CN102286449A - 鼠疫菌纤溶酶原激活因子Pla的提取与纯化方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种鼠疫菌纤溶酶原激活因子Pla的提取与纯化方法，该方法包括：将鼠疫菌体经溶菌酶处理，然后经超声破碎，再进行硫酸铵盐析，得到粗提Pla蛋白；粗提Pla蛋白采用羟基磷灰石层析柱进行层析纯化，其中在上样缓冲液中加入Ca离子，洗脱时先采用磷酸盐缓冲液梯度洗脱，以去除非目的蛋白，再用1N NaOH洗脱目的蛋白，收集样品后用Tris-Cl缓冲液透析，去除NaOH，得到纯化Pla蛋白，并经质谱分析得以证实。本发明还提供了按照所述方法提取纯化得到的Pla蛋白制品。本发明的方法易于操作，所得蛋白丰度高、纯度高。

Description

鼠疫菌纤溶酶原激活因子Pla的提取与纯化方法

技术领域

本发明是关于一种鼠疫菌纤溶酶原激活因子Pla的提取与纯化方法，具体是将鼠疫菌体经溶菌酶处理先制备粗提Pla蛋白然后采用羟基磷灰石层析柱进行层析纯化制备纯化Pla蛋白的方法，本发明还涉及该方法提取纯化得到的Pla蛋白制品及其在杂交瘤株建立与筛选中的应用。

背景技术

鼠疫菌纤溶酶原激活因子(Plasminogen activator，Pla)是鼠疫菌特有的pPCP1质粒编码的细胞膜表面蛋白酶，研究表明，鼠疫菌纤溶酶原激活因子Pla蛋白是鼠疫菌从皮下感染扩散到循环系统的重要毒力因子(Sodeinde OA，Subrahmanyam YV，Stark K，etal.A surface protease and the invasive character of plague[J].Science，1992，258(6)：1004-1007；Goguen JD，Hoe NP，Subrahmanyam YVBK.Proteases and bacterial virulence：aview from the trenches[J].Infect Agents Dis，1995，4(1)：47-54)，在鼠疫菌致病过程中发挥重要作用。提取鼠疫菌Pla蛋白并进行纯化，可以用于鼠疫的辅助免疫学检测、鼠疫菌的毒力等相关研究。Pla蛋白有三种形式：α-Pla、β-Pla、γ-Pla，相对分子质量(Mr)分别为37000、35000、31000。Pla蛋白提取物常常混杂有其它蛋白，对其进行纯化是很有必要的。

常用的对细胞膜蛋白进行提取的方法有超声破碎法、弗氏细胞压碎法、盐洗脱法、表面活性剂提取法、尿素法等等。

石丽媛等人对Pla的分离纯化进行了研究(SDS-PAGE制备凝胶纯化鼠疫菌Pla蛋白，医学动物防制，2008年12月第24卷第12期；鼠疫菌纤溶酶原激活因子的分离纯化，中国地方病学杂志，2009年第28卷第4期)，分别用超声破碎、尿素提取与硫酸铵盐析相结合的方法(简称超声法、尿素法)提取Pla，并分别用离子交换、凝胶过滤两步层析相结合的高效液相色谱和制备电泳纯化Pla，对提取、纯化的Pla进行纤溶酶原激活剂活性检测。其中超声法和尿素法可以提取到Pla，后者经高效液相色谱和制备电泳可以达到基本纯化。

然而，采用尿素抽提法提取Pla蛋白时，采用透析方法难以将尿素清除干净，而其存在会对后续的提取与纯化产生影响；该方法得到的粗提物中目的蛋白所占比例不够高，这使得本来就较少表达的Pla蛋白，经纯化后难以得到足够的收获量。

采用制备电泳纯化Pla蛋白存在以下不足：1)该方法通过预实验获得数据，采用距离测量的方法来定位切胶位置，存在误差；2)在制备电泳和洗脱蛋白的过程中，表面活性剂、还原剂、加热处理、电场作用等条件，对蛋白质量产生较大影响；3)该法获得的目的蛋白所在位置背景较深，说明有一些其它蛋白存在；4)该方法因采用电泳后切胶再洗脱获取目的蛋白，回收率低，难以满足需要，操作繁琐。且得到的样品不具有酶活性，仅从相对分子质量说明其为Pla蛋白。

