentra en cada columna de WFVEA (SEQ ID NO: 225) , indicando que esta resina enlaza una pequeña cantidad de PrPres en cada columna, pero no enlaza y remueve toda la proteína prión al límite de detección. Dado que la fijación fue varias veces más alta que la cantidad de PrP que se ha observado endógenamente en la sangre de animales, estos resultados indicaron que ciertas de estas resinas tienen la capacidad de remover la mayor parte, si no toda la PrPres endógena presente en la sangre .

- - Tabla 11 Patrón de carga de gel para la electroforesis de las muestras en el Ej emplo 4. Resinas SYA & Ac-SYA Resinas DVR (SEQ ID N0:114), (SEQ ID NO: 10) YVHEA (SEQ ID N0:63), (D) ES (na) PRQ (SEQ ID NO: 226), WFDE (SEQ ID NO: 225) 1. WM 1. MWM 2. Columna #1 - PK 2. Columna #1 - PK 3. Columna #1 + PK 3. Columna #1 + PK 4. Columna #2 - PK 4. Columna #2 - PK 5. Columna #2 + PK 5. Columna #2 + PK 6. Columna #3 - PK 6. Columna #3 - PK 7. Columna #3 + PK 7. Columna #3 + PK 8. Columna #4 - PK 8. Columna #4 - PK 9. Columna #4 -+ PK 9. Columna #4 + PK 10. liomogenado cerebral 10. Columna #5 - PK de encefalopatía espongiforme-P (1 : 100) 11. liomogenado cerebral 11. Columna #5 + PK de encefalopatía espongiforme -PK(1:10) 12. homogenado cerebral 12. homogenado cerebral de de encefalopatía encef lopatía espongiforme - Pk espongiforme -PK(1:2) (1:100) 13 Material cerebral de 13. homogenado cerebral de prueba de encefalopatía encefalopatía espongiforme - PK - - MWM denota marcadores de peso molecular

