JP5597142B2

JP5597142B2 - 硫酸化ｃ−配糖体及びその単離方法並びに合成方法

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Publication number: JP5597142B2
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Inventors: 均司石田
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Description

本発明は、新規化合物である硫酸化Ｃ−配糖体に関する。詳しくは、本発明は、ステロイド剤と同等又はそれ以上に優れた抗炎症作用等の生理活性が期待されるチャフロサイド及びその類縁体の前駆体である硫酸化Ｃ−配糖体、その茶葉からの単離方法、その新規な合成方法、及び該硫酸化Ｃ−配糖体からのチャフロサイド及びその類縁体の製造方法に関する。

チャフロサイド（chafuroside）は、フラボン誘導体の一種であるフラボンＣ配糖体（C-glycoside）であり、抗酸化作用、抗アレルギー作用、抗炎症作用、発癌抑制作用等を示すことが知られている。チャフロサイドは、ウーロン茶から単離される化合物であることが知られており、その構造式が決定されている。

上原らは、アトピー患者に対し、市販のウーロン茶を２倍に濃縮した濃厚溶液４００ｍｌを毎朝食と夕食後にその半量ずつ４週間飲用させ、該患者特有の日常的な皮膚炎症とそれに付随する強度のかゆみ発症を効果的に予防するか否かを調べる試験を行い、同ウーロン茶がこの試験参加のアトピー患者の６２％に有効であったとの知見を得た（非特許文献１参照）。

上記知見をもとに、糠谷らは2,4-dinitro-fluorobenzene誘発アトピーモデルに対する有効性を分離の指標に、同ウーロン茶からの有効成分の単離を試みた（特許文献１参照）。その結果、このウーロン茶用の茶葉約３．５ｋｇから経口投与で活性を示す二つの成分のそれぞれ約１ｍｇを得、構造式を決定し、新規物質であったことからチャフロサイドＡ（chafuroside A）とチャフロサイドＢ（chafuroside B）と命名した（特許文献１参照）。

それによれば、チャフロサイドＡとＢは、下記構造式でそれぞれＡ２−２とＢ２−２として表すことができる。

続いて、チャフロサイドＡとＢの生物活性について詳細な検討が加えられた。そして、2,4-dinitro-fluorobenzeneで誘発したアトピーモデルにおいて、チャフロサイドＡは市販のステロイド抗炎症剤Predonisolone (10mg/kg)及びbetamethasone (0.8mg/kg)よりも低用量の１０μｇ／ｋｇでそれらと同程度の、有意な皮膚炎症抑制活性を示すことが示された（特許文献１、非特許文献２参照）。
また、Ｍｉｎマウスのラット大腸におけるアゾキシメタン（ＡＯＭ）誘発腸管ポリープ形成に対してチャフロサイドＡは、インドメタシン（indomethacin）と同用量の２．５ｍｇ／ｋｇで効果的に抑制する作用を発揮することが確認された。そして、この効果はチャフロサイドＡがＣＯＸ−２に阻害的に作用するためと推察された。これらのこととその構造から、チャフロサイドＡは新しいタイプの抗炎症剤となる可能性が高い(特許文献２，非特許文献３参照)。

このように、チャフロサイドＡ及びＢは、現在最も有用な薬の一つステロイド抗炎症剤よりも優れた生理活性を示しその有用性が期待されていることから、従来それらを工業的に製造するための様々な方法が検討されている。例えば、既知のフラボンＣ配糖体であるイソビテキシン（isovitexin）とビテキシン（vitexin）からそれぞれ合成しようとする試みがなされており、そのなかでもイソビテキシンとビテキシンから以下の化学反応式に示すような光延反応を用いてチャフロサイドＡとＢを合成することが提案されている（特許文献２）。しかしながら、この方法は爆発の危険の高いアゾ試薬を用いるために、その工業化は極めて難しい。

また、上述した非特許文献２にも、チャフロサイドＡの新規な化学合成法が開示されているが、安全性が低いという欠点を有する(特許文献３、特許文献４、非特許文献２参照)。
上述したようなチャフロサイドＡ及びＢの構造、製法及び生理活性などから、チャフロサイドＡ及びＢのウーロン茶葉中における生成メカニズムには非常に興味が持たれているが、簡便かつ高収率で、しかも安全で安価な工業的生産方法は未だ確立されておらず、これらの化合物の高い有用性からすると、その効率よい生産方法の開発が強く望まれている。

特開２００４−０３５４７４号公報特開２００６−３４２１０３号公報特開２００５−３１４２６０号公報特開２００５−２８９８８８号公報

上原ら、皮膚科紀要９２、１４３−１４８（１９９７） T. Nakatsuka et al., Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 14(2004) 3201-3203 N. Niho et al., Cancer Science 97(2006) 248-251

本発明は、チャフロサイド及びその類縁体の前駆体として新規な化合物である硫酸化Ｃ−配糖体、及び該硫酸化Ｃ−配糖体の効率よい製造方法、並びにそれを用いたチャフロサイド及びその類縁体の効率よい製造方法を提供することを課題とする。

本発明者は、チャフロサイドＡとＢの生成要因について検討を加え、生成要因を特定することに成功した。そして、この成果をもとにチャフロサイドＡとＢの各前駆体を単離し、新規化合物であるそれらの両前駆体の構造を各種物理化学的データにより推定し、合成によって構造決定した。
さらに、これら前駆体を加熱処理することにより、容易かつ高収率にてそれぞれチャフロサイドＡとＢへ変換可能、すなわちこれら前駆体より極めて効率的にチャフロサイドＡとＢが得られることを見いだした。

また、下記一般式に示すように、チャフロサイドＡとＢ各前駆体の部分構造（ａ）（下記式中、左）を有する化合物は、それぞれチャフロサイドＡ及びＢと同じ部分構造（ｂ）（下記式中、右）を有する化合物に変換されると考えられることから、該部分構造（ａ）を有する他の化合物群からも同様にしてチャフロサイドＡ及びＢと同じ部分構造を有する化合物群が得られることが推定される。