采用高效液相色谱分离纯化Pla蛋白存在以下不足：采用离子交换纯化，大部分目的蛋白流穿，仅小部分余留；如与凝胶过滤结合进行两步层析，可实现对Pla的纯化，但收获量极低，需进行浓缩才能检出蛋白含量，且操作繁琐。同时，虽然三条带可占蛋白总量80％，仅从相对分子质量及酶活性说明其是Pla，未得到进一步证实(本案发明人在研究中曾对按该方法纯化的蛋白进行质谱分析证实，此3条带并非全为Pla蛋白)。

发明内容

本发明的主要目的在于提供一种鼠疫菌纤溶酶原激活因子Pla的提取与纯化方法，利用简单易行的操作提取纯化得到Pla蛋白。

本发明的另一目的在于提供按照所述方法提取纯化得到的Pla蛋白。

本发明的另一目的在于提供所述纯化得到的Pla蛋白制品在杂交瘤株建立与筛选中的应用。

本发明提供了一种鼠疫菌纤溶酶原激活因子Pla的提取与纯化方法，该方法包括：

将鼠疫菌体经溶菌酶处理，然后经超声破碎，再进行硫酸铵盐析，得到粗提Pla蛋白；

粗提Pla蛋白采用羟基磷灰石层析柱(CHT纯化层析柱)进行层析纯化，其中在上样缓冲液中加入Ca离子，洗脱时先采用磷酸盐缓冲液梯度洗脱，以去除非目的蛋白，再用1N NaOH洗脱目的蛋白，收集样品后用Tris-Cl缓冲液(pH8.5～9.0)透析，去除NaOH，得到纯化Pla蛋白。

根据本发明的具体实施方案，本发明中，所述鼠疫菌体为鼠疫菌EV76。

根据本发明的具体实施方案，所述鼠疫菌体可以为菌粉，该菌粉可以按照常规方法培养制备。例如，在本发明的一优选具体实施方案中，所述菌粉的制备方法包括：将鼠疫菌接种于营养琼脂，28℃孵育48h～72h，用PBS(0.01M，pH7.2～7.4)7000～8000r/min离心20～30min，洗涤菌体两～三次，加入4倍体积-40℃～-60℃预先低温的丙酮，充分混匀，置-40℃～-60℃过夜后，4000r/min，10～20min离心，弃上清，再用预冷丙酮以相同方法洗涤菌体3次，弃尽丙酮，37℃温箱过夜制成菌粉。

根据本发明的具体实施方案，是按照以下操作进行Pla蛋白的提取与纯化：

称取鼠疫菌粉，每1.5g菌粉，加入PBS(0.01M，pH7.2～7.4)60ml及溶菌酶3mg，4℃条件下，磁力搅拌(120～180转/分)，3～4h后，菌悬液进行超声破碎，50％功率，每次10s，间歇10s，共20min；10000～12000r/min离心20min，收集上清，加入PBS将溶液总量补足至90ml～100ml。该过程中各试剂用量可按比例增减。

上述离心后上清进行硫酸铵沉淀：按照每100ml液体总量加入固体硫酸铵5.6g，提取饱和度在0～10％的沉淀，并用TBS(pH8.5～9.0)充分透析至无硫酸铵，得到粗提Pla蛋白。

根据本发明的具体实施方案，粗提Pla蛋白可进一步经10000～12000r/min、20min离心，取上清过0.45μm滤膜，然后进行层析纯化。

根据本发明的具体实施方案，在进行层析纯化时，所述上样缓冲液为：5～10mMNaH₂PO₄，20mM Tris-Cl，0.25mM CaCl₂，pH8.5～9.0；所述洗脱缓冲液为：500mM KH₂PO₄，pH6.8。优选地，上样流速0.5～1.0ml/min，洗脱流速2.0～3.0ml/min。具体地，所述层析纯化步骤包括：以10倍床体积的上样缓冲液平衡层析柱→上样缓冲液对倍稀释预处理后样品上柱进行结合→以5倍床体积上样缓冲液平衡层析柱→以20倍床体积洗脱缓冲液进行梯度洗脱→以5倍床体积上样缓冲液平衡层析柱→以5倍床体积的1N NaOH洗脱，收集NaOH洗脱峰样品并立即以Tris-Cl缓冲液(pH8.5～9.0)进行充分透析，得纯化Pla蛋白。

