CN102272129A

CN102272129A - 硫酸化c-糖苷及其分离方法以及合成方法

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Publication number: CN102272129A
Application number: CN2009801536723A
Authority: CN
Inventors: 石田均司
Original assignee: University of Shizuoka
Current assignee: University of Shizuoka
Priority date: 2009-01-03
Filing date: 2009-12-25
Publication date: 2011-12-07
Anticipated expiration: 2029-12-25
Also published as: KR101615876B1; EP2385049A4; CN102272129B; EP2385049A1; US20120029183A1; JP5597142B2; KR20110120278A; CA2748729A1; JPWO2010076879A1; WO2010076879A1; US8367622B2

Abstract

本发明的课题在于提供一种作为茶呋塞米及其类似物的前体的新型的化合物硫酸化C-糖苷、及该硫酸化C-糖苷的高效制备方法、以及使用了该硫酸化C-糖苷的茶呋塞米及其类似物的高效制备方法。使用水、碳原子数1-3的低级醇溶剂或它们的混合液从茶叶或茶垢中提取下述通式(A1)或(B1)(式中，R₁、R₂和R₃各自独立地表示氢原子或OH基)表示的硫酸化C-糖苷，或者通过使异牡荆素或牡荆素等的黄酮C-糖苷与硫酸基引入剂反应将该黄酮C-糖苷硫酸化来制备所述硫酸化C-糖苷，通过加热所得硫酸化C-糖苷，高效地制备茶呋塞米及其类似物。

Description

硫酸化C-糖苷及其分离方法以及合成方法

技术领域

本发明涉及作为新型化合物的硫酸化C-糖苷。具体地，本发明涉及可期待与甾体药剂等同或更优良的抗炎作用等的生理活性的作为茶呋塞米(chafuroside)及其类似物的前体的硫酸化C-糖苷，从茶叶分离硫酸化C-糖苷的方法、硫酸化C-糖苷的新型的合成方法，以及由该硫酸化C-糖苷制备茶呋塞米及其类似物的方法。

背景技术

公知茶呋塞米是黄酮衍生物的一种的黄酮C-糖苷(C-glycoside)，显示出抗氧化作用、抗过敏作用、抗炎作用、抑制癌症作用等。公知茶呋塞米是从乌龙茶分离的化合物，其结构式已确定。

上原等人使遗传性过敏症患者每天早餐和晚餐后饮用将市售的乌龙茶浓缩两倍的浓溶液400ml的一半，饮用4周，进行检测是否有效预防该患者特有的皮肤炎症及伴随该炎症的严重的发痒症的试验，得到该乌龙茶对参加该试验的遗传性过敏症患者的62％有效的见解(参照非专利文献1)。

基于上述见解，糠谷等人以对2，4-二硝基氟苯诱发的遗传性过敏症模型的有效性为分离的指标，尝试了从该乌龙茶分离有效成分(参照专利文献1)。其结果，从该乌龙茶用的茶叶约3.5kg经口给药得到显示活性的两种成分分别约1mg，确定结构式，由于为新物质，命名为茶呋塞米A和茶呋塞米B(参照专利文献1)。

根据此，茶呋塞米A和B能够以下述结构式分别表示为A2-2和B2-2。

[化学式1]

接着，对于茶呋塞米A和B的生物活性进行了详细的研究。并且，在2，4-二硝基氟苯诱发的遗传性过敏症模型中，茶呋塞米A以比市售的甾体抗炎药泼尼松龙(predonisolone)(10mg/kg)以及倍他米松(betamethasone)(0.8mg/kg)低的10μg/kg的用量显示出与它们同等程度的显著的抑制皮肤炎症的活性(参照专利文献1、非专利文献2)。

另外，确认了茶呋塞米A对于氧化偶氮甲烷(AOM)诱发的小鼠的大肠息肉的形成，以与吲哚美辛(indomethacin)同等用量2.5mg/kg发挥出有效的抑制作用。并且，推测该效果是由于茶呋塞米A对COX-2的阻碍作用。从这些情况以及其结构出发，茶呋塞米A成为新型的抗炎剂的可能性很高(参照专利文献2、非专利文献3)。

这样，茶呋塞米A和B比现在最有用的药物之一的甾体抗炎药更优良的生理活性，可期待它的实用性，由此，以往研究了用于在工业上制备它们的各种各样的方法。例如，进行了由已知的作为黄酮C-糖苷异牡荆素(isovitexin)或牡荆素(vitexin)分别合成的尝试，其中，提出了使用以下的化学反应式所示的光延反应由异牡荆素或荆黄素来合成茶呋塞米A和B(专利文献2)。然而，该方法由于使用爆炸危险性高的偶氮试剂，其工业化极其困难。

[化学式2]

另外，在上述的非专利文献2中，也公开了茶呋塞米A的新型的化学合成方法，但是存在安全性低的缺点(参照专利文献3、专利文献4、非专利文献2)。

从上述的茶呋塞米A和B的结构、制备方法以及生理活性等出发，茶呋塞米A和B在乌龙茶叶中的生成机理非常有意思，但是还未确立简便且高收率的、并且安全的廉价的工业生产方法，从这些化合物的很高的实用性考虑，强烈期望其高效的生产方法的开发。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：特开2004-035474号公报

专利文献2：特开2006-342103号公报

专利文献3：特开2005-314260号公报

专利文献4：特开2005-289888号公报

非专利文献

非专利文献1：上原等，皮肤科纪要92，143-148(1997)

非专利文献2：T.Nakatsuka et al.，Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 14(2004)3201-3203

非专利文献3：N.Niho et al.，Cancer Science 97(2006)248-251

发明内容

本发明以提供一种作为茶呋塞米及其类似物的前体的新型的化合物硫酸化C-糖苷、及该硫酸化C-糖苷的高效制备方法、以及使用了该硫酸化C-糖苷的茶呋塞米及其类似物的高效制备方法为课题。