本発明者は、上述したことを前提に、自然界又は合成的に製造可能な糖誘導体の２−sulfateからチャフロサイド及びその類縁化合物が誘導されることを見いだし、本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明は、以下に示す硫酸化Ｃ−配糖体、その単離方法及び合成方法、並びに該硫酸化Ｃ−配糖体からのチャフロサイド及びその類縁体の製造方法を提供するものである。
（１）下記一般式（Ａ１）又は（Ｂ１）で表される硫酸化Ｃ−配糖体。

（上記一般式（Ａ１）及び（Ｂ１）中、Ｒ₁、Ｒ₂及びＲ₃は各々独立して水素原子又はＯＨ基を表す。）

（２）前記硫酸化Ｃ−配糖体が、下記式（Ａ１−２）で表されるイソビテキシンの硫酸化体又は下記一般式（Ｂ１−２）で表されるビテキシンの硫酸化体であることを特徴とする、請求項１記載の硫酸化Ｃ−配糖体。

（３）（１）又は（２）記載の硫酸化Ｃ−配糖体を単離する方法であって、前記硫酸化Ｃ−配糖体を含有する茶葉又は茶渋から水、炭素数１〜３の低級アルコール溶剤又はそれらの混合液を用いて該硫酸化Ｃ−配糖体を抽出する工程を含むことを特徴とする、硫酸化Ｃ−配糖体の単離方法。

（４）以下の工程（イ）、（ロ）及び（ハ）を含むことを特徴とする、請求項３記載の硫酸化Ｃ−配糖体の単離方法。
（イ）前記硫酸化Ｃ−配糖体を含有する茶葉又は茶渋の粉砕物を、水、炭素数１〜３の低級アルコール溶剤又はそれらの混合液を用いて抽出し、該硫酸化Ｃ−配糖体を含む抽出液を得る抽出工程
（ロ）前記抽出工程（イ）で得られた抽出液を減圧下で加熱濃縮乾固させ、前記硫酸化Ｃ−配糖体を含む乾固物質を得る濃縮・乾固工程
（ハ）前記濃縮・乾固工程（ロ）で得られた硫酸化Ｃ−配糖体を含む乾固物質を、水及びｎ−ブタノール溶剤を用いて液液分配し、その水層部を化学分離精製法により精製する精製工程

（５）（１）又は（２）記載の硫酸化Ｃ−配糖体を合成する方法であって、下記一般式（Ａ０）又は（Ｂ０）で表されるフラボンＣ−配糖体と、ピリジン−ＳＯ _３錯体、硫酸−ＤＣＣ、及びトリエチルアミン−ＳＯ _３錯体からなる群から選択される硫酸基導入剤とを反応させ、該フラボンＣ−配糖体を硫酸化する工程を含むことを特徴とする、硫酸化Ｃ−配糖体の合成方法。

（上記一般式（Ａ０）及び（Ｂ０）中、Ｒ₁、Ｒ₂及びＲ₃は各々独立して水素原子又はＯＨ基を表す。）

（６）前記硫酸基導入剤が、ピリジン−ＳＯ_３錯体である、（５）記載の硫酸化Ｃ−配糖体の合成方法。

（上記一般式（Ａ２）及び（Ｂ２）中、Ｒ₁、Ｒ₂及びＲ₃は各々独立して水素原子又はＯＨ基を表す。）

本発明においては、チャフロサイドＡとＢの前駆体として、新規の硫酸化Ｃ−配糖体（イソビテキシンとビテキシンの硫酸化体）を単離することができた。そして、両化合物は新規化合物であったので、各種の物理化学的データにより、その構造を推定し、合成によって決定した。

これにより、チャフロサイドＡ及びＢは、茶葉中でそれぞれイソビテキシン及びビテキシンの硫酸化体から製造されることが判明した。なお、本発明者の知る限りでは、フラボン配糖体、及びフラボンＣ−配糖体の硫酸化体はこれまで見いだされておらず、本発明においてはじめて見いだされたものである。

チャフロサイドＡ及びＢの両前駆体それぞれから、加熱処理によってチャフロサイドＡとチャフロサイドＢが生成される。チャフロサイドＡとチャフロサイドＢは抗炎症作用を示し、特に前者の作用は市販ステロイド剤よりも優れていると報告されている。
本発明で確認されているのはチャフロサイドＡの前駆体（イソビテキシン２−sulfate）とチャフロサイドＢの前駆体（ビテキシン２−sulfate）からそれぞれチャフロサイドＡとＢが生成することのみであるが、チャフロサイドＡ及びＢの両前駆体と同じ部分構造を有する化合物は、チャフロサイドＡとＢと同じ部分構造を有する化合物に変換されることが推定される。また、チャフロサイドＡ及びＢと同じ部分構造を有するこれらの化合物群にも優れたステロイド様の抗炎症の生理活性が期待される。

本発明における、チャフロサイド及びその類縁体の前駆体として新規の化合物である硫酸化Ｃ−配糖体の発見は、これらによってチャフロサイドを多く含む茶品種や他の食用素材の探索、各種茶葉や他の食用素材からの食品の製造においてチャフロサイド含量のコントロール、及びそれを多く含む茶や他の食品の製造を可能とするものであり、その意義は高い。

本発明の硫酸化Ｃ−配糖体は、固相の状態で加熱により容易に立体反転を伴う環化反応を起こす。したがって、本発明によって、イソビテキシンとビテキシン等のフラボンＣ−配糖体より硫酸化Ｃ−配糖体を経てチャフロサイド及びその類縁体を合成し得る、安価なチャフロサイド及びその類縁体の合成法を提供することができる。本発明の方法によれば、安価で安全な出発物質や試薬を用い、且つ比較的穏やかな反応条件であるにもかかわらず、高収率でチャフロサイド及びその類縁体を生成することができるため、スケールアップにより工業的生産が可能であり、産業上極めて有用である。

代謝において硫酸化は解毒的排泄機構と関連づけられてきたことを考慮すると、茶葉中に硫酸化体であるチャフロサイド前駆体が存在することの意義は大きい。イソビテキシンとビテキシンについては、それらの抗ガン作用、ＵＶ照射によるダメージの軽減効果、ＣＯＸ抑制作用、抗酸化的な効果、抗不安効果等が最近注目されている。本発明の新規化合物であるチャフロサイド前駆体は硫酸化体で、水に解けやすいことから、水に極めて難溶なイソビテキシンとビテキシンに比し、人体への移行性が高く、その体内動態及び生理活性についてもイソビテキシン及びビテキシンと同様の薬理作用が期待され、より高効率でしかも安全性に優れた天然由来の新しいタイプの抗炎症剤などとして利用できる可能性が高い。

