CN102274283A - 丹参有效部位的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了丹参有效部位的制备方法，采用两次柱层析，第一次是对丹参粉进行柱层析：丹参粉装进柱内，既为被提取物，又为柱的填充物，层析后分别得到丹参脂溶性丹参酮类有效部位和水溶性有效部位粗提液；第二次是对丹参水溶性有效部位粗提液在大孔树脂柱上，进行精细调节洗脱柱层析，得到丹参水溶性有效部位。本发明方法均在40℃以下进行，避免了有效成分在高温下的降解。所用有机溶剂容易回收再使用。本发明操作简单温和，产品的质量，收率和重现性好，成本低，宜于工业化生产，有较大的应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及中药制备，具体涉及丹参有效部位的制备方法，尤其涉及丹参脂溶性丹参酮类和水溶性多酚酸类两个有效部位的制备方法。
背景技术
丹参药物已广泛用于临床治疗心脑血管疾病。近年来，科学研究发现，丹参水溶性化合物中主要活性成分是丹酚酸B及其镁盐，脂溶性化合物中主要活性成分是丹参酮IIA(上海中医药杂志，2010，44(7)82-87)。但是，现在口服丹参类药物中，丹酚酸B及其镁盐的含量普遍较低，难以达到药典要求(江西中医学院学报，2006，18(5)，40.)。由中国科学院上海药物研究所和上海绿谷制药有限公司联合创造，由上海绿谷制药有限公司生产的粉针剂，丹参乙酸镁(丹酚酸B的镁盐)含量达到了50-95％，提高了医疗效果。但是，丹参乙酸镁的制备生产成本高，收率低，以原料丹参粉计仅为1％(中国专利，CN200510028740.7)。就复方丹参片或丹参注射液来看，质量不稳定，由不同厂家生产的同一产品，其中的有效成分相差数倍到数十倍(世界科学技术中医药现代化，2007，02，65-71)。经过多年的研究发现，产生这些问题的一个重要原因是由于生产过程中应用高温加热所致(中国中医药信息杂志，2010，17(12)，113-114)。目前，从丹参提取有效活性成分时，通用的方法是“水煎”或“低醇水煎”，水煎后还要在100℃浓缩水提取液。由上海绿谷制药有限公司生产的粉针剂，除了水煎和加热去水外，还要分别对含50％乙醇的大孔树脂洗脱液以及醇沉后的含90％乙醇水上清液，进行加热除去乙醇和部分水。实验证明，这些加热过程，会使在水溶液中对热不稳定的丹酚酸B及其镁盐被降解(中药新药与临床药理，2006，17(1)，55-57)。
多年前，本发明人发明一种不用高温加热，提取丹参中多酚酸有效部位的方法，全部操作在40℃以下进行，有效地避免了丹酚酸B及其镁盐的降解。产品中丹酚酸B及其镁盐的含量达到了73-75％，但收率以原料丹参粉计只有2％左右(中国专利，CN200510129368.9.)。说明丹参在此提取过程中还有许多丹酚酸B及其镁盐流失。另外，还不能同时制得丹参中脂溶性的丹参酮类有效部位。因此，需要进一步改进丹参有效部位的制备方法。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于克服上述不足之处，研究设计采用简单温和的操作，从丹参中同时制备两个有效部位，收率高，质量好，生产成本低的新方法。
本发明提供了一种丹参有效部位的制备方法。
通过本发明方法制得的丹参有效部位包括脂溶性有效部位与水溶性有效部位。
本发明方法采用两次柱层析，第一次对丹参粉进行柱层析：丹参粉末装进柱内，既为被提取物，又为柱的填充物，层析后分别得到丹参脂溶性有效部位和水溶性有效部位的粗提液；第二次对丹参水溶性有效部位的粗提液在大孔树脂柱上，进行精细调节洗脱柱层析，得到丹参水溶性有效部位。