本发明的发明人对茶呋塞米A和B的生成要素进行了研究，成功地确定了生成要素。并且，基于该成果，通过分离茶呋塞米A和B的各前体，利用各种物理化学数据推定作为新型化合物的茶呋塞米A和B的两前体的结构，通过合成确定了结构。

进而，通过加热这些前体，发现能够容易地且高收率地分别向茶呋塞米A和B变换，即利用这些前体能够极其有效地得到茶呋塞米A和B。

另外，如下述通式所示，可认为具有茶呋塞米A和B各前体的部分结构(a)(下述式中，左)的化合物可分别变换为具有与茶呋塞米A和B相同部分结构(b)(下述式中，右)的化合物，由此，可推定从具有该部分结构(a)的其它的化合物组也同样地得到具有与茶呋塞米A和B相同部分结构的化合物组。

[化学式3]

本发明的发明人以上述情况为前提，发现可从自然界或能够合成制备的糖衍生物的2-硫酸盐衍生茶呋塞米及其类似化合物，从而完成了本发明。

即，本发明提供了以下所示的硫酸化C-糖苷及其分离方法以及合成方法、以及由该硫酸化C-糖苷制备茶呋塞米及其类似物的方法。

(1)一种下述通式(A1)或(B1)表示的硫酸化C-糖苷，

[化学式4]

(上述通式(A1)和(B1)中，R₁、R₂和R₃各自独立地表示氢原子或 OH基。)

(2)根据权利要求1所述的硫酸化C-糖苷，其中，所述硫酸化C-糖苷为下述式(A1-2)表示的异牡荆素的硫酸化物或下述通式(B1-2)表示的牡荆素的硫酸化物，

[化学式5]

(3)一种硫酸化C-糖苷的分离方法，该方法为分离(1)或(2)所述的硫酸化C-糖苷的方法，其特征在于，该分离方法包括使用水、碳原子数1-3的低级醇溶剂或它们的混合液从含有所述硫酸化C-糖苷的茶叶或茶垢中提取该硫酸化C-糖苷的工序。

(4)根据权利要求3所述的硫酸化C-糖苷的分离方法，其中，该分离方法包括以下的工序(i)、(ii)以及(iii)：

(i)提取工序：使用水、碳原子数1-3的低级醇溶剂或它们的混合液对含有所述硫酸化C-糖苷的茶叶或茶垢的粉碎物进行提取，得到含有该硫酸化C-糖苷的提取液；

(ii)浓缩和干燥工序：在减压下将所述提取工序(i)中得到的提取液加热浓缩干燥，得到含有所述硫酸化C-糖苷的干燥物质；

(iii)精制工序：使用水和正丁醇溶剂将浓缩和干燥工序(ii)中得到的硫酸化C-糖苷的干燥物质液液分配，通过化学分离精制法将其水层部分进行精制。

(5)一种硫酸化C-糖苷的合成方法，该合成方法为合成上述(1)或(2)所述的硫酸化C-糖苷的方法，其特征在于，该合成方法包括使下述通式(A0)或(B0)表示的黄酮C-糖苷与硫酸基引入剂反应，使该黄酮C-糖苷硫酸化的工序，

[化学式6]

(上述通式(A0)和(B0)中，R₁、R₂和R₃各自独立地表示氢原子或OH基。)

(6)根据上述(5)所述的硫酸化C-糖苷的合成方法，其中，所述硫酸基引入剂为选自由吡啶-SO₃络合物、硫酸？双环己基(替)碳化二亚胺 (DCC)、以及三乙胺-SO₃络合物组成的组的硫酸基引入剂。

(7)一种茶呋塞米及其类似物的制备方法，该制备方法为制备下述通式(A2)或(B2)所示的茶呋塞米及其类似物的方法，其特征在于，该制备方法包括在130-190℃下加热上述(1)或(2)所述的硫酸化C-糖苷的工序，

[化学式7]

(上述通式(A2)和(B2)中，R₁、R₂和R₃各自独立地表示氢原子或OH基。)

在本发明中，能够分离新型的硫酸化C-糖苷(异牡荆素和牡荆素的硫酸化物)作为茶呋塞米A和B的前体。并且，由于两化合物为新型化合物，利用各种的物理化学数据，通过推定、合成确定了其结构。

由此，明确了茶呋塞米A和B可以分别地由茶叶中的异牡荆素和牡荆素的硫酸化物制备。并且，在本发明的发明人所知道的范围内，至今还没有发现黄酮糖苷以及黄酮C-糖苷的硫酸化物，是在本发明中首次发现的。

通过加热分别由茶呋塞米A和B的两前体生成茶呋塞米A和茶呋塞米B。报告显示：茶呋塞米A和茶呋塞米B显现抗炎作用，尤其前者的作用比市售的甾体制剂更好。

本发明中确认的仅是从茶呋塞米A的前体(异牡荆素2-硫酸盐)和茶呋塞米B的前体(牡荆素2-硫酸盐)分别生成茶呋塞米A和B，但是可推测具有与茶呋塞米A和B的两前体相同的部分结构的化合物可以变换成具有与茶呋塞米A和B相同的部分结构的化合物。另外，具有与茶呋塞米A和B相同的部分结构的这些化合物组也可期待良好的甾体样的抗炎症的生理活性。

本发明中的作为茶呋塞米及其类似物的前体的新型的化合物的硫酸化C-糖苷的发现，使含有大量茶呋塞米的茶品种或其它的食用材料的探索、由各种茶叶或其它的食用材料制备食品的过程中茶呋塞米含量的控制、以及大量含有茶呋塞米的茶或其它的食品的制备成为可能，其意义重大。