また、チャフロサイド前駆体の含量が多くの市販紅茶に少ないことから、茶製造の発酵における酸化的酵素反応でチャフロサイド前駆体がどのように代謝変換されるかにも興味がもたれる。

チャフロサイド前駆体の分離工程の一例を示すチャート図である。

以下に、本発明の実施の形態を説明する。
（１）硫酸化Ｃ−配糖体
本発明の硫酸化Ｃ−配糖体は新規化合物であり、下記一般式（Ａ１）又は（Ｂ１）で表されるフラボン骨格を有するフラボンＣ−配糖体の硫酸化体である。

ここで、上記一般式（Ａ１）及び（Ｂ１）中、Ｒ₁、Ｒ₂及びＲ₃は各々独立して水素原子又はＯＨ基を表す。好ましくは、Ｒ₁はＯＨ基であり、Ｒ₁及びＲ₂は各々水素原子である。

上記一般式（Ａ１）又は（Ｂ１）で表される化合物の具体例としては、下記式に示したＡ１−１、Ａ１−２、Ａ１−３、Ａ１−４、Ｂ１−１、Ｂ１−２、Ｂ１−３、及びＢ１−４が挙げられる。（式中、Ｒ、Ｒ₁及びＲ₂は、それぞれ上記一般式（Ａ１）及び（Ｂ１）におけるのと同義である。）

上記一般式（Ａ１）で表される化合物のうち特に好ましいものは、チャフロサイド前駆体Ａ（prechafuroside A）（上記化合物（A1-2））であり、このものはイソビテキシンの硫酸化体（Isovitexin 2"-sulfate）である。一般式（Ｂ１）で表される化合物のうち特に好ましいものはチャフロサイド前駆体Ｂ（prechafuroside B）（上記化合物（B1-2））であり、このものはビテキシンの硫酸化体（Vitexin 2"-sulfate）である。

（２）茶葉中の硫酸化Ｃ−配糖体の単離方法
本発明の上記一般式（Ａ１）又は（Ｂ１）で表される硫酸化Ｃ−配糖体は、該硫酸化Ｃ−配糖体を含有する茶葉又は茶渋から水、低級アルコール溶剤又はそれらの混合物を用いて抽出することにより単離することができる。すなわち、本発明の硫酸化Ｃ−配糖体の単離方法は、前記硫酸化Ｃ−配糖体を含有する茶葉又は茶渋から水、炭素数１〜３の低級アルコール溶剤又はそれらの混合液を用いて該硫酸化Ｃ−配糖体を抽出する工程を含むことを特徴とする。

単離の具体的な手順は特に限定されないが、好ましくは以下の工程（イ）〜（ハ）を含む方法で行われる。
（イ）前記硫酸化Ｃ−配糖体を含有する生茶葉、茶葉又は茶渋の粉砕物を、水、炭素数１〜３の低級アルコール溶剤又はそれらの混合液を用いて抽出し、該硫酸化Ｃ−配糖体を含む抽出液を得る抽出工程
（ロ）前記抽出工程（イ）で得られた抽出液を減圧下で加熱濃縮乾固させ、前記硫酸化Ｃ−配糖体を含む乾固物質を得る濃縮・乾固工程
（ハ）前記濃縮・乾固工程（ロ）で得られた硫酸化Ｃ−配糖体を含む乾固物質を、水及びｎ−ブタノール溶剤を用いて液液分配し、その水層部を化学分離精製法により精製する精製工程

前記抽出工程（イ）で用いられる硫酸化Ｃ−配糖体を含有する茶葉又は茶渋の粉砕物において、茶葉としては、例えば生茶葉、緑茶用茶葉、焙じ茶用茶葉、紅茶用茶葉、ウーロン茶などを挙げることができるが、特に好ましいものは、生茶葉、強く加熱していない緑茶用茶葉又はウーロン茶葉である。また、硫酸化Ｃ−配糖体を含有する茶渋において、渋茶としては、緑茶の製造工程において茶葉の主に芽の部分などの比較的もろい部分から出る粉茶あるいはこれが固まったものを使用することができる。これら茶葉又は茶渋の粉砕方法は特に制限されない。

前記抽出工程（イ）で用いられる炭素数１〜３の低級アルコール溶剤としては、メタノール、エタノール、プロパノールなどが挙げられるが、好ましくはメタノールである。水とメタノールとを用いて抽出を行う場合、より具体的には、硫酸化Ｃ−配糖体を含有する茶葉又は茶渋を粉砕して水に分散させ、その茶葉又は茶渋粉末を前記水の５〜２０倍容量（好ましくは５〜１５倍容量）の４０〜６０ｗｔ％（好ましくは４５〜５５ｗｔ％）メタノール水溶液を用いて、５〜７０℃で５〜３０分間の抽出操作を行って、硫酸化Ｃ−配糖体を含む抽出液を得る。

前記濃縮・乾固工程（ロ）においては、抽出工程（イ）で得られた抽出液を減圧下（好ましくは１０〜５００ｍｍＨｇの減圧下）で十分な温度（好ましくは該抽出液の沸点より２０℃以上高い温度）にまで加熱して抽出液の溶媒を蒸発させて濃縮し、さらにその濃縮温度で加熱を続けて溶媒を実質的に除去し、抽出液中に溶解している物質を乾固させて硫酸化Ｃ−配糖体を含む乾固物質を得ることが特に好ましい。

前記精製工程（ハ）においては、濃縮・乾固工程（ロ）で得られた硫酸化Ｃ−配糖体を含む乾固物質を、水及びｎ−ブタノール溶剤を用いて液液分配し、その水層部を化学分離精製に用いられる方法によって精製する。化学分離精製法としては、薄層クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、分配クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＣＬ）、電気泳動などが挙げられる。