本发明方法包括下列步骤：
(一)对丹参粉进行柱层析：
(1)丹参粉装进玻璃或不锈钢柱里，以丹参粉重量(公斤)的3-4倍量无水乙醇(升)W/V洗脱，收集流出液得到丹参脂溶性有效部位；所述的柱是定制的，内径8-10厘米，长度为80-120厘米；
(2)上述柱再用以丹参粉重量(公斤)的12-16倍量的无水甲醇(升)W/V洗脱；
或浓度为85-99％的甲醇水溶液，或浓度为75-90％的乙醇水溶液，或甲醇占比例为70-99％的混合有机溶剂，包括甲醇/丙酮、甲醇/乙腈或甲醇/二氯甲烷洗脱，收集流出液；
(3)流出液回收甲醇；
(4)流出液回收甲醇后，进行减压浓缩，当浓缩至1/30-1/40的丹参粉重量(公斤)后，加4-5倍丹参粉重量的水(升)W/V稀释残留物，滤膜(孔径为10-30微米)过滤，滤液为丹参水溶性有效部位粗提液；
(二)对步骤(一)(4)得到的丹参水溶性有效部位粗提液在大孔树脂柱上进行精细调节洗脱柱层析，该方法包括下列步骤：
(1)大孔树脂柱层析：在玻璃或不锈钢柱里加入大孔树脂，上述步骤(一)(4)制得的丹参水溶性有效部位粗提液进入大孔树脂柱，收集流出液；由于大孔树脂柱内粒子之间空隙的体积(升)，约为大孔树脂重量(公斤)的0.6倍(大孔树脂体积的1/3)，因此再加大孔树脂重量(公斤)的0.5-0.6倍量的水(升)W/V洗柱，使残留在大孔树脂粒子之间的丹参水溶性有效部位粗提液，也经过洗柱后流出来，收集流出液，合并二次流出液为流出液甲；所述的柱与上述步骤(一)相同。所述大孔树脂为Amberlite XAD-4、Diaion HP、1300-I、AB-8型、D101型或RA型树脂；用量为丹参粉重量(公斤)的1倍量(公斤)W/W；
(2)重复进样：将流出液甲按步骤(1)再操作一次，得到流出液乙；
(3)去除杂质：用大孔树脂重量(公斤)的1.8-2倍量的20％甲醇水溶液(升)W/V洗柱，目的是除去被树脂吸附的杂质，收集流出液，洗完后再用大孔树脂重量(公斤)的0.5-0.6倍量的70％甲醇水溶液(升)W/V洗柱，以便把残留在树脂上的20％甲醇洗脱液也洗下来，防止它里面的杂质进入产品，收集合并这二次流出液，并与流出液乙合并后为流出液丙，放置作再次柱层析备用；
(4)第一次收集水溶性有效部位：先用大孔树脂重量(公斤)的1.8-2倍量的70％甲醇水溶液(升)W/V洗柱，收集流出液，再加大孔树脂重量(公斤)的0.5-0.6倍量的水(升)W/V洗柱，使残留在树脂上的70％甲醇洗脱液也流出树脂柱，收集合并这二次流出液，为流出液丁，流出液丁即为丹参水溶性有效部位的溶液；
(5)对步骤(3)流出液丙进入大孔树脂柱层析：先用大孔树脂重量(公斤)的1.8-2倍量的水(升)W/V清洗上述大孔树脂柱，弃去流出液，将步骤(3)的流出液丙进柱，收集流出液回收甲醇后弃去；再加大孔树脂(公斤)的0.5-0.6倍量的水(升)W/V洗柱，弃去流出液；该步骤的目的，是把残留在流出液丙中的水溶性有效部位被吸附到大孔树脂上；
(6)去除杂质：用大孔树脂重量(公斤)的1.8-2倍量的20％的甲醇水溶液(升)W/V洗柱，收集流出液；再用大孔树脂重量(公斤)的0.5-0.6倍量的70％甲醇水溶液(升)W/V洗柱，收集合并这二次流出液，回收甲醇后弃去；
(7)收集丹参水溶性有效部位：用大孔树脂重量(公斤)的3-4倍量的70％的甲醇水溶液(升)W/V洗柱，收集流出液；再用大孔树脂重量(公斤)的0.5-0.6倍量的水(升)W/V洗柱，收集合并这二次流出液，再与步骤(4)流出液丁合并，该合并液回收甲醇后得到的水溶液，经冷冻干燥，得到丹参水溶性有效部位的固体粉末。
本发明方法中所述回收甲醇或其它有机溶剂均在35°-40℃用真空浓缩的方法进行。