本发明还提供了按照本发明所述方法提取纯化得到的Pla蛋白制品。

本发明还提供了所述的Pla蛋白制品在杂交瘤株建立与筛选中的应用。

综上所述，本发明提供了一种鼠疫菌纤溶酶原激活因子Pla的提取与纯化方法，该方法的关键在于粗提时先将菌体经溶菌酶处理，再采用超声破碎法结合硫酸铵盐析；纯化时在上样缓冲液中加入Ca离子，洗脱时先采用磷酸盐缓冲液梯度洗脱，以去除非目的蛋白，再用1N NaOH洗脱目的蛋白，收集样品后尽快用Tris-Cl缓冲液(pH8.5～9.0)透析，去除NaOH，以保证蛋白性状不受影响、提高目的蛋白的溶解性。用该方法初步提取的Pla蛋白，3条目的蛋白带(在进行质谱分析鉴定之前，只能以理论上的分子量 来确定Pla蛋白，本发明中发现3条这样的目的蛋白带)占蛋白总量33％，蛋白浓度为6.4mg/ml。经纯化后，3条目的蛋白带占蛋白总量提高至80％，蛋白浓度为0.204mg/ml。使用ABI 4700型飞行时间质谱仪采样分析鉴定，有两条带确认为Pla，占蛋白总量约20％。在应用中，Western blot实验也表明，Pla单克隆抗体能与该两条带发生特异性结合。本发明的方法易于操作，所得蛋白丰度高、纯度高、回收率高。

附图说明

图1为超声破碎后上清饱和硫酸铵分段沉淀样品的SDS-PAGE图形(考染)。图中，从左至右各条带：1：0～10％；2：10～20％；3：20～30％；4：30～40％；5：40～50％；6：50～60％；7：marker(各蛋白带分子量同图3)；8：50～60％；9：40～50％；10：30～40％；11：20～30％；12：10～20％；13：0～10％；(1～6为超声加溶菌酶处理样品，8～13为未加溶菌酶处理)，图中标注的37、35、31为Pla目的蛋白带。

图2为CHT柱层析纯化Pla色谱图形(紫外)。

图3为CHT柱层析纯化Pla收集样品的SDS-PAGE图形(考染)。图中，M：marker；1：粗提Pla；2：图2中A峰；3：图2中B峰；4：图2中C峰；5：图2中D峰。

图4为粗提和纯化Pla蛋白的SDS-PAGE图形(考染)及质谱分析取样图示。图中，M：marker；1：纯化Pla；2：粗提Pla。

图5A、图5B、图5C分别为图4中蛋白点E4、E5、E9胰酶酶解肽段的MALDI-TOF肽指纹图谱。

图6A、图6B、图6C分别为图4中蛋白点E4、E5、E9的Mascot搜库结果。

图7显示利用本发明提取纯化的Pla蛋白进行Westernblot鉴定的实验结果。图中，M：预染marker；1：15B₈杂交瘤株；2：19A₄杂交瘤株；3：14H₄杂交瘤株。

具体实施方式

为了更清楚地理解本发明的实质，下面通过具体实施例并配合附图进一步详细说明本发明，但本发明并不因此而受到任何限制。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件操作。

以下各实施例中，所用原始实验材料、仪器用具及试剂均可商购获得，以下提供主要实验材料、仪器用具及试剂的来源：

1实验菌株实验用鼠疫耶尔森氏菌株EV76由云南省地方病防治所菌种资源库提供。将保存的EV76菌株进行复苏，取单个菌落接种LB半固体培养基，扩大培养于营养琼脂培养基，每次传代同时进行鼠疫菌噬菌体裂解实验。

2实验仪器及用具

仪器用具名称	生产公司
		纯化仪器，AKTA explore 100	Amersham Pharmacia
CHT纯化层析柱	BIO-RAD
		Mili-Q超纯水系统	Millipore
聚丙烯酰胺凝胶电泳系统	Bio-RAD Mini PROTEAN 3Cell
		pH计	Orion 868
细胞超声破碎仪	宁波新芝生物科技公司JY 92-2D型
		0.45μm一次性滤膜	Millipore
磁力搅拌器	上海浦江分析仪器厂
		电子分析天平	Sartorius、OHAUS
普通冰箱	青岛海尔
		高速离心机	BECKMAN J-25型
MALDI-TOF质谱仪	4700Proteomics Analyzer，Applied Biosystems
		真空干燥机	CHRIST Alphal-4LD PLUS
扫描仪	Amersham Pharmacia biotech
		电转印转膜系统	Bio-RAD Trans Blot SD

