CN101156873A - 一种来源于暹罗鳄白细胞抗菌活性物质及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种来源于暹罗鳄白细胞抗菌活性物质的制备方法，包括：(1)从暹罗鳄采集外周血，加入抗凝素，用明胶溶液沉淀红细胞，取上层离心，收集白细胞；(2)用超声波破碎收集的白细胞，并加入等体积5～15体积％的乙酸溶液，震荡10～16小时，离心分别取上清和沉淀；沉淀部分加0.01～0.1体积％乙酸溶解，即为暹罗鳄白细胞提取物1^#；上清部分先透析，再真空冷冻干燥，加0.01～0.1体积％乙酸溶解，即为暹罗鳄白细胞提取物2^#。本发明通过对暹罗鳄进行深层次的研究，从暹罗鳄的白细胞中提取到抗菌活性物质，该抗菌活性物质可用于开发抗菌药物。这弥补了现有此方面技术的空白。同时，本发明的抗菌活性物质的制备方法简单、方便、适于大规模生产。

Description

一种来源于暹罗鳄白细胞抗菌活性物质及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种抗菌活性物质，具体涉及一种来源于暹罗鳄白细胞抗菌活性物质及其制备方法。

背景技术

暹罗鳄(Crocodylus siamensis)是广泛生长于越南、老挝、缅甸、泰国、柬埔寨、文莱、马来西亚、印度尼西亚等南亚国家的野生爬行类动物，具有体形大、繁殖力强、生长快、抗病力强等特点。近年来，我国相继从泰国、越南等地引进大量的暹罗鳄，并成功进行了人工养殖。暹罗鳄是爬行类动物，作为由水生到陆生的过渡型，是一种重要的生物资源，具有食用或药用价值。我国对爬行类动物的药用历史悠久，早在明代李时珍《本草纲目》中就有记载，但是，总体上讲，传统的做法基本上还是一种粗放式的、对资源造成很大浪费的非持续性开发利用，对动物体内活性物质的分离定性、定量研究工作进行得很少。

作为爬行类动物代表的鳄鱼通常栖息在环境恶劣的丛林、湿地中，它们即使受到严重的创伤，也能够迅速的痊愈，极少发生严重感染。那么，鳄鱼体内是否存在一些功能强劲的抗菌活性物质呢？Shaharabany et al(1999)曾报道：尼罗鳄(Crocodylus niloticus)的组织提取物具有抗菌活性。澳大利亚科学家Brown(2001)初步确定杂交鳄血液中含有抗微生物的蛋白活性物质，这些活性物质对金黄葡萄球菌和艾滋病病毒都具有很好的抑制和杀灭作用；Merchant(2006)等研究发现，美国短吻鳄(Alligator mississippiensis)的白细胞提取物具有明显的抗细菌、真菌和病毒的活性，对革兰氏阴性菌中的志贺杆菌和弗氏柠檬酸杆菌有明显的抑止作用；对大肠杆菌，绿脓杆菌和猪霍乱沙门氏菌有中等程度的抑止作用；对革兰氏阳性菌粪链球菌，猩红热菌有明显的抑止作用，但是对金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌则没有观察到抑制作用，并且可以抑制阿米巴变形虫和HIV-1_IIIB、HIV-1、HSV-1_HF病毒的生长。马海萍(2006)从活体湾鳄(Crocodylusporosus)中制备得到鳄鱼血浆，研究结果表明鳄鱼血浆具有体外抗菌作用及体内外抗肿瘤活性，且抗菌能力强于人血浆，抗菌谱比较广。另外，鳄鱼血浆能改善免疫功能低下小鼠的免疫功能，与抗肿瘤化疗药物顺铂联合使用可起到增效减毒的效果，具有预防治疗肿瘤的作用。

基于我国已经对暹罗鳄进行了大规模的特种养殖，急需对其进行深层次、高值化的开发利用，以及国外对某些鳄鱼品种抗菌活性物质的研究和开发的前期工作，我们对暹罗鳄开展了抗菌活性物质的提取和功能鉴定研究，为进一步开发利用暹罗鳄资源，制备绿色高效的抗菌剂奠定基础。