前記硫酸化Ｃ−配糖体はイソビテキシンやビテキシンと異なり、硫酸基の存在により水溶性が高い高極性な物質である。したがって、水とn-ブタノール溶剤との液液分配では、イソビテキシンやビテキシン、及びチャフロサイドはn-ブタノール溶剤層に移行するのに対し、前記硫酸化Ｃ−配糖体は水層部に含まれる。

より具体的には、前記精製工程（ハ）において、液液分配後の水層部を合成吸着剤等に通してから、水で充分に洗浄後、吸着部を１０〜６０％メタノール（好ましくは３０％メタノール）で溶出させた後、ゲル濾過やシリカゲルカラムクロマトグラフィー等の方法で分画し、各溶出画分を１４０〜１９０℃で５〜１８０分（より好ましくは１６０℃で４０分）加熱処理後に生成するチャフロサイド量をＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析により求め、生成量が最も高い分画のみをＨＰＬＣ法での精製に供する。

吸着クロマトグラフィーには、商品名「Diaion SP825」（三菱化学（株）製）、Diaion SP207（三菱化学（株）製）、アンバーライトXAD（オルガノ（株））、クロマト用シリカゲル（和光純薬社製、メルク社製）等を用いることができる。
ゲル濾過は、商品名「Sephadex LH-20」（ファルマシア社製）、Bio Gel P-2等のゲル濾過クロマトグラフィーを用いることができる。

ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析法としては、メタノール水溶液又はアセトニトリル水溶液によるＨＰＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析法を用いることができる。また前記ＨＰＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析法では、例えば、インタクト株式会社製のＣ１８カラムを用い、特定の溶媒を用いる「Cadenza CD C18のＨＰＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析法」を用いることができる。

前記のメタノール水溶液又はアセトニトリル水溶液は、２０〜８０ｗｔ％のメタノール水溶液、又は１０〜６０ｗｔ％のアセトニトリル水溶液であることが、特にＨＰＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析法において高い精度で茶葉やそれより分離過程で得た分画の加熱処理後にそれらに含まれるチャフロサイド又はその類縁体を定量することができるので、さらに好ましい。

（３）フラボンＣ−配糖体からの硫酸化Ｃ−配糖体の合成方法
本発明の硫酸化Ｃ−配糖体は、下記一般式（Ａ０）又は（Ｂ０）で表されるフラボンＣ−配糖体から合成することによっても得ることができる。ここで、下記一般式（Ａ０）及び（Ｂ０）中、Ｒ₁、Ｒ₂及びＲ₃は各々独立して水素原子又はＯＨ基を表す。

上記一般式（Ａ０）又は（Ｂ０）で表されるフラボンＣ−配糖体としては、下記式に示したＡ０−１、Ａ０−２、Ａ０−３、Ａ０−４、Ｂ０−１、Ｂ０−２、Ｂ０−３、及びＢ０−４が挙げられる。（式中、Ｒ、Ｒ₁及びＲ₂は、それぞれ上記一般式（Ａ１）及び（Ｂ１）におけるのと同義である。）

上記一般式（Ａ０）で表される化合物のうち特に好ましいものは、イソビテキシン（上記化合物（Ａ０−２））である。一般式（Ｂ０）で表される化合物のうち特に好ましいものはビテキシン（上記化合物（Ｂ０−２））である。

本発明の硫酸化Ｃ−配糖体の合成方法は、上記一般式（Ａ０）又は（Ｂ０）で表されるフラボンＣ−配糖体と硫酸基導入剤とを反応させ、該フラボンＣ−配糖体を硫酸化する工程を含むことを特徴とする。チャフロサイド前駆体Ａを合成する場合はフラボンＣ−配糖体としてイソビテキシンを、チャフロサイド前駆体Ｂを合成する場合はフラボンＣ−配糖体としてビテキシンを用いる。

ここで用いられる硫酸基導入剤としては、ピリジン−ＳＯ_３錯体（Pyridine-SO₃ (1:1) complex）、硫酸−ＤＣＣ（硫酸とジシクロヘキシルカルボジイミドとの組み合わせ）、及びトリエチルアミン−ＳＯ_３錯体からなる群から選択されるものが挙げられる。

上記合成方法のうち、イソビテキシン及びビテキシンからそれぞれチャフロサイド前駆体Ａ及びＢを合成する方法についてより具体的に述べると、第１段階で、イソビテキシン又はビテキシンの４位と５位の水酸基を予め保護する。保護基の導入には、例えばベンズアルデヒドジメチルアセタール−ＰＰＴＳ、ベンズアルデヒド−塩化亜鉛等を用いることができる。
次いで、４位と５位に保護基を導入された前記化合物に硫酸基導入剤を反応させ、所望する２位に硫酸基を導入する。このときの反応温度は、好ましくは２０〜８０℃、より好ましくは３０〜４０℃であり、反応時間は０．５〜８時間、より好ましくは２〜４時間である。

このようにして得た、イソビテキシン又はビテキシンの４位と５位の水酸基が保護され、２“又は３”位が硫酸化されたイソビテキシン又はビテキシン誘導体を、陽イオン交換樹脂（IR-120）、４０％酢酸等で加水分解処理で４位と５位の水酸基の保護基を除去した後、所望するチャフロサイド前駆体はSep-Pack C18を用いる分配カラムクロマトグラフィー、ODS-C18カラムを用いるＨＰＬＣ、ゲル濾過等で単離、精製することができる。

（４）チャフロサイド及びその類縁体の製造方法
本発明のチャフロサイド及びその類縁体の製造方法は、前記硫酸化Ｃ−配糖体を１４０〜１９０℃、好ましくは１５０〜１８０℃で加熱する工程を含むことを特徴とする。硫酸化Ｃ−配糖体を加熱することによって、遷移状態を経て分子内環化反応が進行しチャフロサイド及びその類縁体が生成すると考えられる。その化学反応式について、チャフロサイド前駆体Ａ（イソビテキシン2"-sulfate）からチャフロサイドＡの製造、及びチャフロサイド前駆体Ｂ（ビテキシン2"-sulfate）からチャフロサイドＢの製造における化学反応の例を以下に示す。