本发明方法得到的丹参水溶性有效部位中，丹酚酸B及其镁盐的含量为80-85％。丹参脂溶性丹参酮类有效部位中，丹参酮IIA的含量为27-33％，丹酚酸B及其镁盐的含量为4-6％。
本发明方法的特点和显著的预料不到的技术效果：
(一)在第一次柱层析中，丹参粉既为被提取物，又为柱的填充物，其优点是：(1)在常温下提取脂溶性有效部位和水溶性有效部位的粗提液，避免了有效成分在高温下的降介。(2)得到的丹参脂溶性有效部位的主要有效成分是丹参酮IIA，占该部位27-33％，另外该部位还含有4-6％的丹酚酸B及其镁盐，该部位的收率以原料丹参粉计为1.6-1.7％(3)用滤膜过滤取代离心操作。(4)显著地减少能源和溶剂的使用。(5)柱的清洗简便，提取完成后，打开柱的下盖，可轻易地用水冲下丹参粉末残渣和清洗柱。
(二)用“精细调节洗脱柱层析”，取代常规的洗脱柱层析，用较少的洗脱剂，通过对加样，洗脱过程中的每一步进行精细的调节，把点滴可能流失的丹酚酸B及其镁盐，尽可能地收回来；同时最大限度地除去了杂质，得到的丹参水溶性有效部位中，丹酚酸B及其镁盐的含量，从以前的73-75％，提高到80-85％，收率以原料丹参粉计从2％提高到3.3-3.8％。该步骤为液体于管道内进行，操作方便，并可以全程自动化。本发明操作简单温和，重现性好，有机溶剂可回收利用，成本低，宜于工业化生产，有较大的应用价值。
附图说明
图1实施例1中制备的丹参水溶性和脂溶性有效部位高效硅胶薄板层析。点样顺序是：1，制备的丹参水溶性有效部位；2，对照品纯丹酚酸B及其镁盐；3，制备的丹参脂溶性有效部位；4，对照品纯脂溶性有效部位。展开剂为氯仿-甲醇-水(体积比＝5∶4∶0.6)。层析板用含8％磷酸，3％醋酸铜水溶液喷雾后，在120℃加热碳化显色。在图1-2的中间偏下，是对照品纯丹酚酸B及其镁盐的条带；在图1-4顶端的条带，是对照品纯脂溶性丹参酮类有效部位。从图中可以看出，图1-1制备的丹参水溶性有效部位中，主要成分是丹酚酸B及其镁盐；图1-3制备的丹参脂溶性有效部位中，除了丹参酮类有效部位外，还含有少量的丹酚酸B及其镁盐。
图2实施例1中制备的丹参水溶性有效部位高效液相色谱-电喷雾飞行时间质谱(HPLC-ESI/MS)中的高效液相色谱。仪器ThermoScientific LXQ；色谱柱Hypersil GOLD，1.9微米，2.1x50毫米。进样量约0.2微克。梯度洗脱，A＝H2O，B＝乙腈，A和B都含有0.1％甲酸，零到10分钟，由100％A到60％A，然后用90％B洗柱。流速0.25毫升/分钟，检测波长UV270nm。从图3和图4对其主峰(7.92)进行质谱分析中可以看出，主峰的成分是丹酚酸B及其镁盐，占该有效部位的83％。该色谱中其它两个峰所含的多酚酸分别是迷迭香酸(7.46)和丹酚酸(在7.92和7.46之间的峰)。
图3图2高效液相色谱中的主峰(7.92)电喷雾飞行时间质谱。正离子反映模式。M/Z 719.01为丹酚酸B的分子离子峰。M/Z 1436.63是丹酚酸B的二聚体分子离子峰。M/Z 539.19是丹酚酸B特征性碎片离子峰。由于技术上的原因，该质谱图上没有见到丹酚酸B镁盐的离子峰，但实施例1中制备的丹参水溶性有效部位在图4的基质铺助激光解析离子飞行质谱上可以看到丹酚酸B镁盐的离子峰。
图4实施例1中制备的丹参水溶性有效部位的基质铺助激光解析离子飞行质谱(MALDI-MS)。仪器Bruker公司的Autoflex III。基质主要由6-氮杂-2-硫代胸腺嘧啶(ATT)和部分柠檬酸铵(AC)组成。负离子反映模式。M/Z 717和M/Z 739，分别为丹酚酸B和丹酚酸B镁盐的分子离子峰；M/Z 858和M/Z 880，分别为丹酚酸B+ATT和丹酚酸B镁盐+ATT的分子离子峰，M/Z 519是丹酚酸B特征性碎片离子峰；M/Z 589是来自基质的离子峰。