发明内容

本发明的目的在于提供一种具有良好抗菌活性的来源于暹罗鳄白细胞抗菌活性物质。

本发明的另一个目的是提供上述来源于暹罗鳄白细胞抗菌活性物质的制备方法。

本发明的暹罗鳄白细胞抗菌活性物质的制备方法，包括如下步骤：

(1)从暹罗鳄采集外周血，加入抗凝素，用明胶溶液沉淀红细胞，取上层离心，收集白细胞；明胶溶液优选3％浓度(1克/100毫升)。

(2)用超声波破碎收集的白细胞，并加入等体积5～15％(体积百分比)的乙酸溶液，震荡10～16小时，离心分别取上清和沉淀；沉淀部分直接加0.01～0.1％(体积百分比)乙酸溶解，即为暹罗鳄白细胞提取物1^#；上清部分先透析，再真空冷冻干燥，加0.01～0.1％(体积百分比)乙酸溶解，即为暹罗鳄白细胞提取物2#。

在上述制备方法中，步骤(1)所述的暹罗鳄优选健康强壮，6年生以上，体重大于50kg的暹罗鳄。

在上述制备方法中，步骤(1)所述的抗凝素优选肝素钠溶液。

在上述制备方法中，步骤(2)所述的超声波破碎的时间优选5min，超声波20s，间隔20s。所述的透析优选3.5kD的透析袋进行透析。

本发明所制备得到的来源于暹罗鳄白细胞抗菌活性物质包括暹罗鳄白细胞提取物1^#和暹罗鳄白细胞提取物2^#。暹罗鳄白细胞提取物1^#对8种革兰氏阴性菌(Escherichia coli、Vibrio cholerae、Vibrioalginolyticus、Vibrio vulnificus、Vibrio parahemolyticus、Aeromonassobria、Aeromonas hydrophila、Pasteurella pneumotropica)和2种革兰氏阳性菌(Staphylococcus aureus、Streptococcus iniae)均有明显的抑菌活性；暹罗鳄白细胞提取物2^#只对2种革兰氏阳性菌(S.aureus、S.iniae)有很好的抑菌活性。暹罗鳄白细胞提取物1^#起效迅速，3min就表现出显著的杀菌效果。理化特性试验结果表明，白细胞提取物1^#中的活性物质的特性为：热稳定，对蛋白酶K不敏感，对EDTA敏感，对氯仿有一定的敏感性，分子量在5kDa以下。

暹罗鳄白细胞提取物1^#抗小鼠体内链球菌感染的结果表明：若先用链球菌腹腔注射小鼠(100μl×只^-1)，表现出明显病理症状后用浓度梯度提取物1^#(2.2，0.22，0.022mg/ml)腹腔注射小鼠(100μl×只^-1)，相对保护率分别为77.8％、55.6％、44.4％；若先将链球菌与浓度梯度提取物1^#(2.2，0.22，0.022mg/ml)在体外等体积混合，再腹腔注射小鼠(100μl×只^-1)，相对保护率分别为5.6％、88.9％、77.8％；若用链球菌肌肉注射小鼠左腿(100μl×只^-1)，同时浓度梯度提取物1^#(2.2，0.22，0.022mg/ml)肌肉注射小鼠右腿(100μl×只^-1)，相对保护率分别为77.8％、66.7％、44.4％。

通过扫描电镜观察发现：没有处理过的E.coli和S.aureus表面光滑、形状饱满，经暹罗鳄白细胞提取物1^#处理后，菌体表面变得粗糙，细胞壁有内陷，可见部分内容物溢出，有的细胞严重萎缩、变形，推测其作用机理与影响膜的通透性有关。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明通过对暹罗鳄进行深层次的研究，从暹罗鳄的白细胞中提取到良好的抗菌活性物质，该抗菌活性物质可用于开发抗菌药物。这弥补了现有此方面技术的空白。同时，本发明的抗菌活性物质的制备方法简单、方便、适于大规模生产。