前記硫酸化Ｃ−配糖体のうち、一般式（Ａ１）で表される硫酸化Ｃ−配糖体からは、下記一般式（Ａ２）で表されるチャフロサイド及びその類縁体が得られる。一般式（Ｂ１）で表される硫酸化Ｃ−配糖体からは、下記一般式（Ｂ２）で表されるチャフロサイド及びその類縁体が得られる。ここで、下記一般式（Ａ２）及び（Ｂ２）中、Ｒ、Ｒ₁及びＲ₂は、それぞれ上記一般式（Ａ１）及び（Ｂ１）におけるのと同義である。

より具体的には、前記硫酸化Ｃ−配糖体のうち、下記一般式（Ａ１−１）及び（Ｂ１−１）で表される硫酸化Ｃ−配糖体からは、各々下記一般式（Ａ２−１）及び（Ｂ２−１）で表されるチャフロサイドの類縁体が得られる。一般式（Ａ１−２）及び（Ｂ１−２）で表されるチャフロサイド前駆体ＡとＢからは、各々下記一般式（Ａ２−２）及び（Ｂ２−２）で表されるチャフロサイドＡとＢが得られる。一般式（Ａ１−３）及び（Ｂ１−３）で表される硫酸化Ｃ−配糖体からは、各々下記一般式（Ａ２−３）及び（Ｂ２−３）で表されるチャフロサイドの類縁体が得られる。一般式（Ａ１−４）及び（Ｂ１−４）で表される硫酸化Ｃ−配糖体からは、各々下記一般式（Ａ２−４）及び（Ｂ２−４）で表されるチャフロサイドの類縁体が得られる。

以下に、実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例にのみ限定されるものではない。

＜実施例１＞
本実施例１では、各種の茶葉中に含まれるチャフロサイドＡとチャフロサイドＢの含量を、以下の方法で分析した。まず、ニュージランド産のPuriri(Vitex lucens)を原料として、これから調製したイソビテキシン及びビテキシンから光延反応でチャフロサイドＡとＢをそれぞれ合成し、それらを用いてチャフロサイド分析用の検量線を作製し、それをもとに各種茶葉中のチャフロサイドＡとＢの定量分析を行った。

（１）試薬
合成に使用した試薬、溶媒はすべて和光純薬社製特級品を用いた。分配型分離剤としてはWaters社の商品名「Sep-Pack C18 Cartridge」に充填されている「ODS C18」を用いた。ゲル濾過に商品名「Sephadex LH 20」（ファルマシア社製）、吸着分離剤として商品名「Diaion SP825」（三菱化学（株）製）を使用した。分離用ＨＰＬＣカラムに商品名「Cadenza CD-C18」（インタクト（株）製）を使用した。

（２）試料
実験用茶葉には以下の品種のものを使用した。
緑茶；静７１３２、藪北、さやまかおり
焙じ茶；静７１３２、藪北
ウーロン茶；静７１３２、水仙、鉄観音
紅茶；静７１３２、アッサム、ダージリン
なお、静７１３２から製造した緑茶、ウーロン茶、及び紅茶は、静岡県島田市在住の茶製造の専門家が作成したものである。

茶葉の抽出は、茶葉をコーヒーミルで粉砕後、その０．２ｇを５０％ＭｅＯＨ（２ｍｌ）で攪拌下、９０℃で２０分間行った。なお、この操作は２回繰り返した。抽出液を減圧下濃縮乾固し、Ｈ₂Ｏ（１ｍｌ）に溶解した後、ｎ−ＢｕＯＨ（１ｍｌ×２）を用いて抽出し得たｎ−ＢｕＯＨ層部を減圧下濃縮乾固後、３０％−ＣＨ₃ＣＮ（０．５ｍｌ）に溶解し、分析用サンプルとした。

（３）測定及び分析の方法
ＮＭＲ測定は、商品名「ＪＮＭ−ＥＣＡ５００」（日本電子社製）、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析には商品名「Agilent 1100」及び「API 2000」（Applied Bio社製）を併用し、ＱＴＯＦ−ＭＳ測定には商品名「ＱＳＴＡＲ」（Applied Bio社製）、ＵＶ測定は商品名「Ｕ３９００」（（株）日立製作所製）、加熱にはミクロ蒸留用加熱恒温槽（Buchi社製）を使用した。

（４）チャフロサイドＡとＢ、及びイソビテキシンとビテキシンの分析
予め合成したチャフロサイドＡとＢ、及びイソビテキシンとビテキシンから、それぞれ０．２ｎｇ／ｍｌ、１．０ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ及び１０００ｎｇ／ｍｌの標準溶液を調製した。これらの各標準溶液を使用し、カラムには商品名「Cadenza CD-C18」（３×１５０ｍｍ）を用い、溶出展開はＨ₂Ｏ−ＣＨ₃ＣＮの混合溶媒を用いて２０分かけて１５〜５０％とするグラジエント法を使用した。

各濃度の標準溶液１０μｌを用いて得たクロマトグラムの各化合物のピーク面積より検量線を作成し、それをもとにＥＳＩ法を用いたＰＬＣ−ＭＳ／ＭＳ法で定量分析を行った。ＭＳ／ＭＳ条件は以下に示した。

（５）結果及び考察
上記各銘柄の茶葉に含まれるチャフロサイドＡ、チャフロサイドＢ、イソビテキシン、及びビテキシンの量をＨＰＬＣ−ＭＳ／ＭＳ法で分析した結果を、下記表２に示す。なお、表中に示される含有量の単位は「ｎｇ／ｇ」である。

上記各銘柄の茶葉のすべてについて、イソビテキシンとビテキシンとともにチャフロサイドＡ及びチャフロサイドＢが検出された。イソビテキシン及びビテキシンの含量は、茶葉１グラム当たり数十から１００μｇで、平均値で眺めるとその量は緑茶、焙じ茶、ウーロン茶、紅茶の順に多く、各茶及び銘柄間に大きな差は無かった。

一方、チャフロサイドＡとＢは茶間に大きな差が認められた。緑茶及び紅茶中の含量は茶葉１グラム当たり数十ｎｇで、銘柄間の差はほとんどなかった。これらと比べて、静７１３２から製したウーロン茶を除いて、ほうじ茶とウーロン茶ではバラツキはあるが含量は茶葉１グラム当たり数μｇと緑茶及び紅茶と比べて顕著にその含量は高かった。ほうじ茶では銘柄間には有意な差はなかったが、ウーロン茶では大きな差があった。

