CN104586831A - 一种高含量丹酚酸b在制备抗宫颈癌药物中的应用及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种高含量丹酚酸B在制备抗宫颈癌药物中的应用及其制备方法，其特征在于：抗宫颈癌药物是以高含量丹酚酸B作为活性成分与药用载体制得的子宫颈或子宫腔给药的制剂，一种高含量丹酚酸B的抗宫颈癌药物，高效、安全、低毒副作用，为抗宫颈癌药物提供重要支持，避免了现有化疗药物对身体较大的毒副作用。

Description

一种高含量丹酚酸B在制备抗宫颈癌药物中的应用及其制备方法

技术领域

本发明涉及医药技术领域，特别是涉及一种高含量丹酚酸B在制备抗宫颈癌药物中的应用及其制备方法。 

背景技术

宫颈癌是常见的女性生殖系统恶性肿瘤之一，在发展中国家仅次于乳腺癌居第2位，2008年全球估计新发宫颈癌病例52.98万，死亡病例25.51万人，其中85%新发病例在发展中国家（Jemal，2011）。宫颈癌是目前唯一一个病因明确的妇科恶性肿瘤，与高危型人乳头瘤病毒（humanpapillomaviruses,HPV）的持续感染相关。HPV病毒是一种双链DNA病毒，具有球形外壳，直径55nm，主要感染皮肤粘膜上皮，导致不同病变。HPV病毒可直接通过皮肤接触传播，有十几年的潜伏期，故其发病率有明显的地区差异。我国宫颈癌分布主要在中部地区，农村高于城市，山区高于平原，全国高发区有江西铜鼓，湖北五峰，陕西略阳等。 

临床上，宫颈癌常用的治疗手段是：保守疗法（激光、微波、冷冻），手术疗法（部分或全部切除），放射疗法（腔内照射多用后装治疗机，放射源有 137 铯、 192 铱等，主要针对宫颈原发病灶。腔外照射采用 60 钴、直线加速器等），手术和放射联合疗法，化学疗法（有效的药物有顺铂、环磷酰胺、异环磷酰胺、阿霉素、博来霉素等。多采用以顺铂为主的三联或四联化疗，经静脉或区域性动脉插管给药）。 

上述疗法对患者的生存状态有负面影响，对身体的损害较大，其中化学疗法的药物，均为细胞毒性类化疗药，有较大的毒副反应，这点在临床应用中一直困扰着医患人员。 

发明内容

为了克服上述现有技术的不足，本发明提供了一种高含量丹酚酸B在制备抗宫颈癌药物中的应用，其目的是为研制一种新的高效、安全、低毒副作用的抗宫颈癌药物提供重要支持，避免了现有化疗药物对身体较大的毒副作用。 

本发明所采用的技术方案是：一种高含量丹酚酸B在制备抗宫颈癌药物中的应用，抗宫颈癌药物是以高含量丹酚酸B作为活性成分与药用载体制得的子宫颈或子宫腔给药的制剂，且其分子结构式为 。 

进一步地，高含量丹酚酸B作为活性成分的制剂中，丹酚酸B的含量为20%—95%。 

优选地，丹酚酸B的含量大于90%，丹酚酸B的结构式分子量为718。 

进一步地，子宫颈或子宫腔给药的制剂包括注射剂、软膏剂、乳膏剂、糊剂、凝胶剂、栓剂。 

一种高含量丹酚酸B的制备方法，是通过以下步骤制备的： 

第一步，粗提液制备：取经蒸馏水浸泡后的丹参粉溶液混合物装进层析柱中，用溶剂1洗脱，收集脂溶性有效部位A；剩余溶液再用溶剂2洗脱，流出液经过去溶剂化处理后得含丹参水溶性多酚酸有效部位B的溶液，该即为粗提液，备用；

第二歩，层析步骤：将Amberlite XAD-4大孔树脂装进层析柱内，再将粗提液装入层析柱内，依次用溶剂2洗脱，得丹参水溶性多酚酸有效部位C，最后用溶剂3清洗层析柱，再蒸馏水清洗层析柱；

第三歩，提纯步骤：将丹参水溶性多酚酸有效部位C加入蒸馏容器内，按顺序由溶剂2、溶剂1和溶剂3进行提纯，最后得淡黄色流出液，回收流出液中的溶剂后，留下的水溶液经过冷冻干燥，得浅棕色固体粉末。

优选地，在制备高含量丹酚酸B时，溶剂1为含量90%以上的甲醇或无水乙醇，溶剂2为含量70%以上的甲醇或55%以上的乙醇，溶剂3为含量20%以上甲醇或15%以上乙醇。 