3.主要试剂及配制

1)LB培养基

加入蒸馏水1000ml，煮沸充分溶解后，分装，121℃、20min高压灭菌。

2)营养琼脂培养基

营养琼脂                500.0g

琼脂粉                  10.0g

酵母粉                  5.0g

加蒸馏水10000ml，煮沸，分装茄形瓶，121℃、20min高压灭菌。

3)0.01M磷酸盐缓冲液(PBS pH7.21000ml)

磷酸氢二钠              1.15g

磷酸二氢钾              0.2g

氯化钠                  8.5g

加入适量蒸馏水溶解后调pH值至7.2，定容至1000ml。

4)SDS-PAGE电泳试剂

(1)丙烯酰胺储存溶液(100ml)

丙烯酰胺                29.0g

N，N’-亚甲基双丙烯酰胺 1.0g

配制时于60ml去离子水中加入以上试剂，充分搅拌至彻底溶解，再定容至100ml，4℃保存。由于丙烯酰胺是强神经毒素，配制时要避免气流，同时做好保护措施。

(2)分离胶缓冲液(1.5M Tris-Cl pH 8.8)

将18.2g Tris溶解于50ml去离子水中充分溶解，用浓盐酸调整pH值至8.8，再定容至100ml，4℃保存。

(3)浓缩胶缓冲液(1M Tris-Cl pH 6.8)

将12.1g Tris溶解于80ml去离子水中充分溶解，用浓盐酸调整pH值至6.8，再定容至100ml，4℃保存。

(4)10％SDS溶液(pH 6.8100ml)

将10g SDS溶解于80ml去离子水中，充分搅拌溶解，用浓盐酸调整pH值至6.8，再定容至100ml，室温保存。使用前需确定是否因室温过低有SDS析出。

(5)10％过硫酸铵溶液(10％Ap)

将0.1g过硫酸铵溶解于1.0ml去离子水中，盛于棕色瓶内4℃保存。最多可储存10天，过期需重新配制。

(6)浓缩胶(10％)

(7)分离胶(4％)

(8)5×SDS-PAGE电极缓冲液(储存液，1000ml)

Tris                15.1g

甘氨酸              94.0g

SDS                 5.0g

将以上试剂溶解于800ml去离子水中，搅拌至充分溶解，定容至1000ml后室温保存。电泳工作液为使用时进行5倍稀释即可。

(9)5×SDS-PAGE Loading Buffer(5.0ml)

于10ml试管中混合上述试剂，用振荡器充分混匀，室温保存。

(10)考马斯亮蓝染色液(1000ml)

考马斯亮蓝R-250                1.0g

甲醇                           250ml

冰醋酸                         100ml

将以上试剂混合后定容至1000ml，室温保存。

(11)脱色液(1000ml)

冰醋酸                    100ml

甲醇                      250ml

去离子水                  850ml

5)纯化用试剂

(1)0.02M Tris-Cl缓冲液(10×)

称取Tris 24.228g，加适量双蒸水充分溶解后，用HCl调节pH至8.5，双蒸水定容至1000ml。

(2)0.5M NaH₂PO₄缓冲液

称取NaH₂PO₄·2H₂O 39g，加双蒸水约350ml充分溶解后，用NaOH调节pH至8.5，双蒸水定容至500ml。

(3)0.5MKH₂PO₄缓冲液

称取KH₂PO₄34g，加适量双蒸水充分溶解后，用HCl调节pH至6.8，定容至500ml。

注：(2)(3)试剂配制完成后，以0.45μm滤膜抽滤，去除杂质、气泡。

(4)1NNaOH

称取NaOH 20g，加双蒸水定容至500ml，注意用塑料烧杯配制，边加边搅拌。

实施例1、Pla蛋白的提取、纯化及鉴定

1鼠疫菌EV76菌粉的制备

传代培养于LB平皿的鼠疫EV76菌，密集划线接种于已制备营养琼脂的茄形瓶，28℃孵育48h，用PBS(0.01M，pH7.2)洗下菌体并7000r/min，20min离心洗涤两次，沉淀中加入4倍体积-40℃预先低温的丙酮，充分混匀，置-40℃过夜后，4000r/min，10min离心，弃上清，再用预冷丙酮以相同方法处理菌体3次，弃尽丙酮，37℃温箱过夜制成菌粉。