本发明的硫酸化C-糖苷在固态下通过加热容易发生伴随着立体异构(立体反転)的环化反应。因此，根据本发明，能够通过异牡荆素和牡荆素等的黄酮C-糖苷经过硫酸化C-糖苷合成茶呋塞米及其类似物，能够提供廉价的茶呋塞米及其类似物的合成方法。根据本发明的方法，使用廉价且安全的起始物质或试剂，并且无论是否是比较稳定的反应条件，均能高收率地生成茶呋塞米及其类似物，因此，通过按比例放大能够在工业上生产，在产业上极其适用。

考虑到代谢中的硫酸化与解毒的排泄机制相关联，硫酸化物的茶呋塞米前体在茶叶中存在，其意义重大。关于异牡荆素和牡荆素，它们的抗癌作用、减轻紫外线照射引起的损伤的效果、COX抑制作用、抗氧化效果、抗焦虑效果等最近倍受关注。本发明中的新型化合物茶呋塞米前体是硫酸化物，因为容易水解，所以与极难溶于水的异牡荆素和牡荆素相比，容易向人体转移，对于其在体内的动态以及生理活性可期待与异牡荆素和牡荆素相同的药理作用，作为更高效且安全性良好的来自天然的新型抗炎剂等利用的可能性很高。

另外，由于在大多市售红茶中茶呋塞米前体的含量很少，所以对茶制备的发酵中的氧化酶反应中的茶呋塞米前体如何进行代谢变化产生了兴趣。

附图说明

图1为表示茶呋塞米前体的分离工序的一例子的流程图。

具体实施方式

以下对本发明的实施方式进行说明。

(1)硫酸化C-糖苷

本发明的硫酸化C-糖苷为新型化合物，为具有下述通式(A1)或(B1)表示的黄酮骨架的黄酮C-糖苷的硫酸化物。

[化学式8]

在此，上述通式(A1)和(B1)中，R₁、R₂和R₃各自独立地表示氢原子或OH基。优选R₁为OH基，R₁和R₂各自为氢原子。

作为上述通式(A1)或(B1)表示的化合物的具体例子，可以举出下述式所示的A1-1、A1-2、A1-3、A1-4、B1-1、B1-2、B1-3以及B1-4。(式中，R、R₁和R₂各自与上述通式(A1)和(B1)中的意义相同。)

[化学式9]

上述通式(A1)表示的化合物中特别优选的为茶呋塞米前体A(prechafuroside A)(上述化合物A1-2)，该化合物为异牡荆素的硫酸化物(Isovitexin 2”-sulfate)。通式(B1)表示的化合物中特别优选的为茶呋塞米前体B(prechafuroside B)(上述化合物B1-2)，该化合物为牡荆素的硫酸化物(Vitexin 2”-sulfate)。

(2)茶叶中的硫酸化C-糖苷的分离方法

本发明的上述通式(A1)或(B1)表示的硫酸化C-糖苷可以使用水、低级醇溶剂或它们的混合物从含有该硫酸化C-糖苷的茶叶或茶垢中提取来分离。即，本发明的硫酸化C-糖苷的分离方法的特征在于，该分离方法包括使用水、碳原子数1-3的低级醇溶剂或它们的混合液从含有所述硫酸化C-糖苷的茶叶或茶垢中提取该硫酸化C-糖苷的工序。

分离的具体步骤没有特别的限定，优选以包括以下的工序(i)～(iii)的方法进行。

(i)提取工序：使用水、碳原子数1-3的低级醇溶剂或它们的混合液对含有所述硫酸化C-糖苷的生茶叶、茶叶或茶垢的粉碎物进行提取，得到含有该硫酸化C-糖苷的提取液；

(iii)精制工序：使用水和正丁醇溶剂将浓缩和干燥工序(ii)中得到的含有硫酸化C-糖苷的干燥物质液液分配，通过化学分离精制法将其中的水层部分进行精制。

在所述提取工序(i)中使用的含有硫酸化C-糖苷的茶叶或茶垢的粉碎物中，作为茶叶可以举出例如生茶叶、绿茶用茶叶、烘焙茶用茶叶、红茶用茶叶、乌龙茶等，特别优选的为生茶叶、未强烈加热的绿茶用茶叶或乌龙茶茶叶。另外，在含有硫酸化C-糖苷的茶垢中，作为茶垢，可以使用在绿茶的制备过程中，来自主要是芽的部分等茶叶的比较嫩的部分的茶粉或其固化的物质。这些茶叶或茶垢的粉碎方法没有特别的限制。

作为所述提取工序(i)中使用的碳原子数1-3的低级醇溶剂，可举出甲醇、乙醇、丙醇等，优选为甲醇。在使用水和甲醇进行提取的情况下，更具体地，将含有硫酸化C-糖苷的茶叶或茶垢粉碎并分散在水中，使用所述水的5-20倍体积(优选为5-15倍体积)的40-60重量％(优选为45-55重量％)的甲醇水溶液在5-70℃下对所述茶叶或茶垢粉末进行5-30分钟的提取操作，得到含有硫酸化C-糖苷的提取液。

在所述浓缩和干燥工序(ii)中，特别优选将提取工序(i)中得到的提取液在减压下(优选为10-500mmHg的减压下)加热到充分的温度(优选为比该提取液的沸点高20℃以上的温度)，使提取液的溶剂蒸发并浓缩，进而在该浓缩温度下持续加热，实质性除去溶剂，使溶解在提取液中的物质干燥，得到含有硫酸化C-糖苷的干燥物质。

