CN102266355B - 鳄鱼鳞提取物及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种鳄鱼鳞提取物及其应用，所述鳄鱼鳞提取物，经过以下步骤制备而成：鳄鱼鳞加水煮沸，离心取上清液，调pH，制备成鳄鱼鳞提取物，本发明在于，提供一种鳄鱼鳞提取物，以及所述提取物在制备治疗肝纤维化药物中的应用。

Description

鳄鱼鳞提取物及其应用

技术领域：

本发明属于药学领域，涉及一种鳄鱼鳞提取物及其应用。

背景技术：

肝纤维化(Hepatic fibrosis，HF)是由于不同病因(炎症、酒精、寄生虫、中毒、代谢障碍、血液循环障碍、营养障碍等)致肝细胞(HC)损伤时，可激活枯否氏细胞(KC)，分泌多种细胞因子，伴随血小板、肝窦内皮细胞(SEC)分泌的细胞因子和某些化学介质共同激活肝星状细胞(HSC)，使其转化为肝成纤维细胞(MFB)，通过旁分泌和自分泌作用，大量产生以胶原为主的细胞外基质(ECM)，使ECM在肝内过多沉积，导致肝纤维化的产生和发展。肝纤维化是肝硬化的早期阶段和必经阶段，在一定情况下可以逆转，但若病因持续存在，肝纤维化逐渐加重，肝小叶及血管等逐渐被改建，肝脏的正常结构遭到破坏，中心静脉区和汇管区出现间隔、假小叶形成，即发展为不可逆转的肝硬化。

积极探索肝纤维化发病机制，从而寻求有效治疗措施对降低肝硬化发病率和死亡率有重要意义。目前，肝纤维化治疗研究主要集中在以下几个方面：1、保护肝细胞，抑制HSC激活，2、抑制ECM合成，促进其降解，3、抑制细胞因子活性，调节信号通路。

鳄鱼是脊索动物门爬行纲鳄目动物的通称，全身都是宝，我国古代称鳄鱼为“鼍龙”，又名鮀鱼(《神农本草经》)、土龙(《续博物志》)。鳄鱼肉、骨、甲及其内脏都含有丰富的蛋白质、氨基酸、不饱和脂肪酸、维生素和多种微量元素。鳄鱼的壳外表皮由β-角蛋白组成，颈及腿的皮肤由α-角蛋白组成，鳞甲含大量的骨胶原。早在南北朝时期的《本草经集注》中，就有对鳄鱼甲药用的记载：“味辛，微温。主心腹癥瘕、伏坚、积聚、寒热，女子崩中下血五色，小腹阴中相隐痛，疮疥死肌”。《本草拾遗》中称鼍甲“主恶疮，腹内癥瘕”，“炙烧浸酒，主瘰疬，杀虫，瘘疮，风顽疥瘙”。《本草纲目》中曾记载其甲味辛、性温，有破血逐淤、消肿生肌之功效。《中华本草》曾经记载扬子鳄的甲片，有消积、化瘀、杀虫功能，主治心腹瘕积聚，崩中带下，疮疥、恶疮，肠风痔疾。以上所述症瘕主要指现代医学中的卵巢癌，积聚指现代医学中的肝癌、肺癌，古时又称肺积。国内外对鳄鱼的药用研究方兴未艾。

本实验室经过不懈的努力和研究，发现鳄鱼鳞经过提取加工后得到的提取物，在治疗肝纤维化方面有很好的效果。这项研究成果，迄今尚未见到相关报道。

发明内容：

本发明的目的在于提供一种鳄鱼鳞提取物，以及所述提取物在制备治疗肝纤维化药物中的应用。

本发明所述鳄鱼鳞提取物，通过以下方法制备而成：

鳄鱼鳞加水煮沸，离心取上清液，调pH为7，制备成鳄鱼鳞提取物。

优选的制备方法如下：称取鳄鱼鳞粉末1g，加10mL蒸馏水，煮沸并回流提取2h，离心8000r/min，10min，取上清液，调pH为7，制备成生药浓度为0.1g/mL的粗提取液，先后用0.45μm和0.22μm的微孔滤膜过滤，除菌，分装冻存。

