CN102288559A - 一种检测淀粉酶的方法和试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及医学检测技术领域，公开了一种检测淀粉酶的方法和试剂盒。本发明提供的检测淀粉酶的方法，在pH7.2的缓冲液中，待测样品与可溶性淀粉混合得到混合液，碘化钾与酸性碘酸钾混合与得到的混合液反应，在630nm波长下检测吸光度，根据经上述相同处理的未经酶促的空白管的吸光度，计算待测样品中淀粉酶的浓度。本发明所述检测方法碘化钾和碘酸钾在酸性条件下生成碘，与未反应的淀粉结合形成蓝色复合物，避免直接使用碘液易升华挥发造成成份减少变淡影响反应显色，提高检测结果准确性。本发明所述试剂盒稳定性好，保存期长，适用范围广，便于推广使用，可应用于各级医院、卫生部门和医学生物科研单位测定血清或尿液中淀粉酶含量。
Description
技术领域
本发明涉及医学检验测定技术领域，具体的说是涉及一种检测淀粉酶的方法和试剂盒。
背景技术
淀粉酶(α-Amylase)简称AMS或AMY，一类能将淀粉分子水解的酶，一般作用于可溶性淀粉、直链淀粉、糖元等α-1，4-葡聚糖，水解α-1，4-糖苷键，产生葡聚糖、麦芽糖和葡萄糖分子。淀粉酶在胰腺和唾液腺中含量丰富，胰淀粉酶由胰腺以活性状态排入消化道，是最重要的水解碳水化合物的酶，和唾液腺分泌的淀粉酶一样都属于α-淀粉酶。淀粉酶分子量小，可通过肾小球滤过，随尿排出。当罹患胰腺疾病或有胰腺外分泌功能障碍时可引起淀粉酶活性升高或降低，因此，测定血清和尿液中的淀粉酶对胰腺炎的诊断具有重要意义。尿淀粉酶水平波动较大，所以优选血清淀粉酶检测，或两者同时测定。
血清和尿液中淀粉酶活性的测定方法有很多种，主要有黏度测定法、比浊法、糖化法、碘-淀粉比色法、酶速率法与染料释放法等。其中，黏度测定法和比浊法由于影响因素较多，缺乏特异性和灵敏度，已被淘汰。糖化法虽然可直接测量酶活性，但操作复杂不适用于临床常规检查。目前应用较为广泛的为碘量法，酶速率法和染料释放法。其中，碘-淀粉比色法因具有成本低、检测不需要昂贵仪器、试剂稳定、操作简便、结果可靠，在临床上得到广泛应用。
碘-淀粉比色法测定血清和尿液中淀粉酶的反应原理为血清(浆)和尿液中的α-淀粉酶催化淀粉分子中α-1，4糖苷键水解，产生葡萄糖、麦芽糖及含有α-1，6糖苷键支链的糊精。在底物定量的条件下，反应后加入碘液与未被水解的淀粉结合成蓝色复合物，其蓝色的深浅与未经酶促反应的空白管比较，淀粉酶活性越大，剩余淀粉越少，反应液显色越浅，将最终产物置于紫外/可见光分析仪下或半自动生化分析仪下，检测在主波长630nm处在吸光度值大小，从而测算样品中淀粉酶的含量。
然而上述方法显色剂碘液易升华挥发造成成份减少变淡影响反应显色，致使检测结果准确性降低。
发明内容
有鉴于此，本发明目的是提供一种稳定性高、准确性高的检测淀粉酶酶的试剂盒。
为实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案：
一种检测淀粉酶的方法，包括：
步骤1、在pH7.2的缓冲液中，待测样品与可溶性淀粉混合得到混合液；
步骤2、碘化钾与酸性碘酸钾混合，与步骤1得到的混合液反应，在630nm波长下检测吸光度，根据经上述相同处理的未经酶促的空白管的吸光度，计算待测样品中淀粉酶的浓度。
血清(浆)和尿液中的α-淀粉酶催化淀粉分子中α-1，4糖苷键水解，产生葡萄糖、麦芽糖及含有α-1，6糖苷键支链的糊精。在底物定量的条件下，反应后加入碘液与未被水解的淀粉结合成蓝色复合物，其蓝色的深浅与未经酶促反应的空白管比较，检测在主波长630nm处在吸光度值大小，从而测算样品中淀粉酶的含量。本发明所述检测方法以碘化钾和酸性碘化钾作为显色液，碘化钾和碘酸钾在酸性条件下生成碘，与未反应的淀粉结合形成蓝色复合物，避免直接使用碘液易升华挥发造成成份减少变淡影响反应显色，提高检测结果准确性。
优选的，所述碘酸钾与碘化钾的摩尔比为1∶5～6。
优选的，酸性碘酸钾为8～12mmol/LpH2.0～3.0的碘酸钾溶液。