在所述精制工序(iii)中，将浓缩和干燥工序(ii)中得到的含有硫酸化C-糖苷的干燥物质使用水和正丁醇溶剂进行液液分配，通过化学分离精制中使用的方法将其中的水层部分进行精制。作为化学分离精制法，可以举出薄层色谱法、吸附色谱法、分配色谱法、凝胶过滤色谱法、离子交换色谱法、高效液相色谱法(高速液体クロマトグラフイ一)(HPCL)、电泳法等。

所述硫酸化C-糖苷与异牡荆素和牡荆素不同，由于硫酸基的存在，是水溶性高的强极性的物质。因此，在水和正丁醇溶剂的液液分配中，异牡荆素、牡荆素以及茶呋塞米向正丁醇溶剂层中转移，与此相对，所述硫酸化C-糖苷包含在水层部分中。

更具体地，在所述精制工序(iii)中，将液液分配后的水层部分通过合成吸附剂等，然后用水充分洗涤后，用10-60％甲醇(优选为30％甲醇)将吸附部分洗脱，通过凝胶过滤或硅胶柱色谱法等的方法分离，将各洗脱部分在140-190℃下加热处理5-180分钟(更优选在160℃下加热处理40分钟)后，通过LC-MS/MS分析求出生成的茶呋塞米的量，仅将生成量最高的成分供给利用HPLC法的精制过程中。

吸附色谱法可以使用商品名为“Diaion SP825”(三菱化学(株)制)、Diaion SP207(三菱化学(株)制)、安博莱特(アンバ一ライト)XAD(オルガノ(株))、色谱用硅胶(和光纯药社制、メルク社制)等。

凝胶过滤可以使用商品名为“Sephadex LH-20”(フアルマシア社制)、Bio Gel P-2等的凝胶过滤色谱仪。

作为LC-MS/MS分析法，能够使用利用了甲醇水溶液或乙腈水溶液的HPLC-MS/MS分析法。另外所述HPLC-MS/MS分析法中，例如能够使用“Cadenza CD C18的HPLC-MS/MS分析法”，该分析法使用インタクト社制的C18色谱柱，并使用特定的溶剂。

所述的甲醇水溶液或乙腈水溶液是20-80重量％的甲醇水溶液，或者10-60重量％的乙腈水溶液，特别是在HPLC-MS/MS分析法中，在茶叶或利用茶叶在分离过程中得到的成分经加热处理后，以高精度对其中所含的茶呋塞米或其类似物进行定量，因而更优选。

(3)由黄酮C-糖苷合成硫酸化C-糖苷的方法

本发明的硫酸化C-糖苷可以通过由下述通式(A0)或(B0)表示的黄酮C-糖苷合成而得到。在此，在下述通式(A0)和(B0)中，R₁、R₂和R₃各自独立地表示氢原子或OH基。

[化学式10]

作为上述通式(A0)或(B0)表示的黄酮C-糖苷，可以举出下述式所示的A0-1、A0-2、A0-3、A0-4、B0-1、B0-2、B0-3以及B0-4。(式中，R、R₁和R₂分别与上述通式(A1)和(B1)中的意义相同。)

[化学式11]

上述通式(A0)表示的化合物中特别优选的为异牡荆素(上述化合物(A0-2))。通式(B0)表示的化合物中特别优选的为牡荆素(上述化合物(B0-2))。

本发明的硫酸化C-糖苷的合成方法的特征在于，该方法包括使上述通式(A0)或(B0)表示的黄酮C-糖苷与硫酸引入剂反应，将该黄酮C-糖苷硫酸化的工序。在合成茶呋塞米前体A时，使用异牡荆素作为黄酮C-糖苷，在合成茶呋塞米前体B时，使用牡荆素作为黄酮C-糖苷。

作为此处可使用的硫酸基引入剂没有特别的限定，可举出选自由吡啶-SO₃络合物(Pyridine-SO₃(1∶1)complex)、硫酸-DCC、以及三乙胺-SO₃络合物组成的组的硫酸基引入剂。

上述合成方法中，对于由异牡荆素和牡荆素分别合成茶呋塞米前体A和B的方法，更具体地讲，在第一阶段中，预先将异牡荆素或牡荆素的4位和5位的羟基保护。保护基的引入例如可以使用苯甲醛二甲缩醛-PPTS、苯甲醛-氯化锌等。

接着，使4位和5位引入保护基的所述化合物与硫酸基引入剂反应，在期望的2位上引入硫酸基。此时的反应温度优选为20-80℃，更优选为30-40℃，反应时间为0.5-8小时，更优选为2-4小时。

将这样得到的、异牡荆素或牡荆素的4位和5位的羟基被保护的、2“或 3”位被硫酸化的异牡荆素或牡荆素衍生物用阳离子交换树脂(IR-120)、40％乙酸等水解处理以除去4位和5位的羟基的保护基后，通过使用了Sep-PackC18的分配柱色谱、使用了ODS-C18柱的HPLC、凝胶过滤等能够分离期望的茶呋塞米前体。

(4)茶呋塞米及其类似物的制备方法

本发明的茶呋塞米及其类似物的制备方法的特征在于，该制备方法包括将所述硫酸化C-糖苷在140-190℃下、优选为150-180℃下加热的工序。通过加热硫酸化C-糖苷，可认为经过过渡状态进行分子内环化反应，生成茶呋塞米及其类似物。对于该化学反应式，由茶呋塞米前体A(异牡荆素2”-硫酸盐)制备茶呋塞米A，以及由茶呋塞米B(牡荆素2”-硫酸盐)制备茶呋塞米B的化学反应的例子如下所示。

[化学式12]

所述硫酸化C-糖苷中，由通式(A1)表示的硫酸化C-糖苷可以得到下述通式(A2)表示的茶呋塞米及其类似物。由通式(B1)表示的硫酸化C-糖苷可以得到下述通式(B2)表示的茶呋塞米及其类似物。在此，下述通式 (A2)和(B2)中，R、R₁和R₂分别与上述通式(A1)和(B 1)中的意义相同。