其中，鳄鱼鳞粉末可以从市场上购买。

本发明还包括，用本发明的鳄鱼鳞提取物作为药物活性成分制备成的药物组合物。

本发明的药物组合物，根据需要可以含有药物可接受的载体，其中所述重组大鼠细胞球蛋白作为药物活性成分，其在制剂中所占重量百分比可以是0.01-99.99％，其余为药物可接受的载体。本发明的药物组合物，以单位剂量形式存在，所述单位剂量形式是指制剂的单位，如片剂的每片，胶囊的每粒，口服液的每瓶，颗粒剂每袋，注射剂的每支等。

本发明的药物组合物可以是任何可药用的剂型，这些剂型包括：滴丸剂、片剂、胶囊剂、口服液、口含剂、颗粒剂、冲剂、丸剂、散剂、膏剂、丹剂、混悬剂、粉剂、注射剂、栓剂、软膏剂、硬膏剂、霜剂、喷雾剂、滴剂或贴剂。

本发明的药物组合物，其口服给药的制剂可含有常用的赋形剂，诸如粘合剂、填充剂、稀释剂、压片剂、润滑剂、崩解剂、着色剂、调味剂和湿润剂，必要时可对片剂进行包衣。

适用的填充剂包括纤维素、甘露糖醇、乳糖和其它类似的填充剂。适宜的崩解剂包括淀粉、聚乙烯吡咯烷酮和淀粉衍生物，例如羟基乙酸淀粉钠。适宜的润滑剂包括，例如硬脂酸镁。适宜的药物可接受的湿润剂包括十二烷基硫酸钠。

可通过混合，填充，压片等常用的方法制备固体口服组合物。进行反复混合可使活性物质分布在整个使用大量填充剂的那些组合物中。

口服液体制剂的形式例如可以是水性或油性悬浮液、溶液、乳剂、糖浆剂或酏剂，或者可以是一种在使用前可用水或其它适宜的载体复配的干燥产品。这种液体制剂可含有常规的添加剂，诸如悬浮剂，例如山梨醇、糖浆、甲基纤维素、明胶、羟乙基纤维素、羧甲基纤维素、硬脂酸铝凝胶或氢化食用脂肪，乳化剂，例如卵磷脂、脱水山梨醇一油酸酯或阿拉伯胶；非水性载体(它们可以包括食用油)，例如杏仁油、分馏椰子油、诸如甘油的酯的油性酯、丙二醇或乙醇；防腐剂，例如对羟基苯甲酯或对羟基苯甲酸丙酯或山梨酸，并且如果需要，可含有常规的香味剂或着色剂。

对于注射剂，制备的液体单位剂型含有本发明的活性物质和无菌载体。根据载体和浓度，可以将此化合物悬浮或者溶解。溶液的制备通常是通过将活性物质溶解在一种载体中，在将其装入一种适宜的小瓶或安瓿前过滤消毒，然后密封。辅料例如一种局部麻醉剂、防腐剂和缓冲剂也可以溶解在这种载体中。为了提高其稳定性，可在装入小瓶以后将这种组合物冰冻，并在真空下将水除去。

本发明的药物组合物，在制备成药剂时可选择性地加入适合的药物可接受的载体，所述药物可接受的载体选自：甘露醇、山梨醇、焦亚硫酸钠、亚硫酸氢钠、硫代硫酸钠、盐酸半胱氨酸、巯基乙酸、蛋氨酸、维生素C、EDTA二钠、EDTA钙钠，一价碱金属的碳酸盐、醋酸盐、磷酸盐或其水溶液、盐酸、醋酸、硫酸、磷酸、氨基酸、氯化钠、氯化钾、乳酸钠、木糖醇、麦芽糖、葡萄糖、果糖、右旋糖苷、甘氨酸、淀粉、蔗糖、乳糖、甘露糖醇、硅衍生物、纤维素及其衍生物、藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、甘油、土温80、琼脂、碳酸钙、碳酸氢钙、表面活性剂、聚乙二醇、环糊精、β-环糊精、磷脂类材料、高岭土、滑石粉、硬脂酸钙、硬脂酸镁等。