緑茶は新鮮若葉を蒸した後、すぐ冷やし、８０℃位で加熱しながら水を飛ばしながら手で巻き込むように乾燥し、製茶する。紅茶は約８時間かけて若葉を撓らせ、その水分を抜き、その後手でもみ数時間酸化発酵させてから、９０℃位の熱風で、短時間で乾燥しつつ製茶する。ウーロン茶は成熟した葉を２〜３時間日光浴で撓らせ、室内でタケカゴの上で揺すらせつつ中程度の発酵を施し、次いで１６０〜２６０℃の熱風により短時間で酵素を殺し、最終的に９０℃位で乾燥しつつ製茶する。ほうじ茶は緑茶を１６０〜２００℃で短時間焙煎させ製する。

室温でウーロン茶の中で含量が多いものは強く火入れされた焙煎痕が認められたが、静７１３２から製したウーロン茶にはその形跡がなかった。また、同族の同じ茶葉から製した緑茶は焙じることで顕著な含量上昇が認められた。
以上のことから、チャフロサイドＡとチャフロサイドＢの生成要因の一つは１６０℃以上の高温での加熱と推察された。

なお、各銘柄の茶葉中のチャフロサイドＡとＢの含量とイソビテキシン及びビテキシン量との間には相関性は認められなかった。

（６）生成要因の最適化
静７１３２より製したウーロン茶を１２０、１４０、１６０、１８０及び２００℃で４０分間加熱した後、それぞれの茶葉中のチャフロサイドＡとＢの含有量を求め、表３に示す結果を得た。なお、表中に示される含有量の単位は「ｎｇ／ｇ」である。

また、加熱温度１６０℃で２０、４０、６０及び８０分間の加熱した後の各茶葉中のチャフロサイドＡとチャフロサイドＢの含有量を求め、表４の結果を得た。なお、表中に示される含有量の単位は「ｎｇ／ｇ」である。

以上の結果から、製茶葉中でチャフロサイドＡとＢは加熱によって生成し、その至適温度は本茶葉では１６０〜１８０℃の範囲であることが明らかとなった。高すぎると分解することが示された。また、１６０℃の加熱では約４０分間でその生成量は極大となり、それ以上の時間をかけても生成量は増加せず、ほぼ一定であった。

なお、各銘柄の緑茶、ウーロン茶、及び紅茶を至適温度と至適時間で加熱処理すると、緑茶とウーロン茶、及び特定の紅茶ではチャフロサイドＡとＢの含量は顕著に増加し、平均１５μｇ／ｇ（茶葉）程度となった。しかし、市販の一般的な紅茶ではその量は顕著に増加するが平均数μｇ／ｇ（茶葉）程度であった。これより、製茶過程の酸化的発酵処理もチャフロサイドＡとＢの生成に重要であることが示された。

＜実施例２＞
本実施例では、チャフロサイド前駆体の分離・精製、及び構造決定を行った。
上述したように、チャフロサイドＡとＢはイソビテキシンとビテキシンにトリフェニルホスフィンとジエチルアゾジカルボキシレートを作用させる光延反応により生成する。そこで、最初に前駆体の抽出とその性状について以下のように検討を加えた。

（１）チャフロサイド前駆体の分離・精製
静７１３２より製したウーロン茶葉（１ｇ）を粉砕し、環流下、ＭｅＯＨ、５０％−ＭｅＯＨ及び水（１ｍｌ）で抽出し、抽出液を減圧下濃縮乾固後、水（０．４ｍｌ）に懸濁しｎ−ＢｕＯＨ（４及び１ｍｌ）で抽出した。各抽出物、それらより液液分配で得た水層部とｎ−ＢｕＯＨ層部を１６０℃で４０分間加熱した。

その結果、各抽出物とその水層部中にのみ加熱によるチャフロサイドＡとＢの生成が認められた。また、イソビテキシンとビテキシンは、水とｎ−ＢｕＯＨの液液分配ではｎ−ＢｕＯＨ層に移行する。これより、チャフロサイドＡとＢの前駆体はイソビテキシンとビテキシンとは異なり、それらより水溶性が高い高極性な物質であることが分かった。

以上の結果をもとに、前駆体の分離は、各分離段階で得た画分を乾固ののち、１６０℃で４０分間の加熱処理後、チャフロサイドＡとＢのＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析に供し、チャフロサイドＡやＢの生成量が最も高かった分画のみを次の分離に供するという方法で実施した。このようにして確立した前駆体の分離工程の一例を図１（チャート図）に示した。

静７１３２より製したウーロン茶葉（１Ｋｇ）を粉砕し、環流下、ＭｅＯＨ（１０Ｌ）で抽出を行った。得られた抽出液を減圧下濃縮乾固後、抽出物（３４８ｇ）を水（４Ｌ）に懸濁し、ｎ−ＢｕＯＨ（４及び１Ｌ）で抽出した。水層部（１４２ｇ）を水（３Ｌ）に溶解し、「Diaion SP825」（２．４Ｌ）にアプライし、水（３Ｌ）で洗浄後、３０％メタノール（８Ｌ）で溶出させた。３０％メタノール溶出部（２４８ｇ）をメタノールで展開する「Sephadex LH-20」（１２Ｌ）を用いるゲル濾過で分画した。

Ｋｄ＝２．１−２．８の溶出分画（１．９７ｇ）を２０％アセトニトリル溶液で展開する「ＯＤＳ−Ｃ１８」（４００ｍＬ）カラムクロマトグラフィーにより、チャフロサイドＡとＢの前駆体を含む粗分画（それぞれ８７ｍｇ及び６３ｍｇ）を得た。

最終的に「Cadenza CD-C18」カラムと０，０５％ＨＣＯ₂Ｈ−ＣＨ₃ＣＮ（８２：１８）を使用するＨＰＬＣ法で精製し、チャフロサイド前駆体（prechafuroside）Ａ、及びチャフロサイド前駆体Ｂ（それぞれ５ｍｇ及び４ｍｇ）を得た。