图5实施例2的丹参水溶性有效部位高效液相色谱。操作条件和图2的相同。其高效液相色谱和图2的相似，主峰的保留时间为7.94，和图2的7.92非常接近，说明其所含成分是丹酚酸B及其镁盐，含量占有效部位的81％，这些都说明本发明方法的重现性好。
图6实施例1制备的丹参脂溶性有效部位高效液相色谱-电喷雾飞行时间质谱中的高效液相色谱。除了梯度洗脱改为零到10分钟，由100％A到10％A外，其它操作条件和图2说明中的相同。根据对其色谱中主要化合物峰的质谱分析结果，4种主要丹参酮化合物分别是：丹参酮IIA(9.64，主峰)，二氢丹参酮I(在9.64和8.84之间的峰)，隐丹参酮(8.84)和丹参酮I(8.00)，其中含量最高的丹参酮IIA，占该有效部位的29％。此外，该部位还含有丹酚酸B及其镁盐(4.91)，含量占该部位的5.5％。
图7图6高效液相色谱中主峰(9.64)的电喷雾飞行时间质谱。正离子反映模式。M/Z 295是丹参酮IIA的分子离子峰。
图8实施例2的丹参脂溶性有效部位高效液相色谱。操作条件和图6的相同。其色谱和图6的相似，主峰的保留时间为9.65，和图6的9.64非常接近，说明其所含成分是丹参酮IIA，含量占有效部位的32％。此外，还含有4.5％的丹酚酸B及其镁盐(4.92)。这些都说明本发明方法的重现性好。
具体实施方式
下面提供的实施例，仅为进一步说明本发明，它们对本发明并不构成任何限制。
实施例1
(一)对丹参粉末进行柱层析。
(1)丹参粉1公斤(购自安徽毫州，40目)，装进内径10厘米，长度80厘米的玻璃柱(定制的)内，先用3升无水乙醇洗脱，得到丹参脂溶性有效部位，回收乙醇后固体物重17.1克。其中主要成分是丹参酮IIA，占该部位的29％，还含有5.5％的丹酚酸B及其镁盐，总的收率以原料丹参粉计为1.7％。
(2)再用12升无水甲醇洗脱，收集流出液。
(3)回收流出液中的甲醇。
(4)当流出液减压浓缩至0.3公斤时，加水稀释残留物到4升，滤膜过滤，丹参水溶性有效部位在滤液中，该滤液为丹参水溶性有效部位粗提液。
(二)对上述步骤(一)(4)丹参水溶性有效部位粗提液在大孔树脂柱上，进行精细调节洗脱柱层析。
美国SIGMA公司的Amberlite XAD-4大孔树脂柱2公斤，装进与上述步骤(一)同样大小的玻璃柱内。
(1)进样：慢慢加步骤(一)(4)丹参水溶性有效部位粗提液进柱，流出后，再加1.2升的水洗柱，收集合并这二次流出液，称流出液甲。
(2)重复进样：流出液甲再慢慢加进柱，流出后，再加1.2升水洗柱，收集合并这二次流出液，称流出液乙。
(3)加3.6升20％的甲醇水溶液洗柱后，再加1.2升70％甲醇水溶液洗柱，收集合并这二次流出液，再与流出液乙合并后，称流出液丙，放置等再次柱层析。
(4)加3.6升70％甲醇水溶液洗柱后，再加1.2升水洗柱，收集合并这二次流出液，称流出液丁，丹参水溶性有效部位被洗脱在其中。
(5)对流出液丙进行大孔树脂柱层析。先加3.6升水清洗大孔树脂柱，弃去流出液。慢慢加流出液丙进柱，流出后再加1.2升水洗柱，收集合并这二次流出液，回收其中的甲醇后弃去。
(6)加3.6升20％的甲醇水溶液洗柱后，再加1.2升70％甲醇水溶液洗柱，收集合并这二次流出液，回收其中的甲醇后弃去。
(7)加7.2升70％的甲醇水溶液洗柱，再加1.2升水洗柱，收集合并这二次流出液，并与上述流出液丁合并，回收其中的甲醇后，留下的水溶液经过冰冻干燥，得到最终产品丹参水溶性有效部位的固体粉末，重35.3克。在最终产品中，主要成分是丹酚酸B及其镁盐，含量达83％，收率以原料丹参粉计为3.5％。