[化学式13]

更具体地，所述硫酸化C-糖苷中，由下述通式(A1-1)和(B1-1)表示的硫酸化C-糖苷可以分别得到下述通式(A2-1)和(B2-1)表示的茶呋塞米的类似物。由通式(A1-2)和(B1-2)表示的茶呋塞米前体A和B可以分别得到下述通式(A2-2)和(B2-2)表示的茶呋塞米A和B。由通式(A1-3)和(B1-3)表示的硫酸化C-糖苷可以分别得到下述通式(A2-3)和(B2-3)表示的茶呋塞米的类似物。由通式(A1-4)和(B1-4)表示的硫酸化C-糖苷可以分别得到下述通式(A2-4)和(B2-4)表示的茶呋塞米的类似物。

[化学式14]

实施例

以下通过列举实施例对本发明进行具体地说明，但是本发明并不仅限于这些实施例。

<实施例1>

在本实施例1中通过以下的方法对各种茶叶中所含的茶呋塞米A和茶呋塞米B的含量进行了分析。首先，以新西兰产的牡荆(Vitex lucens)为原料，从由其配制的异牡荆素和牡荆素通过光延反应分别合成茶呋塞米A和B，使用它们制作茶呋塞米分析用的校准曲线(検量線)，以其为基准进行各种茶叶中的茶呋塞米A和B的定量分析。

(1)试剂

合成中使用的试剂、溶剂全部使用和光纯药制特级试剂。作为分配型分离剂使用Waters公司的商品名“Sep-Pack C18 Cartridge”中填充的“ODS C18”。凝胶过滤使用商品名为“Sephadex LH 20”(フアルマシア社制)、作为吸附分离剂使用商品名为“Diaion SP825”(三菱化学(株)制)。分离用HPLC柱使用商品名为“Cadenza CD-C18”(インタクト(株)制)。

(2)原料

实验用茶叶使用以下品种的茶叶。

绿茶；静7132、北丛林(藪北)、狭山香(さやまかおり)

烘焙茶；静7132、北丛林

乌龙茶；静7132、水仙、铁观音

红茶；静7132、阿萨姆(アツサム)、大吉岭(ダ一ジリン)

并且，由静7132制备的绿茶、乌龙茶、以及红茶为居住在静冈县岛田市的制茶专家制作的茶。

在将茶叶用磨咖啡机粉碎后，取0.2g在50％甲醇(2ml)中、搅拌下、在90℃下进行20分钟茶叶的提取。并且，重复该操作2次。提取液在减压下浓缩干燥，溶解到水(1ml)中后，将使用正丁醇(1ml×2)提取得到的正丁醇层部分在减压下浓缩干燥后，溶解到30％-CH₃CN(0.5ml)中，作为分析用样品。

(3)测定及分析的方法

NMR测定使用商品名为“JNM-ECA 500”(日本电子社制)，LC-MS/MS分析同时使用商品名为“Agilent 1100”以及“API 2000”(Applied Bio社制)，QTOF-MS测定使用商品名为“QSTAR”(Applied Bio社制)，UV测定使用商品名为“U3900”((株)日立制作所制)，加热使用微型蒸馏用加热恒温槽(Buchi社制)。

(4)茶呋塞米A和B、以及异牡荆素和牡荆素的分析

由事先合成的茶呋塞米A和B、以及异牡荆素和牡荆素分别配制 0.2ng/ml、1.0ng/ml、10ng/ml、100ng/ml以及1000ng/ml的标准溶液。使用这些各标准溶液，柱使用商品名为“Cadenza CD-C18”(3×150mm)，展开洗脱(溶出展開)使用15-50％H₂O-CH₃CN的混合溶剂、耗时20分钟的梯度法。

使用各浓度的标准溶液10μl得到的色谱，通过色谱的各化合物的峰面积绘制校准曲线，以其为基准以使用了ESI法的PLC-MS/MS法进行定量分析。MS/MS条件如下所示。

[表1]

ESI的茶呋塞米A和B、牡荆素和异牡荆素的设定参数

(5)结果和考察

通过HPLC-MS/MS法对上述各品种的茶叶中所含的茶呋塞米A、茶呋塞米B、异牡荆素、以及牡荆素的量进行分析的结果如下述表2所示。并且，表中所示的含量的单位为“ng/g”。

[表2]

商品茶叶中茶呋塞米A的含量

	茶呋塞米A	茶呋塞米B	牡荆素	异牡荆素
					绿茶静7132	51.6±4.0	41.9±6.7	102114.7±2036.1	88394.5±6935.7
绿茶北丛林	37.8±0.2	23.5±0.5	96440.7±18935.6	89432.7±18769.9
					绿茶狭山香	34.0±0.8	23.9±1.3	48026.3±1248.2	41567.5±176.7
烘焙茶静7132	4980.4±168.0	3649.5±349.3	57064.0±34272.0	64472.4±36660.2
					烘焙茶北丛林-1	1977.3±147.1	2067.0±102.1	64522.4±813.9	60946.1±488.6
烘焙茶北丛林-2	3143.5±344.3	2988.4±302.1	44535.4±414.8	5143.5±4436.3
					乌龙茶静7132	50.4±0.3	38.7±1.9	56697.0±1206.0	52623.9±286.4
乌龙茶水仙	8575.2±764.1	7957.8±362.2	32342.4±1977.4	28793.6±710.2
					乌龙茶铁观音	1693.7±173.9	1143.3±159.1	41754.9±2696.7	40207.5±2597.7
红茶静7132	78.2±1.9	53.1±2.3	55584.1±2889.9	49888.0±2255.1
					红茶阿萨姆	18.2±1.9	23.1±2.3	22584.1±2889.9	19888.0±2255.1
红茶大吉岭	97.6±39.5	72.5±9.2	20640±2410.0	19002.9±2204.1

n＝3，平均值±S.E.