このように、本発明によれば、水層部を強塩基性のイオン交換樹脂に付し、吸着部を「Sephadex LH-20」（１２Ｌ）を用いるゲル濾過、２０％アセトニトリル溶液で展開する「ＯＤＳ−Ｃ１８」（４００ｍＬ）カラムクロマトグラフィー、「Cadenza CD-C18」カラムと０，０５％ＨＣＯ₂Ｈ−ＣＨ₃ＣＮ（８２：１８）を使用するＨＰＬＣ法等で精製することができる。

（２）チャフロサイド前駆体の構造決定
Negative modeでのＱＴＯＦ−ＭＳ分析により求めたチャフロサイド前駆体ＡとＢ両化合物の精密分子量（prechafuroside A: m/z 511.05612 (M-H)^_と prechafuroside B:m/z 511.05643 (M-H)^-）と、¹³Ｃ−ＮＭＲデータ（下記表５参照）より、両化合物の分子式を「Ｃ₂₁Ｈ₂₀Ｏ₁₃Ｓ」(calcd. for C₂₁H₂₀O₁₃S _ H, 511.05625)と決定した。

チャフロサイド前駆体ＡはそのＵＶスペクトルにおいてイソビテキシンと同じ波長、３３０ｎｍ（ε 40200）と２８４ｎｍ（ε 64200）で極大吸収を、またチャフロサイド前駆体Ｂではビテキシンの極大吸収波長、３２５ｎｍ（ε 44100）と２８５ｎｍ（ε 62200）に極大吸収を認めた。また、ピリジン・ジオキサン（１：１）による水解処理によりチャフロサイド前駆体Ａからイソビテキシンが、またチャフロサイド前駆体Ｂよりビテキシンが、ほぼ定量的に生成した。

表５に示したチャフロサイド前駆体ＡとＢおよびイソビテキシンとビテキシンの¹³Ｃ−ＮＭＲデータから明らかなように、チャフロサイド前駆体Ａとイソビテキシンの間、およびチャフロサイド前駆体Ｂとビテキシン両者間の各炭素原子のケミカルシフト値はともにＣ−２”をのぞいて、有意な相違は認められない。

そして、チャフロサイド前駆体Ａとイソビテキシン、およびチャフロサイド前駆体Ｂとビテキシン間のＣ−２”炭素原子のケミカルシフト値の差、低磁場シフト値よりチャフロサイド前駆体Ａとチャフロサイド前駆体ＢはそれぞれイソビテキシンとビテキシンのＣ−２”位のＯＨ基が硫酸化された化合物であることを強く示唆した。

これらの結果から、チャフロサイド前駆体ＡとＢの構造は下記化学式に示したそれぞれ「isovitexin 2”-O-sulfate」と「vitexin 2”-O-sulfate」と結論した。下記化学式中、左は「isovitexin 2”-O-sulfate」であり、右は「vitexin 2”-O-sulfate」である。

ＱＴＯＦ−ＭＳ／ＭＳ測定でチャフロサイド前駆体Ａは［isovitexin-H］に相当するC₂₁H₁₉O₁₀に帰属できるフラグメントイオン（m/z 431.1040（calcd for C₂₁H₁₉O₁₀, 431.0978））とOSO₃H相当のフラグメントイオン（m/z 96.9618 (calcd. for HSO₄, 96.9601)）を、またチャフロサイド前駆体Ｂも［vitexin-H］相当のC₂₁H₁₉O₁₀で示されるフラグメントイオン（m/z 431.1040（calcd for C21H19O10, 431.0978））とOSO₃H相当のフラグメントイオン（m/z 96.9604 (calcd. for HSO₄, 96.9601)）をそれぞれ与えたことは、これらの構造をよく支持する（下記化学式参照）。又、以下に述べる合成法で得た推定した化合物とウーロン茶葉から得たチャフロサイド前駆体は物理科学的なデータが完全に一致したことからそれぞれをisovitexin 2”-O-sulfateとvitexin 2”-O-sulfateと決定した。

硫酸化糖や胆汁アルコールの側鎖の水酸基が硫酸化された化合物では、強アルカリ処理によって近接するＯＨがＯ^-と求核剤となり、その結果ＳＮ₂タイプの置換反応が誘発され、分子内環化が進行することが知られている。

チャフロサイド前駆体ＡとＢでは、加熱によってそれぞれ下記化学式に示したような遷移状態を経て分子内環化反応が進行しチャフロサイドＡとチャフロサイドＢが生成したとすると、加熱によるチャフロサイド前駆体ＡとＢからチャフロサイドＡとＢへの変換は良く説明される。

＜実施例３＞
本実施例では、チャフロサイド前駆体Ａを、イソビテキシンから合成した。
（１）イソビテキシンの４位と５位の水酸基を保護した化合物の合成
ジメチルホルムアルデヒド（ＤＭＦ）中で、触媒量のＰＰＴＳ（Pyridine-p-Toluenesulfuric acid complex）の存在下、イソビテキシンに２当量のBenzaldehyde dimethylacetalを５０℃で２時間作用させ、イソビテキシンの４位と５位の水酸基を保護した「化合物Ａ」（Ｍｗ（分子量）＝５２０）を合成した（収率：１００％）。

（２）化合物Ａの2"-sulfate（化合物Ｂ）の合成
前記化合物Ａをピリジン（Pyridine）に溶解後、１．５当量のPyridine-SO₃ (1:1) complexを５０℃で２時間作用させ、前記化合物Ａの2"-sulfate（以下、「化合物Ｂ」とする）（Ｍｗ＝６００）を合成した（収率：約５０％）。この方法で、化合物Ｂと同じ量の化合物Ａの3"-sulfateが生成した。

（３）イソビテキシンの2"-sulfate（Isovitexin 2"-sulfate）の合成
２０％ＭｅＯＨに溶解した化合物Ｂに酸性タイプの陽イオン交換樹脂（商品名「Amberlite IR-120(H+)」（ローム＆ハース社製）を加え、ｐＨ３とし、約１時間５０℃で撹拌下加熱し、Isovitexin 2"-sulfateを得た（収率：１００％）。これらの化学反応を以下の化学式で示す。