上述产品鉴定，见附图说明。
图1的对照品制备如下：
纯丹酚酸B及其镁盐的制备：仪器Waters 626 system，色谱柱C18Symmetry 300TM，5微米，4.6x250毫米。样品用本实施例1制备的水溶性有效部位，梯度洗脱，A＝H2O，B＝乙腈，A和B都含有0.1％甲酸，零到30分钟，由100％A到60％A，流速1毫升/分钟，检测波长UV270nm，收集第25到26分钟的流出液。经质谱鉴定流出液中仅含有丹酚酸B及其镁盐。
纯脂溶性有效部位的制备：样品用本实施例1制备的脂溶性有效部位，这里仅下面条件不同于上述纯丹酚酸B及其镁盐的制备操作：梯度洗脱，零到30分钟，由100％A到10％A，收集第19到28分钟的流出液，经质谱鉴定流出液中仅含有丹参酮类化合物。
实施例2
操作同实施例1
1，对丹参粉进行柱层析。
丹参粉1公斤，装进上述实施例1相同的玻璃柱内，先用3升无水丙酮洗脱，得到丹参脂溶性有效部位，回收丙酮后固体物重16.3克。其中主要成分是丹参酮IIA，占有效部位的30％，还含有4.6％的丹酚酸B及其镁盐，总的收率以原料丹参粉末计为1.6％。再用12升甲醇/乙醇(比例为9比1)混合有机溶剂洗脱，流出液中的甲醇和乙醇回收后，残留物加水稀释到4升，滤膜过滤，丹参水溶性有效部位在滤液中，该滤液称丹参水溶性有效部位粗提液。
2，对上述丹参水溶性有效部位粗提液在大孔树脂柱上，进行精细调节洗脱柱层析。
以下操作和实施例1步骤(二)的第1-7步的操作完全相同，这里不再重复，得到最终产品丹参水溶性有效部位的固体粉末，重36.4克。在产品中，主要成分是丹酚酸B及其镁盐，含量达81％，收率以原料丹参粉计为3.6％。
实施例3
操作同实施例1
1，对丹参粉进行柱层析。
丹参粉1公斤，装进上述实施例1相同的玻璃柱内，先用3升无水乙醇洗脱，得到丹参脂溶性有效部位，回收乙醇后固体物重16.9克，其中主要成分是丹参酮IIA，占该部位的31％，还含有4.8％的丹酚酸B及其镁盐，总的收率以原料丹参粉计为1.7％。再用16升浓度为90％的乙醇水溶液洗脱，流出液中的乙醇回收后，残留物加水稀释到4升，滤膜过滤，水溶性有效部位在滤液中，该滤液称粗提液。
2，对粗提液在大孔树脂柱上，进行精细调节洗脱柱层析。
这里的柱层析和实施例1的不同仅在于，用浓度为15％和55％的乙醇水溶液分别代替20％和70％的甲醇水溶液，进行精细调节洗脱柱层析，实际操作均与实施例1的相同，得到最终产品丹参水溶性有效部位的固体粉末，重33.2克。在产品中，主要成分是丹酚酸B及其镁盐，含量达85％，收率以原料丹参粉末计为3.3％。
Claims (9)
1.丹参有效部位的制备方法，其特征在于，该方法包括下列步骤：
(一)对丹参粉进行柱层析：
(1)丹参粉装进玻璃或不锈钢柱里，以丹参粉重量公斤的3-4倍量无水乙醇升W/V洗脱，收集流出液得到脂溶性有效部位；
(2)上述柱再用以丹参粉重量公斤的12-16倍量的无水甲醇升W/V洗脱；
(3)流出液回收甲醇；
(4)流出液回收甲醇后，进行减压浓缩，当浓缩至1/30-1/40的丹参粉重量公斤后，加4-5倍丹参粉重量的水升W/V稀释残留物，滤膜过滤，滤液为丹参水溶性有效部位粗提液；
(二)对步骤(一)(4)得到的水溶性有效部位粗提液在大孔树脂柱上进行精细调节洗脱柱层析，该方法包括下列步骤：
(1)大孔树脂柱层析：在玻璃或不锈钢柱里加入大孔树脂，上述步骤(一)(4)制得的丹参水溶性有效部位粗提液进入大孔树脂柱，收集流出液；再加大孔树脂重量公斤的0.5-0.6倍量的水升W/V洗柱，使残留在大孔树脂粒子之间的粗提液，也经过洗柱后流出来，收集流出液，合并这二次流出液为流出液甲；