本发明的药物制剂在使用时根据病人的情况确定用法用量，如每日1-3次，每次1-3片。

本发明进一步包括，本发明的鳄鱼鳞提取物在制备治疗肝纤维化的药物中的应用。

其中所述的应用通过降低I、III型胶原的表达，调节ECM生成与降解，保护肝组织免受有害物质的侵害以达到抑制肝纤维化的作用。

其中所述的应用，其特征在于，通过抑制TGF-β1的生成而发挥抗肝纤维化的作用。

其中所述的应用，其特征在于，通过降低肝纤维化小鼠肝组织中活化的HSC数目及向肌成纤维细胞转化的进程，从而达到逆转肝纤维化的作用。

其中所述的应用，其特征在于，通过降酶保肝，避免肝细胞膜受到损害的功能，达到治疗肝纤维化的作用。

其中所述的应用，其特征在于，通过改善肝脏的微循环，抑制肝脏内胶原的生成及胶原分泌细胞的增殖，减少ECM的沉积来达到治疗肝纤维化的作用。

其中所述的应用，其特征在于，通过减缓肝组织脂质过氧化进程，增强抗氧化能力，进而保护肝细胞不受损伤，从而发挥抗肝纤维化的作用。

其中所述的应用，其特征在于，通过抑制HSC的活化，阻断TGF-β1在HSC内的信号转导，阻止HSC向MFB转化，改善肝组织炎症坏死程度，促进ECM的降解，减少胶原的生成，有效地减轻肝纤维化程度。

其中所述的应用，其特征在于，通过降酶保肝，改善肝脏的微循环，减缓肝组织脂质过氧化进程，增强抗氧化能力，进而避免肝细胞膜受到损害，降低活化的HSC数目及HSC向肌成纤维细胞转化的进程，抑制TGF-β1的生成，减少肝脏内胶原的生成及胶原分泌细胞的增殖，调节ECM的生成与降解，发挥逆转肝纤维化的作用。

通过以下试验，进一步说明鳄鱼鳞提取物在治疗肝纤维化疾病中的应用及作用机理。所用的鳄鱼鳞胶囊来自泰国是拉差龙虎园。

试验一：鳄鱼鳞提取物对肝纤维化小鼠一般情况的作用及肝组织HE、免疫组织化学染色

材料

1、实验动物与药品

健康雌性KM小鼠40只，体重20g±2g，购自福建吴氏实验动物。饲养温度25℃，实验前适应环境一周，饲料为鼠繁殖料。

精制切片石蜡：软蜡(熔点52℃-54℃)、硬蜡(56℃-58℃)购自上海华永石蜡有限公司)；苏木素伊红(HE)染色试剂盒购自碧云天生物技术研究所；胶原纤维染色液(VG染色液)购自厦门迈威生物科技有限公司；UltraSensitive^TM S-P超敏试剂盒(鼠/兔)、DAB显色试剂盒、兔抗人转化生长因子β1免疫组化多克隆抗体、鼠抗人肌动蛋白(平滑肌)免疫组化单克隆抗体均购自福州迈新生物技术开发有限公司；多聚赖氨酸购自Invitrigen公司；中性树脂购自北京康为世纪生物科技有限公司；其他生化试剂均为分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司。

2、仪器

石蜡切片机(Leica，德国)；其他仪器同2.1.1.2。

溶液配制与实验方法

溶液配制

25％CCl₄：取25mL CCl₄用花生油定溶至100mL。

10％中性福尔马林溶液：甲醛100mL，磷酸二氢钾4g，磷酸氢二钠6.5g，蒸馏水定容至1000mL，pH＝6.8-7.2。

0.5％盐酸溶液：取0.5mL浓盐酸用蒸馏水定溶至100mL。

10％多聚赖氨酸：取10mL多聚赖氨酸用蒸馏水定溶至100mL。

60％中性树胶：取60mL中性树胶用二甲苯定溶至100mL。

实验方法

动物模型制备

40只小鼠分为5组，分别为：正常组，模型组，鳄鱼鳞大剂量组，鳄鱼鳞中剂量组，鳄鱼鳞小剂量组。正常组注射生理盐水，其他组以25％CCl₄ 1mL/100g体重腹腔注射，一周两次，连续八周，造模完成。

分组给药

鳄鱼鳞煮液(实施例1制备得到的提取物)用前制成混悬液。小鼠的给药剂量根据体表面积的公式：小鼠的用药剂量＝9倍成人的用药剂量来进行换算，大剂量组每千克体重用量为正常成人用量的18倍，中剂量组每千克体重用量为正常成人用量的9倍，小剂量组每千克体重用量为正常成人用量的4.5倍，因此大剂量组为2.7g/kg(体质量)，中剂量组为1.35g/kg(体质量)，小剂量组为0.675g/kg(体质量)。正常组给以蒸馏水于造模第8周开始给以上述药液灌胃，至第12周末，采集小鼠血清及肝组织进行检测。