Claims

REIVINDICACIONES 1. Un ligando que se enlaza a un prión, en donde el ligando es capaz de enlazarse a un péptido que tiene una secuencia de aminoácidos RYPxQ (SEQ ID NO: 221), en donde x es G, P, o N, o en donde el ligando se enlaza a un péptido que tiene una secuencia de aminoácidos xxYYux (SEQ ID NO: 222), en donde x es cualquier aminoácido y u es R o Q.
2. El ligando de la Reivindicación 1, en donde el ligando es capaz de enlazarse a un péptido que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de RYPGQ (SEQ ID NO:l), DRYYRD (SEQ ID NO : 2 ) , QAYYQR (SEQ ID NO:3) y QVYYRP (SEQ ID N0:4) .
3. El ligando de la Reivindicación 1, en donde el ligando tiene un peso molecular menor que aproximadamente 6 kDa.
4. El ligando de la Reivindicación 3, en donde el ligando es un péptido que tiene una secuencia de aminoácidos de seis aminoácidos .
5. El ligando de la Reivindicación 4, en donde el ligando es capaz de enlazarse a un péptido que tiene una secuencia de aminoácidos DRYYRD (SEQ ID NO: 2) , y en donde la secuencia de aminoácidos del ligando comprende un aminoácido lisina (K) o un aminoácido histidina (H) .
6. El ligando de la Reivindicación 4, en donde el ligando es capaz de enlazarse a un péptido que tiene una secuencia de aminoácidos QAYYQR (SEQ ID NO: 3), en donde la secuencia de aminoácidos del ligando comprende un aminoácido histidina (H) y en donde el ligando posee una carga positiva neta a un pH 7.
7. El ligando de la Reivindicación 1 en donde el ligando es capaz de enlazarse a un péptido que tiene una secuencia de aminoácidos QVYYRP (SEQ ID NO: 4) , y el ligando es un péptido que tiene una secuencia de aminoácidos que comprende las secuencias de aminoácidos LL, LI, VL o II.
8. El ligando de la Reivindicación 1 en donde el ligando es capaz de enlazarse a un péptido que tiene una secuencia de aminoácidos QVYYRP (SEQ ID NO: 4) , y en donde el ligando es un péptido que tiene una secuencia de aminoácidos que comprende un aminoácido aromático y en donde el ligando se encuentra cargado de manera neutra.
9. El ligando de la Reivindicación 1 en donde el ligando es capaz de enlazarse a un péptido que tiene una secuencia de aminoácidos RYPGQ (SEQ ID NO:!), y en donde el ligando es un péptido que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de las SEQ ID NOS:5-13.
10. El ligando de la Reivindicación 1 en donde el ligando es capaz de enlazarse a un péptido que tiene una secuencia de aminoácidos DRYYRD (SEQ ID NO: 2), y en donde el ligando es un péptido que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de las SEQ ID NOS: 14-22.
11. El ligando de la Reivindicación 1 en donde el ligando es capaz de enlazarse a un péptido que tiene una secuencia de aminoácidos QAYYQR (SEQ ID N0:3), y en donde el ligando es un péptido que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de las SEQ ID NOS: 23-31.
12. El ligando de la Reivindicación 1 en donde el ligando es capaz de enlazarse a un péptido que tiene una secuencia de aminoácidos QVYYRP (SEQ ID NO: ), y en donde el ligando es un péptido que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de las SEQ ID NOS: 31-47.
13. El ligando de la Reivindicación 1 en donde el ligando es capaz de enlazarse a una forma nativa de proteína prión (PrPc) y es un péptido que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de las SEQ ID NOS:48-100 y las SEQ ID NOS:116-139.
14. El ligando de la Reivindicación 13 en donde el ligando es capaz de enlazarse a una proteína prión nativa que infecta humanos (huPrPc) y tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de las SEQ ID NOS: 116-139.
15. Un ligando que se enlaza a un prión, en donde el ligando es capaz de enlazarse tanto a una forma nativa de proteina prión (PrPc) como a una forma alterada en su conformación de proteína prión (PrPsc) y es un péptido que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de las SEQ ID NOS:52, 54, 101-115, y 154-173.
16. El ligando de la Reivindicación 15, , en donde el ligando es capaz de enlazarse tanto a una forma nativa de proteina prión en humanos (huPrPc) como a una forma alterada en su conformación de proteina prión en humanos (huPrPsc) y es un péptido que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de las SEQ ID NOS: 154-173.
17. Un ligando que se enlaza a un prión, en donde el ligando es capaz de enlazarse a una proteína prión expresada por medio de tecnología recombinante (PrPr) , y el ligando es un péptido que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de las SEQ ID NOS:54-105, y 140-153.
18. Un ligando que se enlaza a un prión, en donde el ligando es capaz de enlazarse a una forma alterada en su conformación de proteína prión (PrPsc) , y el ligando es un péptido que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de las SEQ ID NOS: 174-194, 147, 152, 206, 213 y 214.
19. Un ligando que se enlaza a un prión, en donde el ligando es capaz de enlazarse a una forma nativa de proteína prión (PrPc) o a una forma alterada en su conformación de proteína prión (PrPsc) tratada con proteinasa K, y el ligando es un péptido que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de las SEQ ID NOS: 195-212.
20. Un método para detectar una proteina prión en una muestra, que comprende: poner en contacto la muestra con un ligando capaz de enlazarse a una o más proteínas prión, a un fragmento de las mismas, o a un péptido derivado de las mismas bajo condiciones suficientes para ocasionar la formación de un complejo entre la proteina prión, su fragmento, o el péptido derivado de la misma y el ligando; y detectar el complejo en la muestra.
21. El método de la reivindicación 20 en donde la muestra es una muestra biológica.
22. El método de la reivindicación 21, en donde la muestra biológica se selecciona del grupo que consiste de sangre completa, células blancas, células mononucleares , concentrados de plaquetas, sangre, plasma, suero, fluido cerebroespinal, orina, , saliva, leche, fluido de conducto, lágrimas, semen, heces, amígdalas, nodos linfáticos, colágeno, extractos cerebrales y extractos glandulares.
23. El método de la reivindicación 21 en donde el ligando se une a un soporte sólido previo a ponerse en contacto con la muestra.
24. El método de la reivindicación 23 en donde el soporte sólido se selecciona del grupo que consiste de membranas y resinas .
25. El método de la reivindicación 23 en donde el soporte sólido es una resina seleccionada del grupo que consiste de polimetacrilato, agarosa, sefarosa, agarosa reticulada, polisacáridos reticulados compuestos, celita, polivinilo D, fluoruro acrilato, poliestireno y celulosa.
26. El método de la reivindicación 23 en donde el soporte sólido es resina de polimetacrilato.
27. El método de la reivindicación 23 en donde el soporte sólido es una membrana seleccionada del grupo que consiste de nilón y celulosa.
28. Un método para retirar una proteina prión de una muestra, que comprende: poner en contacto la muestra con un ligando capaz de enlazarse a uno o más péptidos o polipeptidos derivados de una proteina prión seleccionada del grupo que consiste de PrPc, PrPsc y PrPr bajo condiciones suficientes para ocasionar la formación de un complejo entre la proteína prión y el ligando; y retirar el complejo en la muestra.
29. El método de la reivindicación 28 en donde la muestra es una muestra biológica.
30. El método de la reivindicación 28 en donde la muestra biológica se selecciona del grupo que consiste de sangre completa, células blancas, células mononucleares, concentrados de plaquetas, sangre, plasma, suero, fluido cerebroespinal, orina, , saliva, leche, fluido de conducto, lágrimas, semen, heces, amígdalas, nodos linfáticos, colágeno, extractos cerebrales y extractos glandulares.
31. El método de la reivindicación 28 en donde el ligando se une a un soporte sólido previo a ponerse en contacto con la muestra.
32. El método de la reivindicación 28 en donde el soporte sólido se selecciona del grupo que consiste de membranas y resinas.
33. El método de la reivindicación 28 en donde el soporte sólido es una resina seleccionada del grupo que consiste de polimetacrilato, agarosa, sefarosa, agarosa reticulada, polisacáridos reticulados compuestos, celita, polivinilo D, fluoruro acrilato, poliestireno y celulosa.
34. El método de la reivindicación 28 en donde el soporte sólido es resina de polimetacrilato.
35. El método de la reivindicación 28 en donde el soporte sólido es una membrana seleccionada del grupo que consiste de nilón y celulosa.
36. Una composición para enlazar proteínas prión, que comprende : un ligando capaz de enlazarse a uno o más péptidos prión; y un soporte sólido, en donde el ligando se une al soporte sólido.
37. La composición de la reivindicación 36 donde el soporte sólido se selecciona del grupo que cons de membranas y resinas .