2鼠疫菌Pla蛋白的初步提取

1)称取EV76菌粉1.5g，加入PBS(0.01M，pH7.2)60ml及溶菌酶3mg，4℃条件下，磁力搅拌(120转/分)3～4h后，菌悬液进行超声破碎，50％功率，每次10s，间歇10s，共20min。10000r/min离心20min，收集上清，加入适量PBS将溶液总量补足90ml。

2)饱和硫酸铵沉淀

上述离心后上清进行硫酸铵沉淀：按照100ml总量加入固体硫酸铵5.6g，提取饱和度在0～10％的沉淀(根据不同饱和度硫酸铵分段沉淀的结果分析，0～10％的沉淀目的蛋白丰度相对高且杂蛋白少)。加入硫酸铵时，4℃条件下边加边磁力搅拌(150转/分)缓慢加入，10000r/min离心20min，TBS(pH8.5)收集沉淀，并用TBS(pH8.5)充分透析至无硫酸铵，得到粗提Pla蛋白样品。

3鼠疫菌Pla蛋白的纯化

1)样品预处理：上述硫酸铵粗提Pla蛋白样品经12000r/min、20min离心，取上清过0.45μm滤膜，以保护层析柱。

2)上样缓冲液(Buffer A)：

5mMNaH₂PO₄，20mM Tris-Cl，0.25mM CaCl₂(pH8.5)。

3)洗脱缓冲液(Buffer B)：500mM KH₂PO₄(pH6.8)

上样流速：0.5ml/min

洗脱流速：2.5ml/min

先用洗脱缓冲液梯度洗脱后，以1N NaOH洗脱，收集NaOH洗脱样品。

4)操作流程：

以10倍床体积的Buffer A平衡层析柱→Buffer A对倍稀释预处理后样品上柱进行结合→以5倍床体积Buffer A平衡层析柱→以20倍床体积Buffer B进行梯度洗脱→以5倍床体积Buffer A平衡层析柱→以5倍床体积的1N NaOH洗脱，收集洗脱峰样品并立即以Tris-Cl缓冲液(pH8.5)进行充分透析→以5倍床体积的1N NaOH清洁处理层析柱。

4SDS-PAGE

1)电泳胶的配制：

①装配电泳制胶单元，使玻璃夹层竖立，固定以防漏胶。

②配制分离胶，混合后立即注入准备好的制胶玻璃板间隙，在其表面加入少量水或酒精，37℃孵育约40min聚合。

③聚合完成后，倒弃表层液体，尽量用吸水纸吸干凝胶顶面的残余液体。

④配制浓缩胶，混合后立即注入制胶玻璃板间隙，插入梳子，37℃孵育约30min聚合。

⑤聚合完成后，轻轻拔去梳子。

2)待测样品的预处理

①将待分析的蛋白样品浓度调整至约1.0mg/ml，若浓度过低，直接取原样。

②取16μl样品与4μl 5×Loading Buffer于Eppendorf管中，混匀，水浴煮沸5min，恢复至室温。

3)上样、电泳

①将凝胶放入电泳槽中，加入电极液。

②将处理好的样品加于泳道上样孔中，10～20ul/孔，80V、25mA，至样品进入分离胶，约20min。

③100V、25mA，运行至指示剂迁移至胶底边，停止电泳。约需80min。

④剥胶，回收电极液。

4)染色、脱色

①染色：电泳胶于染色液中振摇染色约60min，回收染色液。

②脱色：电泳胶于脱色液中振摇脱色，更换脱色液约2-3次，直至凝胶背景洁净。

5)照相、分析

用凝胶图像分析软件处理。

5Pla蛋白的质谱鉴定

1)SDS-PAGE

将粗提的Pla蛋白、经CHT柱纯化的Pla蛋白按常规方法进行SDS-PAGE，考马斯亮蓝染色。

2)图像数字化及软件分析

考马斯亮蓝染色后，扫描胶块，采集图像信息。

3)胶内酶解

a、切胶：将下图中标记的目的蛋白小心切下，编号后放入96孔圆形板中；

b、洗胶：每孔加入100μl 25mM NH₄HCO₃(pH8.0)，置于摇床上，剧烈摇动20min；

c、脱色：吸去上清，加入50μl含30％乙腈的0.1M NH₄HCO₃，置于摇床上，摇动脱色，中间换液一次，至看不到颜色为止；

d、去液后，加入100μl 25mM NH₄HCO₃摇动20min，洗胶；

e、-80℃预冻1h；

f、真空干燥：-80℃取出，放于真空干燥机内冻干约1h；

g、每孔加入20μg/ml的Trypsin 3μl(Trypsin溶于pH8.025mM NH₄HCO₃)于干燥的胶上，胶块立即吸液涨大，等完全涨大后，置于4℃冰箱30min，加入10μl 25mMNH₄HCO₃，用封口膜封紧，37℃16h；