对于全部上述各品种的茶叶，均检测出异牡荆素和牡荆素，以及茶呋塞米A和茶呋塞米B。相对于1克茶叶，异牡荆素和牡荆素的含量为数十至100μg，以平均值计，其含量按照绿茶、烘焙茶、乌龙茶、红茶的顺序增多，各茶以及品种间没有大的差异。

另一方面，确认了茶呋塞米A和B在茶之间存在较大差异。相对于1克茶叶，绿茶和红茶中的含量为数十ng，品种之间几乎没有差别。与此相比，除了由静7132制备的乌龙茶以外，在焙烧茶和乌龙茶中茶呋塞米A和B的含量存在差异，相对于1克茶叶，茶呋塞米A和B的含量为数μg，与绿茶和红茶相比，其含量明显高。在焙烧茶中，品种间不存在显著差异，在乌龙茶中存在较大差别。

绿茶是在将新鲜嫩叶蒸煮后，迅速冷却，80℃下边加热边散发水，同时用手搓卷进行干燥、制茶。红茶是花费约8小时使嫩叶柔软，除去其水分，然后用手揉捻数小时进行氧化发酵，接着用90℃的热风在短时间内干燥来制备的。乌龙茶是将成熟的叶子在2-3小时的日光浴下揉捻，在室内、竹筛(タケカゴ)上筛动同时进行中等程度的发酵，然后利用160-260℃的热风在短时间内使酶失活，最终在90℃下干燥来制备。焙烧茶是将绿茶在160-200℃下进行短时间煎焙来制备。

确认室温下乌龙茶中含量多的茶叶存在强烈的入火煎焙的痕迹，而由静7132制得的乌龙茶中没有该痕迹。另外，确认由同类的相同茶叶制得的绿茶经烘焙含量显著提高。

从以上可推测，茶呋塞米A和茶呋塞米B的生成要素之一是160℃以上的高温加热。

并且，没有发现各品种的茶叶中的茶呋塞米A和茶呋塞米B的含量与异牡荆素和牡荆素的量之间的相关性。

(6)生成因素的最优化

将由静7132制得的乌龙茶在120、140、160、180以及200℃下加热40分钟后，求出各茶叶中的茶呋塞米A和B的含量，得到如表3所示的结果。另外，表中所示的含量的单位为“ng/g”。

[表3]

由静7132制得的乌龙茶加热后茶叶中茶呋塞米A和B的含量

温度(℃)	140	160	180	200
					茶呋塞米A	280.4±16.0	8649.5±249.3	7764.0±272.0	72.4±10.2
茶呋塞米B	256.3±14.3	7259.2±203.5	7436.8±254.7	68.9±8.8

n＝3，平均值±S.E.

另外，求出在加热温度160℃下加热20、40、60以及80分钟后的各茶叶中的茶呋塞米A和B的含量，得到表4所示的结果。另外，表中所示的含量的单位为“ng/g”。

[表4]

由静7132制得的乌龙茶在160℃下加热后茶叶中茶呋塞米A和B的含量

时间(min)	20	40	60	80
					茶呋塞米A	3480.4±216.0	7658.5±449.3	8794.0±272.0	8872.4±310.2
茶呋塞米B	3244.7±224.5	6954.4±409.7	7577.5±244.3	7994.5±298.9

n＝3，平均值±S.E.

从以上结果可以判断，茶叶制备中的茶呋塞米A和B通过加热生成，本茶叶中加热的最适宜温度为160-180℃的范围。过高时出现分解。另外，160℃加热约40分钟的时间，茶呋塞米A和B的生成量极大，即便施加更长时间的加热生成量也不会增加，基本保持恒定。

另外，在最适宜温度和最适宜时间对各品种的绿茶、乌龙茶、以及红茶进行加热处理时，绿茶和乌龙茶以及特定的红茶中，茶呋塞米A和B的含量显著增加，平均为15μg/g(茶叶)左右。但是，市售的普通红茶中其量显著增加，但平均为数μg/g(茶叶)左右。由此，显示出制茶过程中的氧化发酵处理对于茶呋塞米A和B的生成也非常重要。

<实施例2>

在本实施例中，进行茶呋塞米前体的分离和精制、以及结构确定。

如上所述，茶呋塞米A和B通过三苯基膦和偶氮二羧酸二乙酯与异牡荆素和牡荆素作用的光延反应而生成。在此，对于最初的前体的提取与其性状进行了如下的研究。

(1)茶呋塞米前体的分离和精制

将由静7132制得的乌龙茶茶叶(1g)粉碎，在回流下用甲醇、50％-甲醇以及水(1ml)提取，将提取液在减压下浓缩干燥后，分散到水(0.4ml)中，用正丁醇(4ml和1ml)提取。将各提取物、从各提取物通过液液分配得到的水层部分和正丁醇层部分在160℃下加热40分钟。

其结果只在各提取物及其水层部分中确认到加热生成的茶呋塞米A和B。另外，异牡荆素和牡荆素在水和正丁醇的液液分配中转移到正丁醇层。由此，茶呋塞米A和B的前体与异牡荆素和牡荆素不同，由此可知其为水溶性高的强极性的物质。

基于以上结果，前体的分离通过以下方法实施：将各分离阶段得到的成分干燥后，在160℃下加热处理40分钟后，供给到茶呋塞米A和B的LC-MS/MS分析，仅将茶呋塞米A或B的生成量最高的成分供给到接下来的分离中。这样确立的前体的分离工序的一例子如图1(流程图)所示。