附图说明

图1为暹罗鳄白细胞提取物1^#对10种细菌的抑菌活性；

图2为暹罗鳄白细胞提取物1^#对3种细菌的抑菌活性；

图3为暹罗鳄白细胞提取物1^#对大肠杆菌抗菌效力的动力学测定；

图4为暹罗鳄白细胞提取物1^#抗小鼠体内链球菌感染的抑菌活性；

图5为暹罗鳄白细胞提取物1^#抗小鼠体内链球菌感染后的切片观察；

图6为暹罗鳄白细胞提取物1^#处理S.aureus后的扫描电镜观察。

其中，图1中，1.大肠埃希氏菌；2.海豚链球菌；3.多杀巴斯德菌；4，温和气单胞菌；5.嗜水气单胞菌；6.副溶血弧菌；7.创伤弧菌；8.溶藻弧菌；9.霍乱弧菌；10.金黄色葡萄球菌；11.阴性对照组。结果以抑菌圈大小来表示，单位为mm，每组3个平行；不同字母代表差异显著(P＜0.05，LSD多重比较)。

图2中，细菌从左到右依次为：A.金黄色葡萄球菌；B.嗜水气单胞菌；C.温和气单胞菌。每个平板上：1号孔、3号孔和5号孔中加入20μl暹罗鳄外周血白细胞粗提物，2号孔、4号孔和6号孔中加入20μl 0.1体积％的醋酸。结果以抑菌圈大小来表示，单位为mm，每组3个平行；不同字母代表差异显著(P＜0.05，LSD多重比较)。

图4中，1、6、11为2.2mg/ml白细胞提取物；2、7、12为0.22mg/ml白细胞提取物；3、8、13为0.022mg/ml白细胞提取物；4、9、14为各自的阴性对照组；5、10、15为各自的空白对照组。结果以相对保护率来表示，每组3个平行。

图5中，A为小鼠体内链球菌感染后，B为白细胞提取物抗小鼠体内链球菌感染后，C为小鼠体内链球菌感染后脑组织切片，D为白细胞提取物抗小鼠体内链球菌感染后脑组织切片，E为小鼠体内链球菌感染后肝组织切片，F为白细胞提取物抗小鼠体内链球菌感染后肝组织切片。

图6中，A为S.aureus未处理，B为S.aureus处理30min，C为S.aureus处理1hr，D为S.aureus处理1hr。

具体实施方式

实施例1暹罗鳄白细胞提取物的制备

选择健康健壮，7年生，60kg的暹罗鳄，从暹罗鳄采集外周血，1％(1克/100毫升)肝素钠溶液抗凝。用3％(1克/100毫升)明胶溶液沉淀红细胞，取上层离心，收集白细胞。超声波破碎悬液中的白细胞(总时间5min，超声波20s，间隔20s)，并加入等体积5～15体积％的乙酸溶液，震荡(250rpm)过夜10～16小时，离心分别取上清和沉淀。沉淀部分直接加0.01～0.1体积％乙酸溶解，即为鳄鱼白细胞提取物1^#；上清部分用3.5kD的透析袋透析48hr，真空冷冻干燥，加适量0.01～0.1体积％乙酸溶解，即为暹罗鳄白细胞提取物2^#。

暹罗鳄白细胞提取物总蛋白含量测定：

用Bradford法测定白细胞提取物的总蛋白含量，标准牛血清白蛋白标准品用于制作标准曲线。具体方法按试剂盒说明书进行操作。实施例2暹罗鳄白细胞提取物1^#对10种细菌的体外抑菌试验