h、离心后将反应液吸出备用，加入50％ACN/5％TFA40μl，轻微震荡萃取60min，共进行两次；萃取液预冻抽干。

4)MALDI-TOP质谱鉴定

a)取酶解肽段溶液0.5μl与0.5μl介质(10mg/ml α-氰基-4-羟基-肉桂酸溶于70％乙腈，1.1％三氟乙酸)混匀；

b)将样品点于靶板上，自然挥发干燥；

c)质谱分析：使用ABI 4700型飞行时间质谱仪(MALDI-TOF/TOF-MS，AppliedBiosystems，Foster City，CA，USA)采样。频率为200Hz的Nd:YAG激光器，波长为355nm，正离子模式采样，默认校准(误差小于50ppm)。酶解之后的样品中加入2μl蛋白溶解液(0.5％TFA+50％ACN)，采用干滴法使样品蛋白与基质(10mg/ml)以1∶1的比例在192靶上混合，干燥后进行质谱采样。利用4000Series Explorer^TM software version 3.0软件采集样品；从800Da到4000Da采集一级谱图，采用interpreation从高到低采集6个母离子；

5)数据库查询

使用GPS工作站(GPS Explorer^TM v3.6，mascot v2.1)搜索NCBI的非冗余数据库。设置可变修饰Carboxymethyl(C)、Oxidation(M)。搜索母离子偏差设为0.1Da、MS/MS片断偏差设为0.1Da。蛋白与离子的置信区间均高于95％，且至少有两个肽段得分大于50或一个肽段得分大于60，确认蛋白。

实验结果

Pla的纯化及SDS-PAGE

不同饱和度硫酸铵分段沉淀SDS-PAGE结果见图1。图中结果表明0～10％饱和度沉淀目的蛋白丰度高，杂蛋白相对较少。0～10％硫酸铵沉淀粗提Pla及CHT柱层析纯化的Pla进行SDS-PAGE，结果见图3、图4。CHT柱层析纯化紫外吸收色谱图见图2。收集A、B、C、D 4个峰进行SDS-PAGE，结果见图3。A为穿透峰，B、C为杂蛋白，D即为纯化Pla。

蛋白浓度测定及含量计算

采用BCA法测定蛋白浓度，粗提Pla浓度为：6.4mg/ml；纯化Pla浓度为：0.204mg/ml。

图像分析软件采用TotalLab 1.0，结果显示粗提物中可能的Pla含量约占蛋白总量的33％，经纯化后约为80％，经质谱分析鉴定证实为Pla的蛋白约占20％。

Pla蛋白的质谱鉴定

按照图4中标记点(E2～E11)取样进行质谱分析，其中3个点(E4、E5、E9)检测结果显示含有Pla蛋白，该3个点的质谱鉴定及肽质量指纹图谱(peptide massfingerprint，PMF)见表1～3及图5。

表1：蛋白点E4的肽质量指纹图谱MS-Fit检索结果

表2：蛋白点E5的肽质量指纹图谱MS-Fit检索结果

表3：蛋白点E9的肽质量指纹图谱MS-Fit检索结果

数据库查询

图4中蛋白点E4、E5、E9的Mascot搜库结果请参见图6A(E4)、图6B(E5)、图6C(E9)。再次确认这三个蛋白点含有Pla蛋白。

实施例2、Pla蛋白在杂交瘤株建立与筛选中的应用实例

应用克隆表达的重组Pla蛋白(rPla)免疫动物，采用杂交瘤技术制备细胞系，筛选能分泌抗鼠疫菌Pla抗原的单克隆抗体的杂交瘤细胞株，在瘤株的筛选过程中，应用本发明实施例1提取纯化的天然Pla蛋白(nPla)作为抗原，筛选到了3株能识别天然抗原的杂交瘤细胞株，为建立鼠疫诊断技术及开展相关研究奠定基础。