将由静7132制得的乌龙茶茶叶(1Kg)粉碎，在回流下用甲醇(10L)提取。将得到的提取液在减压下浓缩干燥后，将提取物(348g)分散到水(4L)中，用正丁醇(4L和1L)提取。将水层部分(142g)溶解到水(3L)中，在“Diaion SP825”(2.4L)中使用，用水(3L)洗涤后，用30％甲醇(8L)洗脱。将30％甲醇洗脱部分(248g)通过使用甲醇展开的使用“Sephadex LH-20”(12L)的凝胶过滤进行分离。

将Kd＝2.1-2.8的洗脱部分(1.97g)通过使用20％乙腈溶液展开的“ODS-C18”(400mL)柱色谱法，得到含有茶呋塞米A和B的前体的粗成分(分别为87mg和63mg)。

最终通过使用“Cadenza CD-C18”柱和0.05％HCO₂H-CH₃CN(82∶18)的HPLC法精制，得到茶呋塞米前体(prechafuroside)A、以及茶呋塞米前体B(分别为5mg和4mg)。

这样，根据本发明，能够将水层部分吸附到强碱性的离子交换树脂上，通过使用“Sephadex LH-20”(12L)的凝胶过滤、使用20％乙腈溶液展开的 “ODS-C18”(400mL)柱色谱法、使用“Cadenza CD-C18”柱和0.05％HCO₂H-CH₃CN(82∶18)的HPLC法等对吸附部分进行精制。

(2)茶呋塞米前体的结构确定

利用通过负离子模式(Negative mode)的QTOF-MS分析求出的茶呋塞米前体A和B两化合物的精确分子量(茶呋塞米前体(prechafuroside)A：m/z 511.05612(M-H)^-与茶呋塞米前体B：m/z 511.05643(M-H)^-)和¹³C-NMR数据(参照下述表5)，确定两化合物的分子式为“C₂₁H₂₀O₁₃S”(C₂₁H₂₀O₁₃S-H计算为511.05625)。

发现茶呋塞米前体A在其UV光谱中，在与异牡荆素相同的波长330nm(ε40200)和284nm(ε64200)处有最大吸收，另外，茶呋塞米前体B在牡荆素的最大吸收波长325nm(ε44100)和285nm(ε62200)处有最大吸收。另外，通过利用吡啶和二噁烷(1∶1)进行的水解处理从茶呋塞米前体A大致定量生成异牡荆素，另外，从茶呋塞米前体B大致定量生成牡荆素。

如表5所示的茶呋塞米前体A和B以及异牡荆素和牡荆素的¹³C-NMR数据可明确，茶呋塞米前体A和异牡荆素之间、以及茶呋塞米前体B和牡荆素两者之间的各碳原子的化学位移值，除了C-2”，都没有确认到明显的不同。

并且，通过茶呋塞米前体A和异牡荆素、以及茶呋塞米前体B和牡荆素之间的C-2”碳原子的化学位移值的差、低磁场位移值强烈地暗示出茶呋塞米前体A和茶呋塞米前体B分别为异牡荆素和牡荆素的C-2”位的羟基被硫酸化的化合物。

[表5]

表5

(茶呋塞米前体A、异牡荆素、茶呋塞米前体B和牡荆素在DMSO-d₆的¹³C-NMR数据(ppm))

赋值基于¹H-¹H-COSY、¹H-¹³C-COSY和HMBC实验。

从这些结果可以得出，茶呋塞米前体A和B的结构分别为下述化学式所示的“异牡荆素2”-O-硫酸盐”和“牡荆素2”-O-硫酸盐”。下述化学式中，左边为“异牡荆素2”-O-硫酸盐”，右边为“牡荆素2”-O-硫酸盐”。

[化学式15]

通过QTOF-MS/MS的测定，茶呋塞米前体A分别得到能够归属于相当于[异牡荆素-H]的C₂₁H₁₉O₁₀的碎片离子(m/z 431.1040(C₂₁H₁₉O₁₀计算为431.0978))以及相当于OSO₃H的碎片离子(m/z 96.9618(HSO₄计算为96.9601))；另外，茶呋塞米前体B也分别得到相当于[牡荆素-H]的C₂₁H₁₉O₁₀的碎片离子(m/z 431.1040(C₂₁H₁₉O₁₀计算为431.0978))以及相当于OSO₃H的碎片离子(m/z 96.9604(HSO₄计算为96.9601))，很好地支持了这些结构(参照下述化学式)。另外，由于以下所述的合成法得到的推定的化合物与由乌龙茶得到的茶呋塞米前体的物理科学上的数据完全一致，因而可以确定它们分别为“异牡荆素2”-O-硫酸盐”和“牡荆素2”-O-硫酸盐”。

[化学式16]

图茶呋塞米A和B的碎片

已知在硫酸化糖或胆汁醇的侧链的羟基被硫酸化的化合物中，通过强碱处理，临近的OH变为亲核试剂O^-，其结果引发SN₂型的置换反应，进行分子内环化。

茶呋塞米前体A和B通过加热分别地经过下述化学式所示的过渡状态，进行分子内环化而生成茶呋塞米A和茶呋塞米B，很好地说明了加热引起的从茶呋塞米前体A和B向茶呋塞米A和B的转换。

[化学式17]

从茶呋塞米前体A和B形成茶呋塞米A和B的机理

<实施例3>

在本实施例中由异牡荆素合成茶呋塞米前体A。

(1)保护了异牡荆素的4位和5位的羟基的化合物的合成

在丙酮(DMF)中，在催化剂量的PPTS(吡啶-对甲苯硫酸络合物(Pyridine-p-Toluenesulfuric acid complex))的存在下，使2当量的苯甲醛二甲缩醛与异牡荆素在50℃下作用2小时，合成保护了异牡荆素的4位和5位的羟基的“化合物A”(Mw(分子量)＝520)(收率：100％)。