参照琼脂板孔穴扩散法。从平板培养基上挑取单菌落于LB液体培养基中，37℃或28℃振荡培养，测OD₆₀₀值。吸取培养好的菌液30μl置于100ml锥形瓶中，加入30ml经融解并冷却至45～50℃的LB或BHI固体培养基，迅速振荡摇匀，使菌体均匀分散，随即倒入直径为90mm×90mm的培养皿中，凝固后用内径为4mm×4mm的打孔器打孔。每孔中各加入20μl暹罗鳄外周血白细胞提取物1^#或0.1体积％乙酸溶液。在室温下待样品完全扩散，置于37℃或28℃温箱中培养24～72hr，观察并测量抑菌圈直径，结果见图1、图2。暹罗鳄外周血白细胞提取物对于本次实验所选用的10种细菌的活性均表现出了不同程度的抗菌效力。对S.iniae和E.coli的抗菌效力最强，对P.pneumotropica、A.sobria、A.hydrophila的抗菌效力较弱，；对V.parahemolyticus、yAlginolyticus、S.aureus、V.vulnifiCus和V.cholerae的抗菌效力最弱，作为阴性对照的0.1％乙酸溶液没有表现出任何抗菌效力。

实施例3暹罗鳄白细胞提取物1^#对大肠杆菌抗菌效力的动力学测定

将培养好的大肠杆菌菌液(大肠杆菌的培养方法和技术同3)与暹罗鳄白细胞提取物1^#或对照品等体积混合，分别作用1，2，3，4，5，10min后，从混合物中各取出100μl均匀涂布在LB固体培养基的表面，待样品完全扩散后，37℃倒置培养24hr，测定CFUs，并进行统计分析，结果见图3。图3中，结果以菌落数来表示，单位为×10⁹CFUs×ml^-1，每组3个平行；不同字母代表差异显著(P＜0.05，LSD多重比较)。结果显示：暹罗鳄外周血白细胞提取物抗菌作用迅速，在其与大肠杆菌作用3min内，即表现出明显的抗菌效力。

实施例4暹罗鳄白细胞提取物1^#抗小鼠体内链球菌活性检测

将暹罗鳄白细胞提取物1^#0.1体积％的乙酸悬液(2.2μg/ml)，离心20min(4℃，8000g)后取沉淀，用0.1体积％的乙酸重悬，将悬液调整成3个浓度梯度(分别为10²、10¹、10⁰μg/ml)备用，链球菌培养和检测后，将浓度调整成5倍LD₅₀备用。

各组小鼠分别置于不同的饲养箱中，注射后每天至少观察两次，每24hr测量一次体重，连续7D，记录发病、死亡及体重变化情况。7D后取濒死小鼠的免疫组织进行涂片，并断尾取血制成血液涂片，革兰氏染色镜检，确定死因是否为海豚链球菌感染，拍片并保存，结果见图4、图5。根据攻毒后7d内小鼠的死亡记录表明：在死亡数上实验组和对照组有较大差异：阴性对照组，从攻毒后2d陆续出现死亡，并持续7d，病鼠在死亡前呈明显的链球菌症状；病鼠处死后，取脑组织及血液进行涂片，革兰氏染色后镜检发现有大量的链球菌。而浓度为2.2mg/ml和0.2mg/ml的暹罗鳄白细胞提取物对小鼠体内链球菌感染的相对保护率比较理想。

实施例5先感染，再治疗的保护效果

将75只小鼠随机分成5组，每组15只，第1、2、3组为实验组，第4组为阴性对照组，第5组为空白对照组。第1、2、3组先腹腔注射链球菌(浓度为5倍LD₅₀，100μl×只^-1)，72hr后表现出明显病理症状3个浓度梯度(2.2/0.22/0.022mg/ml)提取物1^#各腹腔注射小鼠15只(100μl×只^-1)；第4组先腹腔注射链球菌(浓度为5倍LD₅₀，100μl×只^-1)，72hr后表现出明显病理症状乙酸腹腔注射15只(浓度为0.1体积％，100μl×只^-1)；5组乙酸腹腔注射15只(浓度为0.1体积％，100μl×只^-1)。结果显示：实验组的相对保护率分别为77.8％、55.6％、44.4％，阴性对照组和空白对照组的相对保护率均为0.0％，说明暹罗鳄白细胞提取物1^#抗小鼠体内链球菌的保护效果比较理想。