(2)重复进样：将流出液甲按步骤(1)再操作一次，得到流出液乙；
(3)去除杂质：用大孔树脂重量公斤的1.8-2倍量的20％甲醇水溶液升W/V洗柱，收集流出液，洗完后再用大孔树脂重量公斤的0.5-0.6倍量的70％甲醇水溶液升W/V洗柱，收集合并这二次流出液，并与流出液乙合并后为流出液丙，放置作再次柱层析备用；
(4)第一次收集丹参水溶性有效部位：先用大孔树脂重量公斤的1.8-2倍量的70％甲醇水溶液升洗柱W/V，收集流出液，再加大孔树脂重量公斤的0.5-0.6倍量的水升洗柱，收集合并这二次流出液，为流出液丁，即丹参水溶性有效部位的溶液；
(5)对步骤(3)流出液丙进入大孔树脂柱层析：先用大孔树脂重量公斤的1.8-2倍量的水升W/V清洗上述大孔树脂柱，弃去流出液，将步骤(3)的流出液丙进柱，收集流出液回收甲醇后弃去；再加大孔树脂重量公斤的0.5-0.6倍量的水升W/V洗柱，弃去流出液；
(6)去除杂质：用大孔树脂重量公斤的1.8-2倍量的20％的甲醇水溶液升洗柱，收集流出液；再用大孔树脂重量公斤的0.5-0.6倍量的70％甲醇水溶液升洗柱，收集合并这二次流出液，回收甲醇后弃去；
(7)制备丹参水溶性有效部位：用大孔树脂重量公斤的3-4倍量的70％的甲醇水溶液升W/V洗柱，收集流出液；再用大孔树脂重量公斤的0.5-0.6倍量的水升W/V洗柱，收集合并这二次流出液，再与步骤(4)流出液丁合并，该合并液回收甲醇后得到的水溶液，经冷冻干燥，制得丹参水溶性有效部位的固体粉末。
2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述步骤(一)(1)或步骤(二)(1)玻璃或不锈钢柱的内径为8-10厘米，长度为120-80厘米。
3.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述步骤(一)(2)以丹参粉重量公斤的12-16倍量的85-99％的甲醇水溶液、无水甲醇或75-90％的乙醇水溶液升W/V洗脱。
4.根据权利要求3所述方法，其特征在于，所述步骤(一)(2)以丹参粉重量公斤的12-16倍量的无水甲醇升W/V洗脱。
5.根据权利要求3所述方法，其特征在于，所述步骤(一)(2)以丹参粉重量公斤的12-16倍量的甲醇/丙酮、甲醇/乙腈或甲醇/二氯甲烷的混合有机溶剂升W/V洗脱；所述混合有机溶剂中含甲醇比例为70-99％。
6.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述步骤(一)(4)滤膜孔径为10-30微米。
7.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述步骤(二)大孔树脂为Amberlite XAD-4、Diaion HP、1300-I、AB-8型、D101型或RA型树脂；所述大孔树脂用量为丹参粉重量公斤的1倍量公斤W/W。
8.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述步骤(一)或(二)中的回收甲醇或其它有机溶剂均在35°-40℃，用真空浓缩的方法进行。
9.根据权利要求1所述方法，其特征在于，得到的丹参水溶性有效部位的有效成分丹酚酸B及其镁盐的含量为80-85％；丹参脂溶性有效部位的有效成分丹参酮IIA的含量为27-33％，丹酚酸B及其镁盐的含量为4-6％。
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