(1)间接ELISA法筛选杂交瘤株：

以rPla、nPla、rGST为包被抗原，检测融合细胞上清OD值。经棋盘测定，rPla、nPla、rGST包被浓度分别为10μg/ml、5μg/ml、2μg/ml，HRP-羊抗鼠工作浓度为1∶8000(rGST为重组Pla蛋白的标签，免疫时未除去)。经初筛、复测、克隆化后检测，3株阳性细胞株能稳定分泌与nPla特异性结合的单克隆抗体。

下表为克隆化后细胞上清检测结果。

3株杂交瘤各亚株细胞上清不同包被抗原OD值检测结果

(2)Western blot鉴定

将实施例1纯化的Pla蛋白进行SDS-PAGE，电转到PVDF膜，5％脱脂奶粉4℃封闭过夜后以纯化Pla单克隆抗体腹水为一抗、HRP-SPA为二抗进行Western blot，DAB显色。结果如图7所示，显示3株单克隆抗体能特异性地识别提取Pla，在相应的两条蛋白带处发生清晰显色。

Claims (10)

1.一种鼠疫菌纤溶酶原激活因子Pla的提取与纯化方法，该方法包括：

将鼠疫菌体经溶菌酶处理，然后超声破碎，再进行硫酸铵盐析，得到粗提Pla蛋白；

粗提Pla蛋白采用羟基磷灰石层析柱进行层析纯化，其中在上样缓冲液中加入Ca离子，洗脱时先采用磷酸盐缓冲液梯度洗脱，以去除非目的蛋白，再用1N NaOH洗脱目的蛋白，收集样品后用Tris-Cl缓冲液透析，去除NaOH，得到纯化Pla蛋白。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述鼠疫菌体为鼠疫菌疫苗株EV76。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述鼠疫菌体为菌粉，该菌粉的制备方法包括：

将鼠疫菌接种于营养琼脂，28℃孵育48h～72h，用PBS(0.01M，pH7.2～7.4)7000～8000r/min离心20～30min，洗涤菌体两～三次，加入4倍体积-40℃～-60℃预先低温的丙酮，充分混匀，置-40℃～-60℃过夜后，4000r/min，10～20min离心，弃上清，再用预冷丙酮以相同方法洗涤菌体3次，弃尽丙酮，37℃温箱过夜制成菌粉。

4.根据权利要求1所述的方法，该方法包括：

称取鼠疫菌粉，每1.5g菌粉，加入PBS(0.01M pH7.2～7.4)60ml及溶菌酶3mg，4℃条件下，磁力搅拌(120～180转/分)3～4h后，菌悬液进行超声破碎，50％功率，每次10s，间歇10s，共20min；10000～12000r/min离心20min，收集上清，加入PBS将溶液总量补足至90ml～100ml；

上述离心后上清进行硫酸铵沉淀：按照每100ml液体总量加入固体硫酸铵5.6g，提取饱和度在0～10％的沉淀，并用TBS(pH8.5～9.0)充分透析至无硫酸铵，得到粗提Pla蛋白。

5.根据权利要求1所述的方法，该方法包括：

将粗提Pla蛋白经10000～12000r/min、20min离心，取上清过0.45μm滤膜，然后进行层析纯化。

6.根据权利要求1或5所述的方法，其中，所述层析纯化时，上样缓冲液为：5～10mMNaH₂PO₄，20mM Tris-Cl，0.25mM CaCl₂，pH8.5～9.0；所述洗脱缓冲液为：500mM KH₂PO₄，pH6.8。

7.根据权利要求6所述的方法，其中，上样流速0.5～1.0ml/min，洗脱流速2.0～3.0ml/min。

8.根据权利要求6所述的方法，其中，所述层析纯化步骤包括：

以10倍床体积的上样缓冲液平衡层析柱→上样缓冲液对倍稀释预处理后样品上柱进行结合→以5倍床体积上样缓冲液平衡层析柱→以20倍床体积洗脱缓冲液进行梯度洗脱→以5倍床体积上样缓冲液平衡层析柱→以5倍床体积的1N NaOH洗脱，收集NaOH洗脱峰样品并立即以Tris-Cl缓冲液(pH8.5～9.0)进行充分透析，得纯化Pla蛋白。

9.按照权利要求1～8任一项所述方法提取纯化得到的Pla蛋白制品。

10.权利要求9所述的Pla蛋白制品在杂交瘤株建立与筛选中的应用。

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