为了酶与底物很好的结合，酶和底物都需要缓冲液提供适宜的解离环境。缓冲液的离子强度也影响着酶的活性，离子强度过高，电解质干扰酶和底物结合，酶活性将逐步下降，但离子强度过低也可能无法激活酶活性。一般选择与生理环境的体液比较接近的离子强度。因此本发明所述检测方法为了提供一个适宜的酶解环境，待测样品与可溶性淀粉在pH7.2的缓冲液中混合。所述在pH7.2的缓冲液包括：磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液、Tris-盐酸缓冲液和磷酸盐缓冲液。作为优选，本发明所述检测方法中所述pH7.2的缓冲溶液为50～100mmol/L pH7.2的磷酸盐缓冲液，包括磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液和磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液。
优选的，所述可溶性淀粉浓度为960mg/L。
本发明还提供了一种检测淀粉酶的试剂盒，包括960mg/L可溶性淀粉、50～100mmol/L pH7.2的磷酸盐缓冲液、8～10mmol/LpH2.0～3.0的碘酸钾溶液和30～50mmol/L碘化钾。
优选的，本发明所述试剂盒还包括50～70mmol/L的苯甲酸钠，苯甲酸钠作为防腐剂保证试剂稳定性。
本发明提供的检测淀粉酶的试剂盒可以为双试剂，将可溶淀粉与pH7.2的磷酸盐缓冲液和碘化钾制成第一试剂，将酸性碘酸钾制成第二试剂，在利用该试剂盒检测淀粉酶时，将第一试剂与第二试剂混合，从而检测待测样品中的淀粉酶。本发明提供的检测淀粉酶的试剂盒还可以为多试剂，将可溶淀粉与pH7.2的磷酸盐缓冲液制成第一试剂，将酸性碘酸钾制成第二试剂，碘化钾制成第三试剂，检测淀粉酶时，将第一试剂与第二试剂和第三试剂混合，检测待测样品中的淀粉酶。由于可溶性淀粉水溶液稳定性差，因此本发明所述试剂盒将含可溶性淀粉的试剂制成干粉试剂，使用前溶解。
从上述的技术方案可以看出，本发明所述检测方法以碘化钾和酸性碘化钾作为显色液，碘化钾和碘酸钾在酸性条件下生成碘，与未反应的淀粉结合形成蓝色复合物，避免直接使用碘液易升华挥发造成成份减少变淡影响反应显色，提高检测结果准确性。试验表明，本发明所述检测方法具有较高准确度和精密度，对同一样品进行重复性检测，各结果之间的标准差率(变异系数)为1.92％，小于标准的3％，并且线性范围宽，血清中淀粉酶可测线性范围可达800U/L，尿液中淀粉酶可测线性范围可达1600U/L。本发明所述试剂盒稳定性好，保存期长，适用范围广，便于推广使用，可应用于各级医院、卫生预防部门和医学生物科研单位测定血清或尿液中淀粉酶含量。
具体实施方式
本发明实施例公开了一种检测淀粉酶的方法和试剂盒。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的产品和方法已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明进行详细说明。
实施例1：本发明所述检测淀粉酶的试剂盒。
本发明所述检测淀粉酶的试剂盒为多试剂。
第一试剂为干粉试剂，包括960mg/L可溶性淀粉、50mmol/LpH7.2的磷酸盐缓冲液和60mmol/L苯甲酸钠；
第二试剂为30mmol/L碘化钾；
第三试剂为8mmol/LpH2.0的碘酸钾溶液。
实施例2：本发明所述检测淀粉酶的试剂盒。
本发明所述检测淀粉酶的试剂盒为多试剂。
第一试剂为干粉试剂，包括960mg/L可溶性淀粉、20mmol/LpH7.2的磷酸盐缓冲液和50mmol/L苯甲酸钠；
第二试剂为50mmol/L碘化钾；
第三试剂为12mmol/LpH3.0的碘酸钾溶液。
实施例3：本发明所述检测淀粉酶的试剂盒。
本发明所述检测淀粉酶的试剂盒为双试剂。
第一试剂为干粉试剂，包括960mg/L可溶性淀粉、100mmol/LpH7.2的磷酸盐缓冲液、48mmol/L碘化钾和70mmol/L苯甲酸钠；
第二试剂为8mmol/LpH2.5的碘酸钾溶液。
实施例4：检测淀粉酶的方法。