取材及标本制备

小鼠给药结束后，摘除眼球取血，室温静置0.5h，血清析出后，至于离心机内6000r/min，10min离心，吸取血清置-20℃保存；并立刻完整摘取肝脏，经预冷的生理盐水漂洗，取左叶置于-70℃保存，以备制作肝组织匀浆；取肝组织右叶相同部位置于10％中性福尔马林液中常规固定，用于病理观测。

石蜡标本的制备

肝组织于10％中性福尔马林中固定24h后，取出切成1cm×1cm×3mm大小，流水冲洗过夜；梯度酒精脱水，分别为70％1h、80％1h、90％1h、95％(I)1h、95％(II)1h、无水乙醇(I)30min、无水乙醇(II)30min、无水乙醇(III)1h；二甲苯透明15min/次，直至透明为止；浸蜡：软蜡(I)1h、软蜡(II)1h、硬蜡1h；用硬蜡包埋，备用。

石蜡标本的切片

石蜡标本置于4℃放置5min后，取出，用切片机切4μm厚度，用毛笔置于42℃温水中进行展片，随后用洁净的载玻片进行捞片，石蜡切片于60℃烤片0.5h。

HE染色

石蜡切片于二甲苯中脱蜡10min，再换用新鲜的二甲苯脱蜡5min，无水乙醇5min，90％乙醇2min，70％乙醇2min，蒸馏水2min；苏木素染色液染色7min，0.5％盐酸溶液中分化数秒，浸自来水中冲洗去多余的染色液，至返蓝，蒸馏水再洗涤一遍；95％乙醇5s，伊红染色液染色1min；95％乙醇脱水2min，换用新鲜的95％乙醇再脱水2min，二甲苯透明5min，换用新鲜的二甲苯再透明5min，滤纸吸干残余的二甲苯，用60％中性树脂封片，进行观察。

肝组织H&E染色后，在光镜下观察组织切片的病理变化，将肝纤维化分为5级：0级：无肝纤维化；1级：纤维结缔组织仅仅局限于汇管区或汇管区扩大，有向肝小叶发展的倾向；2级：纤维结缔组织增生进入肝小叶2/3并有1级同样的改变；3级：纤维结缔组织进入肝小叶中央周围；4级：纤维结缔组织在全小叶多处弥漫性增生，假小叶形成，并有3级同样的改变。

免疫组织化学染色

石蜡切片于二甲苯中脱蜡10min，再换用新鲜的二甲苯脱蜡5min，无水乙醇5min，90％乙醇2min，70％乙醇2min，蒸馏水2min；用PBS(pH＝7.4)冲洗3次，每次3min；每张切片加50μL过氧化酶阻断溶液，湿盒中25℃下孵育0.5h，以阻断内源性过氧化物酶的活性，PBS(pH＝7.4)冲洗3次，每次3min；除去PBS液，每张切片加50μL正常非免疫动物血清，湿盒中25℃下孵育0.5h；除去血清，每张切片加50μL抗体，湿盒中25℃下孵育1h，PBS(pH＝7.4)冲洗3次，每次3min；除去PBS液，每张切片加50μL生物素标记的第二抗体，湿盒中25℃下孵育10min，PBS(pH＝7.4)冲洗3次，每次3min；除去PBS液，每张切片加50μL链霉菌抗生物素-过氧化物酶溶液，湿盒中25℃下孵育10min，PBS(pH＝7.4)冲洗3次，每次3min。除去PBS液，每张切片滴加100μL新鲜配制的DAB，室温下染色3min，镜检；自来水冲洗，苏木素复染，返蓝，梯度酒精脱水干燥，二甲苯透明，中性树脂封片。

VG染色

石蜡切片于二甲苯中脱蜡10min，再换用新鲜的二甲苯脱蜡5min，无水乙醇5min，90％乙醇2min，70％乙醇2min，蒸馏水2min，苏木素染色5min，分化并水洗至切片返蓝，滴加VG染色液染5min，95％酒精分化，无水酒精脱水，二甲苯透明，中性树脂封片。