与现有技术相比，本发明的有益效果是：丹酚酸B盐是一种提取自传统中药丹参（鼠尾草属唇形科植物丹参Salvia Miltiorrhiza Bge.的根及根茎）的有效单体，有活血化瘀、抗氧化、保护心脏、保护脑及抑制纤维化的作用，临床上常用于治疗心脑血管类疾病（中国专利CN2155004、CN01110378、CN98111076）。近年来实验室研究发现，丹酚酸B有杀伤肿瘤细胞的作用（中国中药杂志35（2010）389-392、中国专利CN02136970、CN94103933），体内、体外实验表明丹酚酸B镁盐对多种肿瘤细胞株的生长具有较好的抑制作用。体外MTT实验中，丹酚酸B镁盐对人肾癌（786-0）、小鼠乳腺癌（C127）、人乳腺癌（MCF-7）、人肝癌（Hep G2）、小鼠黑色素瘤（B16）、人胃癌（SGC-7901，AGS）、人食管癌（Eca-109）等细胞株的最大抑制率皆达到40%以上。有抗乙肝病毒的作用（中国专利CN95105902），其中对肝癌细胞株HepG2的最大抑制率可达到90%以上。其还具有抗艾滋病的作用（美国专利US6043276，中国专利CN95105902、CN99809677）。 

一种高含量丹酚酸B的抗宫颈癌药物，高效、安全、低毒副作用，为抗宫颈癌药物提供重要支持，避免了现有化疗药物对身体较大的毒副作用。 

附图说明

图1为实施例1的肿瘤细胞杀伤剂量依赖关系图； 

图2为实施例1的肿瘤细胞杀伤时间依赖关系；

图3为丹酚酸B一种样品的HPLC图谱；

图4为丹酚酸B另一种样品的HPLC图谱；

图5为一名手部感染乳头瘤病毒患者用药前后对比图；

图6为一名脸部感染乳头瘤病毒患者用药前后对比图；

图7为另一名脸部感染乳头瘤病毒患者用药前后对比图。

具体实施方式

为了加深对本发明的理解，下面结合附图和实施例对本发明进一步说明，该实施例仅用于解释本发明，并不对本发明的保护范围构成限定。 

一种高含量丹酚酸B在制备抗宫颈癌药物中的应用，抗宫颈癌药物是以高含量丹酚酸B作为活性成分与药用载体制得的子宫颈或子宫腔给药的制剂，可以起到高效、安全、低毒副作用的抗宫颈癌药物提供重要支持，避免了现有化疗药物对身体较大的毒副作用，一种高含量丹酚酸B的分子结构式为： 

，其分子量为718。

 将高含量丹酚酸B作为活性成分的制剂中，丹酚酸B的含量为20%—95%，作为优选丹酚酸B的含量大于90%。 

一般来说，子宫颈或子宫腔给药的制剂包括注射剂、软膏剂、乳膏剂、糊剂、凝胶剂、栓剂。 

一种高含量丹酚酸B的制备方法，如下： 

第一步，粗提液制备：取经蒸馏水浸泡后的丹参粉溶液混合物装进层析柱中，用溶剂1洗脱，收集脂溶性有效部位A；剩余溶液再用溶剂2洗脱，流出液经过去溶剂化处理后得含丹参水溶性多酚酸有效部位B的溶液，该即为粗提液，备用；

第二歩，层析步骤：将Amberlite XAD-4大孔树脂装进层析柱内，再将粗提液装入层析柱内，依次用溶剂2洗脱，得丹参水溶性多酚酸有效部位C，最后用溶剂3清洗层析柱，再蒸馏水清洗层析柱；

第三歩，提纯步骤：将丹参水溶性多酚酸有效部位C加入蒸馏容器内，按顺序由溶剂2、溶剂1和溶剂3进行提纯，最后得淡黄色流出液，回收流出液中的溶剂后，留下的水溶液经过冷冻干燥，得浅棕色固体粉末。

在制备一种高含量丹酚酸B时，溶剂1为含量90%以上的甲醇或无水乙醇，溶剂2为含量70%以上的甲醇或55%以上的乙醇，溶剂3为含量20%以上甲醇或15%以上乙醇。 

如图3、图4所示为两种高含量丹酚酸B的样品的HPLC图谱。 

实施例1 高含量丹酚酸B对子宫颈癌细胞hela杀伤实验 

复旦大学上海医学院的姚明辉、赵超、汪慧菁试验员，针对高含量丹酚酸B对子宫颈癌细胞hela杀伤力做了如下试验： 

取来自江苏丹晟提供的化合物（棕褐色粉末状，零下20度密闭存放的药物）， 来自美国ATCC的细胞系Hela（本实验室液氮备存细胞株），依据常规培养细胞，DMEM，10%胎牛血清（均来自Gibco，Invitrogen），5%CO2培养。细胞培养后达到90~95%覆盖度传代。按照1x105/孔，接种于96孔板。24小时后加入药物。