（４）得られたIsovitexin 2"-sulfateは、上記実施例２において茶葉から抽出したものと直接その構造を比較し、上記チャフロサイド前駆体Ａであることを確認した。また、このIsovitexin 2"-sulfateを約１６０〜１７０℃で加熱したところ、チャフロサイドＡが収率約８５％で生成した。

＜実施例４＞
本実施例では、チャフロサイド前駆体Ｂを、ビテキシンから合成した。
（１）ビテキシンの４位と５位の水酸基を保護した化合物の合成
ジメチルホルムアルデヒド（ＤＭＦ）中で、触媒量のＰＰＴＳ（Pyridine-p-Toluenesulfuric acid complex）の存在下、ビテキシンに２当量のBenzaldehyde dimethylacetalを５０℃で２時間作用させ、ビテキシンの４位と５位の水酸基を保護した「化合物Ｃ」（Ｍｗ（分子量）＝５２０）を合成した（収率：１００％）。

（２）化合物Ｃの2"-sulfate（化合物Ｄ）の合成
前記化合物Ｃをピリジン（Pyridine）に溶解後、１．５当量のPyridine-SO₃ (1:1) complexを５０℃で２時間作用させ、前記化合物Ｃの2"-sulfate（以下、「化合物Ｄ」とする）（Ｍｗ＝６００）を合成した（収率：約５０％）。この方法で、化合物Ｄと同じ量の化合物Ｃの3"-sulfateが生成した。

（３）ビテキシンの2"-sulfate（Vitexin 2"-sulfate）の合成
２０％ＭｅＯＨに溶解した化合物Ｄに酸性タイプの陽イオン交換樹脂（商品名「Amberlite IR-120(H+)」（ローム＆ハース社製）を加え、ｐＨ３とし、約１時間５０℃で撹拌下加熱し、Vitexin 2"-sulfateを得た（収率：１００％）。これらの化学反応を以下の化学式で示す。

（４）得られたVitexin 2"-sulfateは、上記実施例２において茶葉から抽出したものと直接その構造を比較し、上記チャフロサイド前駆体Ｂであることを確認した。また、このVitexin 2"-sulfateを約１６０〜１７０℃で加熱したところ、チャフロサイドＢが収率約８５％で生成した。

本発明で見いだされた新規化合物であるチャフロサイド前駆体（チャフロサイド前駆体Ａ及びＢ）は、それ自体で抗酸化作用、抗アレルギー作用、抗炎症作用、発癌抑制作用等の優れた薬理作用を有することが期待される上に、硫酸基が導入されていることから水溶性が高く人体との親和性に優れたものである。さらに、該チャフロサイド前駆体を用いれば、既にかかる薬効成分を有することが知れているチャフロサイドＡ及びＢを極めて高い収率で製造することが可能となる。
したがって、本発明によれば、安価で安全な出発物質や試薬を用い、且つ比較的穏やかな反応条件であるにもかかわらず、高収率でチャフロサイドを生成することができるため、スケールアップにより工業的生産が可能であり、産業上極めて有用である。

Claims

下記一般式（Ａ１）又は（Ｂ１）で表される硫酸化Ｃ−配糖体。

（上記一般式（Ａ１）及び（Ｂ１）中、Ｒ₁、Ｒ₂及びＲ₃は各々独立して水素原子又はＯＨ基を表す。）
前記硫酸化Ｃ−配糖体が、下記式（Ａ１−２）で表されるイソビテキシンの硫酸化体又は下記一般式（Ｂ１−２）で表されるビテキシンの硫酸化体であることを特徴とする、請求項１記載の硫酸化Ｃ−配糖体。
請求項１又は２記載の硫酸化Ｃ−配糖体を単離する方法であって、前記硫酸化Ｃ−配糖体を含有する茶葉又は茶渋から水、炭素数１〜３の低級アルコール溶剤又はそれらの混合液を用いて該硫酸化Ｃ−配糖体を抽出する工程を含むことを特徴とする、硫酸化Ｃ−配糖体の単離方法。
以下の工程（イ）、（ロ）及び（ハ）を含むことを特徴とする、請求項３記載の硫酸化Ｃ−配糖体の単離方法。
（イ）前記硫酸化Ｃ−配糖体を含有する生茶葉、茶葉又は茶渋の粉砕物を、水、炭素数１〜３の低級アルコール溶剤又はそれらの混合液を用いて抽出し、該硫酸化Ｃ−配糖体を含む抽出液を得る抽出工程
（ロ）前記抽出工程（イ）で得られた抽出液を減圧下で加熱濃縮乾固させ、前記硫酸化Ｃ−配糖体を含む乾固物質を得る濃縮・乾固工程
（ハ）前記濃縮・乾固工程（ロ）で得られた硫酸化Ｃ−配糖体を含む乾固物質を、水及びｎ−ブタノール溶剤を用いて液液分配し、その水層部を化学分離精製法により精製する精製工程
請求項１又は２記載の硫酸化Ｃ−配糖体を合成する方法であって、下記一般式（Ａ０）又は（Ｂ０）で表されるフラボンＣ−配糖体と、ピリジン−ＳＯ _３錯体、硫酸−ＤＣＣ、及びトリエチルアミン−ＳＯ _３錯体からなる群から選択される硫酸基導入剤とを反応させ、該フラボンＣ−配糖体を硫酸化する工程を含むことを特徴とする、硫酸化Ｃ−配糖体の合成方法。

（上記一般式（Ａ０）及び（Ｂ０）中、Ｒ_１、Ｒ_２及びＲ_３は各々独立して水素原子又はＯＨ基を表す。）
前記硫酸基導入剤が、ピリジン−ＳＯ_３錯体である、請求項５記載の硫酸化Ｃ−配糖体の合成方法。
下記一般式（Ａ２）又は（Ｂ２）で表されるチャフロサイド及びその類縁体を製造する方法であって、請求項１又は２記載の硫酸化Ｃ−配糖体を１３０〜１９０℃で加熱する工程を含むことを特徴とする、チャフロサイド及びその類縁体の製造方法。

（上記一般式（Ａ２）及び（Ｂ２）中、Ｒ₁、Ｒ₂及びＲ₃は各々独立して水素原子又はＯＨ基を表す。）