数据统计

所有数值均以均值±标准偏差表示，采用SPSS11.5软件进行统计分析，P＜0.05为差异具有显著性意义，P＜0.01为差异具有极显著性意义。

结果

1、小鼠一般情况及肝脏外观

正常组大鼠生长良好，饮食正常，体重自然增加，毛发整齐有光泽，二便如常。模型组精神萎糜，活动逐渐减少，饮食减少，体重增加减少，或体重下降，皮毛蓬乱没有光泽，多睡少动，尿液黄，有腹水出现。鳄鱼鳞治疗组状态明显好于模型组，小鼠毛发光亮，饮食活动正常，体重有一定程度的增加，近似正常组。

正常组小鼠肝脏深红，表面光滑，边缘锐利，质地较软。模型组小鼠肝脏肿胀，颜色偏灰，表面粗糙，有颗粒结节状，油腻，边缘钝，质地较硬，个别肝脏表面可见黄色脂滴，与周围器官粘连。鳄鱼鳞治疗组的小鼠肝脏表面光滑，较红，边缘锐利，无颗粒结节状，且与周围器官无粘连，明显好于模型组。

2、HE染色

正常组小鼠肝组织无异常表现，肝细胞排列整齐，肝小叶结构完整、清晰，肝细胞形态正常，肝脏的正常结构：肝脏被膜为薄层结缔组织，肝实质由肝小叶和门管区组成。肝小叶成多边的棱柱体，中央有一条中央静脉通过，周围为放射状排列的肝细胞索。肝小叶边缘的肝细胞排列成环形肝板，为界板。肝细胞索间或与肝细胞界板间相互吻合成网状支架，将肝实质分隔成许多具有类似形态和功能的基本单位—肝小叶。肝细胞条索之间相互吻合成网，之间有窦状隙和肝血窦，其内皮细胞分布规则。门管区主要为结缔组织，含有小叶间动脉、静脉和胆管，可有一定量的淋巴细胞、浆细胞分布。CCl₄模型组小鼠肝组织中可见肝小叶正常结构消失，汇管区和小叶间有增生的胶原纤维，正常肝小叶被分割成大小不同的细胞团，假小叶开始出现，肝索排列紊乱，门管区及小叶内可见淋巴细胞浸润，肝窦扩张，中央静脉位置异常，肝细胞坏死明显，细胞核消失，肝血窦内淤血明显。鳄鱼鳞治疗各组小鼠的肝细胞变性坏死有不同程度的好转，纤维增生减轻，炎症细胞浸润较少，肝细胞条索开始出现，肝小叶正常结构开始恢复，较模型组有明显好转。

小鼠肝纤维化分级见表1，模型组小鼠肝纤维化程度记分明显高于正常组，且有极显著差异，造模成功(P＜0.01)，鳄鱼鳞不同剂量灌胃组小鼠肝纤维化程度记分低于模型组，其中大剂量组和中剂量组记分有极显著性差异(P＜0.01)，小剂量组记分同模型组比无极显著性差异。

表1各实验组纤维化分级

注：vs正常组，^**P＜0.01，vs模型组^△△P＜0.01

3、免疫组化染色结果

抗体α-SMA、TGF-β1表达位点均为肝细胞胞浆，着色为棕褐色。α-SMA在正常肝组织中几乎不表达；模型组：主要表达在汇管区，纤维间隔及增生的纤维组织，在肝小叶中大量表达；鳄鱼鳞治疗各组：α-SMA阳性表达位置与模型组相似，但是数量有不同程度地减少，阳性染色强度也较模型组明显减弱。

TGF-β1在正常肝组织中呈低水平表达，在汇管区和静脉处有少量阳性着色；模型组：在肝组织小叶中的纤维间隔、坏死的肝细胞，炎症细胞及其周围细胞中大量表达；鳄鱼鳞治疗各组：阳性表达位置与模型组相似，但是表达强度及面积显著减少。

4、VG染色结果

如图3-5，VG染色后，细胞核呈深蓝色，胶原纤维呈红色。正常组：肝组织完整，未见胶原纤维组织增生。模型组：肝小叶结构遭到破坏，肝索排列混乱，汇管区内大量纤维组织增生，并且深入肝组织内，分割肝小叶，部分有假小叶生成；鳄鱼鳞治疗组：汇管区内胶原纤维增生减少，未见假小叶形成，纤维间隔断裂、不连接。