(2)化合物A的2”-硫酸盐(化合物B)的合成

将所述化合物A溶解到吡啶(Pyridine)后，加入1.5当量的吡啶-SO₃(1∶1)络合物在50℃下作用2小时，合成所述化合物A的2”-硫酸盐(以下称为“化合物B”)(Mw＝600)(收率：约50％)。该方法生成与化合物B相同量的化合物A的3”-硫酸盐。

(3)异牡荆素的2”-硫酸盐(Isovitexin 2”-sulfate)的合成

向溶解到20％甲醇中的化合物B中加入酸性类型的阳离子交换树脂(商品名“Amberlite IR-120(H+)”，(ロ一ム&ハ一ス社制))，使pH为3，在50℃、搅拌下加热约1小时，得到异牡荆素的2”-硫酸盐(收率：100％)。它们的化学反应用以下的化学式表示。

[化学式18]

(4)将得到的异牡荆素的2”-硫酸盐与上述实施例2中从茶叶中提取的物质直接进行结构比较，确认为上述茶呋塞米前体A。另外，将该异牡荆素的2”-硫酸盐在约160-170℃下加热后，以收率约85％生成茶呋塞米A。

<实施例4>

在本实施例中由牡荆素合成茶呋塞米前体B。

(1)保护了牡荆素的4位和5位的羟基的化合物的合成

在丙酮(DMF)中，在催化剂量的PPTS(吡啶-对甲苯硫酸络合物)的存在下，使2当量的苯甲醛二甲缩醛与牡荆素在50℃下作用2小时，合成保护了牡荆素的4位和5位的羟基的“化合物C”(Mw(分子量)＝520)(收率：100％)。

(2)化合物C的2”-硫酸盐(化合物D)的合成

将所述化合物C溶解到吡啶(Pyridine)后，加入1.5当量的吡啶-SO₃(1∶1)络合物在50℃下作用2小时，合成所述化合物C的2”-硫酸盐(以下称为“化合物D”)(Mw＝600)(收率：约50％)。该方法生成与化合物D相同量的化合物C的3”-硫酸盐。

(3)牡荆素的2”-硫酸盐(Vitexin 2”-sulfate)的合成

向溶解到20％甲醇中的化合物D中加入酸性类型的阳离子交换树脂(商品名“Amberlite IR-120(H+)”，(ロ一ム&ハ一ス社制))，使pH为3，在50℃、搅拌下加热约1小时，得到牡荆素的2”-硫酸盐(收率：100％)。它们的化学反应用以下的化学式表示。

[化学式19]

(4)将得到的牡荆素的2”-硫酸盐与上述实施例2中从茶叶中提取的物质直接进行结构比较，确认为上述茶呋塞米前体B。另外，将该牡荆素的2”-硫酸盐在约160-170℃下加热后，以收率约85％生成茶呋塞米B。

工业实用性

本发明发现的作为新型化合物的茶呋塞米前体(茶呋塞米前体A和B)自身可期待发挥抗氧化作用、抗过敏作用、抗炎作用、抑制癌症作用等良好的药理作用，并且，由于引入了硫酸基，是水溶性高的、与机体的亲和性良好的化合物。并且，使用该茶呋塞米前体时，能够以极其高的收率来制备具有已知相关药效成分的茶呋塞米A和B。

因此，根据本发明，使用廉价且安全的起始物质或试剂，并且无论是否是比较稳定的反应条件，均能高收率地生成茶呋塞米，因此，通过按比例放大能够在工业上生产，在产业上极其适用。

Claims

1.一种下述通式(A1)或(B1)表示的硫酸化C-糖苷，

[化学式1]

上述通式(A1)和(B 1)中，R₁、R₂和R₃各自独立地表示氢原子或OH基。

2.根据权利要求1所述的硫酸化C-糖苷，其中，所述硫酸化C-糖苷为下述式(A1-2)表示的异牡荆素的硫酸化物或下述通式(B1-2)表示的牡荆素的硫酸化物

[化学式2]

3.一种硫酸化C-糖苷的分离方法，该方法为分离权利要求1或2所述的硫酸化C-糖苷的方法，其特征在于，该分离方法包括使用水、碳原子数1-3的低级醇溶剂或它们的混合液从含有所述硫酸化C-糖苷的茶叶或茶垢中提取该硫酸化C-糖苷的工序。

4.根据权利要求3所述的硫酸化C-糖苷的分离方法，其中，该分离方法包括以下的工序(i)、(ii)以及(iii)：

(iii)精制工序：使用水和正丁醇溶剂将浓缩和干燥工序(ii)中得到的硫酸化C-糖苷的干燥物质液液分配，通过化学分离精制法将其中的水层部分进行精制。

5.一种硫酸化C-糖苷的合成方法，该合成方法为合成权利要求1或2所述的硫酸化C-糖苷的方法，其特征在于，该合成方法包括使下述通式(A0)或(B0)表示的黄酮C-糖苷与硫酸基引入剂反应，使该黄酮C-糖苷硫酸化的工序，

[化学式3]

上述通式(A0)和(B0)中，R₁、R₂和R₃各自独立地表示氢原子或OH基。

6.权利要求5所述的硫酸化C-糖苷的合成方法，其中，所述硫酸基引入剂为选自由吡啶-SO₃络合物、硫酸？双环己基(替)碳化二亚胺、以及三乙胺-SO₃络合物组成的组的硫酸基引入剂。

7.一种茶呋塞米及其类似物的制备方法，该制备方法为制备下述通式(A2)或(B2)所示的茶呋塞米及其类似物的方法，其特征在于，该制备方法包括在130-190℃下加热权利要求1或2所述的硫酸化C-糖苷的工序，

[化学式4]

上述通式(A2)和(B2)中，R₁、R₂和R₃各自独立地表示氢原子或OH基。