处理一定时间后，采用CCK -8法测定细胞数量，（来自日本同仁化学）参照说明书。每100ul无血清DMEM加入10ul CCK-8试剂。37度避光培养1小时后，OD450读数（美国）依照说明书绘制标准曲线，计算相对细胞含量。 

最后，细胞数量用t检验，结果以（存活百分数±SD）%表示，评估杀伤作用。 

试验结果显示：1.肿瘤细胞杀伤剂量依赖关系（分别设置高中低1，0.1，0.01 mg/ml三个浓度【终浓度】，100ul培养液/孔，加入1ul 100X药物稀释液。100X药物稀释液以无菌双蒸水新鲜配置，-20度存放一周内使用）加入药物24小时后测定，结果见图1和下表所示： 

从上表可以看出低中高浓度组对Hela细胞杀伤率分别是（38.1±5.8）%，（45.1±4.47）%和（61.8±10.3）%。

注：杀伤率=（1-存活率）x100%。 

如图1所示，横轴表示药物不同浓度分组，1空白对照，2. 0.01mg/ml组 3. 0.1mg/ml组 4 1mg/ml组，纵轴表示细胞存活相对量。 

2．肿瘤细胞杀伤时间依赖关系（以0.1mg/ml浓度，分别处理3，6，12，24，48，72小时）如图2所示， 1~7分别是加药后0，3，6，12，24，48，72小时，线条1代表空白对照，线条2代表加入药物处理，从图2可以看出，药物处理24小时后达到较好的抑制效果。 

实施例2，临床病例 

如图5所示，王某某，7岁，某某小学一年级学生，2012年2月手部感染乳头瘤病毒，用冷冻方法、干扰素等药物多方治疗无效后，用该发明每日三次涂抹，治疗20天，痊愈。

实施例3，临床病例 

如图6所示，程某某，女，27岁，职业为服务员，2011年8月脸部感染乳头瘤病毒，用干扰素等药物多方治疗无效，用该发明每日三次涂抹，治疗40天，痊愈。

实施例4，临床病例 

如图7所示，袁某某，职业为快递员，2012年9月脸部感染乳头瘤病毒，用冷冻、激光等多方法治疗无效后，用该发明每日三次涂抹，治疗32天，痊愈。

本发明的一种高含量丹酚酸B的抗宫颈癌药物，高效、安全、低毒副作用，为抗宫颈癌药物提供重要支持，避免了现有化疗药物对身体较大的毒副作用。 

本发明的实施例公布的是较佳的实施例，但并不局限于此，本领域的普通技术人员，极易根据上述实施例，领会本发明的精神，并做出不同的引申和变化，但只要不脱离本发明的精神，都在本发明的保护范围内。 

Claims (7)

1.一种高含量丹酚酸B在制备抗宫颈癌药物中的应用，其特征在于：所述抗宫颈癌药物是以高含量丹酚酸B作为活性成分与药用载体制得的子宫颈或子宫腔给药的制剂，且其分子结构式为：

。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述高含量丹酚酸B作为活性成分的制剂中，丹酚酸B的含量为20%—95%。

3.根据权利要求1、2所述的应用，其特征在于：所述丹酚酸B的含量大于90%。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述丹酚酸B的结构式分子量为718。

5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述子宫颈或子宫腔给药的制剂包括注射剂、软膏剂、乳膏剂、糊剂、凝胶剂、栓剂。

6.一种高含量丹酚酸B的制备方法，其特征在于：所述的高含量丹酚酸B是通过以下方法制备的：

第一步，粗提液制备：取经蒸馏水浸泡后的丹参粉溶液混合物装进层析柱中，用溶剂1洗脱，收集脂溶性有效部位A；剩余溶液再用溶剂2洗脱，流出液经过去溶剂化处理后得含丹参水溶性多酚酸有效部位B的溶液，该即为粗提液，备用；

第二歩，层析步骤：将Amberlite XAD-4大孔树脂装进层析柱内，再将粗提液装入层析柱内，依次用溶剂2洗脱，得丹参水溶性多酚酸有效部位C，最后用溶剂3清洗层析柱，再蒸馏水清洗层析柱；

第三歩，提纯步骤：将丹参水溶性多酚酸有效部位C加入蒸馏容器内，按顺序由溶剂2、溶剂1和溶剂3进行提纯，最后得淡黄色流出液，回收流出液中的溶剂后，留下的水溶液经过冷冻干燥，得浅棕色固体粉末。

7.根据权利要求6所述的一种高含量丹酚酸B的制备方法，其特征在于：所述溶剂1为含量90%以上的甲醇或无水乙醇，溶剂2为含量70%以上的甲醇或55%以上的乙醇，溶剂3为含量20%以上甲醇或15%以上乙醇。