实验结果显示：鳄鱼鳞治疗后，小鼠肝纤维化等级降低，胶原含量及分布减少，说明鳄鱼鳞能降低I、III型胶原的表达，调节ECM生成与降解，保护肝组织免受有害物质的侵害以达到抑制纤维化的作用。

模型组的TGF-β1大量表达，染色为强阳性，鳄鱼鳞治疗组TGF-β1表达有不同程度的减少，染色强度及面积也较模型组有明显改善，表明鳄鱼鳞能通过抑制TGF-β1的生成而发挥抗肝纤维化的作用。

模型组α-SMA大量表达，而鳄鱼鳞治疗组的α-SMA有不同程度的减少，阳性面积及染色强度都有所减少，表明鳄鱼鳞能降低肝纤维化小鼠肝组织中活化的HSC数目及向肌成纤维细胞转化的进程，从而达到逆转肝纤维化的作用。********

试验二：鳄鱼鳞提取物对肝纤维化小鼠血清指标的作用

材料

1、药品与耗材

小鼠血清；白蛋白ALB(溴甲酚绿比色法)、血清总胆红素TBIL、谷丙转氨酶ALT(赖氏法)、谷草转氨酶AST(赖氏法)检测试剂盒均购自南京建成生物工程研究所；透明质酸(HA)、III型胶原(C-III)、层粘连蛋白(LN)、IV型胶原(C-IV)均购自Groundwork Biotechnology Diagnosticate Ltd.；BCA蛋白浓度测定试盒购自碧云天生物技术研究所。

2、仪器

溶液配制与实验方法

1、溶液配制

2、实验方法

白蛋白(溴甲酚绿比色法)检测方法

充分混匀，在室温中放置10min，628nm处，1cm光径，空白管调零，测各管吸光度值。

计算公式：蛋白含量(g/L)＝测定管吸光值/标准管吸光度×白蛋白标准品。

总胆红素测定

混匀，600nm，1cm光径比色，空白管调零，读各管OD值，在标准曲线上查出相应的胆红素浓度。

计算公式：血清总胆红素(μmol/L)＝总胆红素管的吸光度×228。

ALT测定方法

混匀，室温放置5min，505nm波长，蒸馏水调零，测各管吸光度，测定管吸光度减去对照管吸光度之差值，由标准曲线，测得相应的ALT活力单位。

标准曲线的制备：

室温放置10min，505nm波长，蒸馏水调零，测各管吸光度，各管吸光度减去零管吸光度，所得差值为纵坐标，相应的卡门氏单位为横坐标，作坐标图。1卡门氏单位＝0.482IU/L，25℃。

AST测定方法同上。

HA测定方法

1.在预涂抗体的酶标板的每孔中加入100μL血清或者标准品。

2.每孔中加入50μL酶联物，完全混匀，于37℃下孵育1h。

3.吸弃孵育混合液，用双蒸水冲洗3次，甩干。

4.每孔加入50μL底物A和50μL底物B，于20-25℃下孵育15min。

5.每孔加入50μL终止液，混匀，30min内于450nm下测OD值。

计算方法：每次测得的吸光值为B，则标准品0的吸光值为B0，根据A450测得结果，做各标准品浓度相对于％B/B0的logit-log图，logit＝ln(B/B0)/(1-B/B0)。

LN、C-III、C-IV测定方法同上。

数据统计

所有数值均以均值±标准偏差表示，采用SPSS11.5软件进行统计分析，P＜0.05为差异具有显著性意义，P＜0.01为差异具有极显著性意义。

结果

1、各组小鼠肝功检测结果

与正常组相比，模型组TBIL、AST、ALT的值显著升高，ALB的值显著下降(P＜0.01)，鳄鱼鳞治疗组TBIL、AST、ALT的值有不同程度地降低，ALB显著上升，且和模型组相比有极显著差异(P＜0.01)，见表2。

表2各实验组小鼠肝功检测结果

Vs正常组：^△p＜0.05，^△△p＜0.01 Vs模型组：^*p＜0.05，^**p＜0.01

2、各组小鼠肝纤维化血清标志物检测

与正常组相比，模型组HA、LN、C-III、C-IV的值显著升高(P＜0.01)，鳄鱼鳞治疗组HA、LN、C-III、C-IV的值有不同程度地降低，且和模型组相比有极显著差异(P＜0.01)，见表3。