设定半自动生化分析仪反应温度37℃，反应方法为终点法，测定主波长630nm，反应方向为负反应。取待测样品与960mg/L可溶性淀粉混合，孵育360s，然后加入40mmol/L碘化钾和8mmol/LpH2.0酸性碘酸钾混合溶液，混合均匀后置于半自动生化分析仪，检测并记录630nm波长下的吸光度。未经酶促的空白管与上述处理相同。根据计算公式C样＝(A空白-A样)/A空白×(C×V)/(t×V样)计算待测样品中淀粉酶的浓度，其中，C样为待测样本浓度；A样为样品吸光度；A空白为空白管吸光度；C为可溶性淀粉浓度；V为可溶性淀粉体积；t为反应时间(min)；V样为待测样品体积。由于国际单位规定每升样品反应1min水解4mg淀粉为1个国际单位(U/L)，因此为了将所得淀粉酶浓度换算为国际单位需要根据公式C样(国际单位)＝C样×(1×1000)/4，其中1为国际单位规定的反应时间(min)；1000为mL转化为L的因数；4为国际单位规定的每升样品水解淀粉量。
实施例5：本发明所述检测方法准确性分析
取20例临床样本，分别按照实施例4所述方法和Gal-G2-CNP底物法，利用CB171半自动生化分析仪检测样品中的淀粉酶含量，结果见表1。
表1 样品淀粉酶含量检测结果
由表1结果可见，与现有Gal-G2-CNP底物法相比，本发明所述检测方法检测结果相近，相关系数为0.995，本发明所述检测方法检测结果准确可靠。
实施例6：本发明所述检测方法重复性检测
以常规血清样本作为待测样品，按照实施例4所述方法，利用CB171半自动生化分析仪检测待测样品中的淀粉酶含量，与现有Gal-G2-CNP底物法法比较，结果见表2。
表2 样品重复性检测结果
| 本发明所述检测方法 | Gal-G2-CNP底物法 |
| 124 | 127 |
| 121 | 121 |
| 122 | 124 |
| 118 | 119 |
| 124 | 124 |
| 120 | 122 |
| 121 | 121 |
| 117 | 120 |
| 119 | 125 |
| 121 | 122 |
| CV％＝1.92％ | CV％＝2.01％ |
由表2的结果可见，采用本发明所述检测方法检测淀粉酶的变异系数CV＝1.92％，小于5％，符合《体外诊断试剂通用要求》，并且小于现有的Gal-G2-CNP底物法变异系数，表明本发明所述检测方法重复性好。
实施例7：本发明所述方法线性的检测
取淀粉酶浓度接近800U/L的高值血清，稀释成5个不同的浓度梯度，理论浓度值依次为50、100、200、400、800U/L，按照实施例4所述方法，利用CB171半自动生化分析仪检测待测样品中的淀粉酶，每个浓度测定2次，取平均值，根据公式计算相关系数r值，结果见表3。
取淀粉酶浓度接近1600U/L的高值尿液，稀释成5个不同的浓度梯度，理论浓度值依次为100、200、400、800、1600U/L，按照实施例4所述方法，利用CB171半自动生化分析仪检测待测样品中的淀粉酶，每个浓度测定2次，取平均值，根据公式计算相关系数r值，结果见表4。
表3 血清样品线性检测结果
表4 尿液样品线性检测结果
由表3和表4的结果可见，本发明所述检测方法血清中淀粉酶的线性范围可达800U/L，尿液中淀粉酶的线性范围可达1600U/L，表明本发明所述检测方法线性范围宽、适用范围广。
以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。
Claims (7)
1.一种检测淀粉酶的方法，其特征在于，包括：
步骤1、在pH7.2的缓冲液中，待测样品与可溶性淀粉混合得到混合液；
步骤2、碘化钾与酸性碘酸钾混合，与步骤1得到的混合液反应，在630nm波长下检测吸光度，根据经上述相同处理的未经酶促的空白管的吸光度，计算待测样品中淀粉酶的浓度。
2.根据权利要求1所述检测方法，其特征在于，所述碘酸钾与碘化钾的摩尔比为1∶4～6。
3.根据权利要求1所述检测方法，其特征在于，所述酸性碘酸钾为8～12mmol/LpH2.0～3.0的碘酸钾溶液。
4.根据权利要求1所述检测方法，其特征在于，所述pH7.2的缓冲溶液为50～100mmol/L pH7.2的磷酸盐缓冲液。
5.根据权利要求1所述检测方法，其特征在于，所述可溶性淀粉浓度为960mg/L。
6.一种检测淀粉酶的试剂盒，其特征在于，包括960mg/L可溶性淀粉、50～100mmol/L pH7.2的磷酸盐缓冲液、8～12mmol/LpH2.0～3.0的碘酸钾和30～50mmol/L碘化钾。
7.根据权利要求6所述试剂盒，其特征在于，还包括50～70mmol/L的苯甲酸钠。
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