表3各实验组小鼠纤维化血清标志物结果

Vs正常组：^△p＜0.05，^△△p＜0.01 Vs模型组：^*p＜0.05，^**p＜0.01

实验结果显示：鳄鱼鳞治疗组小鼠血清中的ALB有显著地上升，AST、ALT、TBIL和模型组相比有显著下降，表明鳄鱼鳞有降酶保肝，避免肝细胞膜受到损害的功能，达到治疗肝纤维化的作用。

本实验综合评价了小鼠血清中标志物的水平，模型组的LN、HA、C-III及C-IV较正常组显著升高，而鳄鱼鳞治疗组较模型组明显降低，表明鳄鱼鳞能改善肝脏的微循环，抑制肝脏内胶原的生成及胶原分泌细胞的增殖，减少ECM的沉积来达到治疗肝纤维化的作用。

试验三：鳄鱼鳞提取物对肝组织氧化指标的作用

实验方法

组织匀浆的制备

肝组织左叶取0.2g，加PBS冰浴研磨，制备成10％的组织匀浆，4℃4000r，10min离心，取上清，备用。

BCA蛋白浓度测定

取0.5mg/mL的蛋白标准品，按照0、1、2、4、8、12、16、20μL加到96孔板中，用蒸馏水补足到20μL，另取4μL10％的组织匀浆加入96孔的样品空中，蒸馏水补足20μL，各孔加入200μLBCA工作液，37℃放置30min。562nm下测定吸光值，根据标准曲线计算蛋白浓度。

总SOD活性检测(NBT法)

37℃孵育30min，560nm测定吸光度

酶活计算方法：抑制百分率＝[(A空白对照1-A空白对照2)-(A样品-A空白对照3)]/(A空白对照1-A空白对照2)×100％，抑制百分率为50％时，反应体系中的SOD酶活力定义为一个酶活力单位。待测样品中SOD酶活力单位＝检测体系中SOD酶活力单位＝抑制百分率/(1-抑制百分率)units。再根据样品的蛋白浓度和稀释倍数，将SOD活力单位换算为U/g或U/mg蛋白。

MDA检测

混匀后，沸水浴加热15min。水浴冷却至室温，1000g室温离心10min，取200μL上清加入到96孔板中，随后用酶标仪在532nm测定吸光度。

计算方法：取适量标准品用蒸馏水稀释至1、2、5、10、20、50μM制作标准曲线，通过标准曲线计算出MDA含量后，通过单位重量的蛋白含量来表示最初样品中的MDA含量，结果用μmol/mg蛋白来表示。

Hyp测定方法

消化：

混匀，37℃水浴3h

羟脯氨酸测定：

混匀，60℃水浴15min，流水冷却后，3500转/分离心10min，取上清。550nm处测吸光值。

计算方法：

数据统计

所有数值均以均值±标准偏差表示，采用SPSS11.5软件进行统计分析，P＜0.05为差异具有显著性意义，P＜0.01为差异具有极显著性意义。

结果

实验结果显示：与正常组相比，模型组肝组织匀浆的SOD降低，MDA、Hyp的值显著升高(P＜0.01)，鳄鱼鳞治疗组SOD升高，且MDA、Hyp的值有不同程度地降低，且和模型组相比有极显著差异(P＜0.01)，见表4。

表4各实验组小鼠肝组织氧化指标结果

Vs正常组：^△p＜0.05，^△△p＜0.01 Vs模型组：^*p＜0.05，^**p＜0.01

实验结果显示：模型组小鼠的SOD降低，MDA升高，经过治疗后，SOD含量升高、MDA降低，表明鳄鱼鳞能减缓肝组织脂质过氧化进程，增强抗氧化能力，进而保护肝细胞不受损伤，从而发挥抗肝纤维化的作用。

本实验模型组小鼠的Hyp值显著升高，与正常组形成显著对比，表明肝纤维化的肝组织中胶原纤维含量增多，治疗后各组Hyp含量降低，表明鳄鱼鳞可以降低肝组织纤维化程度。

试验四：鳄鱼鳞对肝纤维化指标基因表达的作用

实验方法

Western blotting鉴定方法

1.将各组小鼠血清按序加入样品缓冲液，沸水煮5min后上样，进行浓缩胶5％，分离胶12％的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，用预染marker作为指示。

2.电泳完毕后将蛋白从聚丙烯酰胺凝胶转移到甲醇浸泡过的硝酸纤维素(PVDF)膜上，250mA恒流电转2h。

3.将膜浸泡于blocking buffer中室温封闭1h(振荡最好)，倾去液体，将膜在TBST中漂洗一下。

4.将膜浸入一抗溶液中孵育(用TBST配制，1∶500稀释)室温1h。

5.将膜取出用TBST振荡漂洗3×5min，浸入HRP标记的二抗溶液(配制同一抗，一般稀释为1∶1000～1∶50000)中室温孵育1-2h。

6.TBST振荡漂洗3×5min，孵育ECL后进行显影、定影。

结果

Western blotting检测可知，与正常对照组相比，模型组小鼠血清中α-SMA、C-I、C-IV、TGF-β1大量表达，而不同用药治疗组小鼠血清中的表达有不同程度的降低，表达量减少，且在实验浓度范围内呈量效依赖关系。

实验结果显示：鳄鱼鳞煮液可以减少小鼠血清中α-SMA、TGF-β1、C-I、C-IV的表达，表明鳄鱼鳞能够抑制HSC的活化，阻断TGF-β1在HSC内的信号转导，阻止HSC向MFB转化，改善肝组织炎症坏死程度，促进ECM的降解，减少胶原的生成，有效地减轻肝纤维化程度，与之前实验结果相一致。

上述试验1-4中选用的鳄鱼鳞煮液由实施例1所述制备方法制得。

综上所述，本发明的鳄鱼鳞提取物能降酶保肝，改善肝脏的微循环，减缓肝组织脂质过氧化进程，增强抗氧化能力，进而避免肝细胞膜受到损害，降低活化的HSC数目及HSC向肌成纤维细胞转化的进程，抑制TGF-β1的生成，减少肝脏内胶原的生成及胶原分泌细胞的增殖，调节ECM的生成与降解，发挥逆转肝纤维化的作用。

具体实施方式：

通过以下具体实施例对本发明作进一步说明，但不作为对本发明的限制。

《实施例1》鳄鱼鳞提取物

本发明所述鳄鱼鳞提取物，经过以下方法制备而成：

称取鳄鱼鳞粉末1g，加10mL蒸馏水，煮沸并回流提取2h，离心8000r/min，10min，取上清液，调pH为7，制备成生药浓度为0.1g/mL的粗提取液，在先后用0.45μm和0.22μm的微孔滤膜过滤，除菌，分装冻存。

其中，鳄鱼鳞粉术可以从市场上购买，本发明所用的鳄鱼鳞胶囊来自泰国是拉差龙虎园。

《实施例2》药物组合物

一种药物组合物，包括鳄鱼鳞提取物和其他药学上可接受的载体。其重量比为1-99％∶1-99％。所述药物组合物可以制备成任何可药用的剂型。如：片剂，颗粒剂，注射剂等。

《实施例3》药物组合物的应用

实施例2所述的药物组合物在治疗肝纤维化方面具有很好的效果。

Claims (8)

1.鳄鱼鳞提取物在制备治疗肝纤维化药物中的应用，其提取物是将鳄鱼鳞加水煮沸，离心取上清液，调pH至7，得粗提取液，经微孔滤膜过滤，除菌分装制成。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述提取物通过降低I、III型胶原的表达，调节ECM生成与降解，保护肝组织免受有害物质的侵害以达到抑制肝纤维化的作用。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述提取物通过抑制TGF-β1的生成而发挥抗肝纤维化的作用。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述提取物通过降低肝纤维化肝组织中活化的HSC数目及向肌成纤维细胞转化的进程，以达到逆转肝纤维化的作用。

5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述提取物通过降酶保肝，避免肝细胞膜受到损害，达到治疗肝纤维化的作用。

6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述提取物通过改善肝脏的微循环，抑制肝脏内胶原的生成及胶原分泌细胞的增殖，减少ECM的沉积来达到治疗肝纤维化的作用。

7.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述提取物通过减缓肝组织脂质过氧化进程，增强抗氧化能力，进而保护肝细胞不受损伤，发挥抗肝纤维化的作用。

8.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述提取物通过抑制HSC的活化，阻断TGF-β1在HSC内的信号转导，阻止HSC向MFB转化，改善肝组织炎症坏死程度，促进ECM的降解，减少胶原的生成，有效地减轻肝纤维化程度。