实施例6先体外混合，再注射的保护效果

将75只小鼠随机分成5组，每组15只，第1、2、3组为实验组，第4组为阴性对照组，第5组为空白对照组。第1、2、3组各腹腔注射链球菌(浓度为5倍LD₅₀)与提取物1^#体外等体积混合后的浓度梯度混合物(2.2/0.22/0.022mg/ml)15只(100μl×只^-1)；第4组腹腔注射链球菌(浓度为5倍LD₅₀)与乙酸(浓度为0.1体积％)在体外等体积混合物；5组乙酸腹腔注射小鼠15只(浓度为0.1体积％，100μl×只^-1)。结果显示：实验组的相对保护率分别为55.6％、88.9％、77.8％，阴性对照组和空白对照组的相对保护率均为0.0％，说明暹罗鳄白细胞提取物1^#抗小鼠体内链球菌的保护效果比较理想。

实施例7感染和治疗同时进行的保护效果

将75只小鼠随机分成5组，每组15只，第1、2、3组为实验组，第4组为阴性对照组，第5组为空白对照组。第1、2、3组各左腿肌肉注射链球菌(浓度为5倍LD₅₀)，同时右腿肌肉注射浓度梯度提取物1^#(2.2/0.22/0.022mg/ml)15只(100μl×只^-1)；第4组左腿肌肉注射链球菌(浓度为5倍LD₅₀)，右腿肌肉注射乙酸(浓度为0.1体积％，100μl×只^-1)；第5组肌肉注射乙酸(浓度为0.1体积％，100μl×只^-1)。结果显示：实验组的相对保护率分别为77.8％、66.7％、44.4％，阴性对照组和空白对照组的相对保护率均为0.0％，说明暹罗鳄白细胞提取物1^#抗小鼠体内链球菌的保护效果比较理想。

实施例8暹罗鳄白细胞提取物1^#热稳定性试验

将白细胞提取物1^#置于100℃(水浴)条件下分别处理10min、20min和30min后，迅速在冰上冷却，离心，取上清检测其抑菌活性，以不加热处理作为对照，每组3个平行。结果显示，白细胞提取物1^#对热具有稳定性。

实施例9暹罗鳄白细胞提取物1^#蛋白酶的稳定性试验

白细胞提取物1^#用蛋白酶K(终浓度为1mg/ml)在37℃处理1hr，离心，取上清检测其抑菌活性，以不处理作为对照。结果显示，白细胞提取物1^#对蛋白酶K不敏感。

实施例10暹罗鳄白细胞提取物1^#氯仿的稳定性试验

白细胞提取物1^#与等体积的氯仿混合，振荡处理1hr，离心分层后，取上清检测抗菌活性。结果显示，白细胞提取物1^#对氯仿有一定的敏感性。

实施例11暹罗鳄白细胞提取物1^#EDTA的稳定性试验

将白细胞提取物1^#与0.5M EDTA作用20min后，测定其对大肠杆菌的抗菌效力，并与对照组的抗菌效力进行比较。结果显示，白细胞提取物1^#对EDTA具有一定的敏感性。

实施例12暹罗鳄白细胞提取物1^#的过滤和超滤处理

将白细胞提取物1^#在沸水浴中热处理10min，然后4℃下，10000rpm离心30min，取上清过0.22μm的滤膜，然后滤液加入15ml超滤离心管(MWCO 5000)，4℃下，5000rpm离心15min，收集截留液和滤过液，分别检测其对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌活性。结果显示，白细胞提取物1^#的滤过液对两种菌表现出明显的抑菌圈，截留液则没有活性，说明白细胞提取物1^#中活性成分的分子量大小在5kDa以下。

实施例13扫描电镜样品制备方法

样品处理：取适量菌液，离心取沉淀，加入30体积％的鳄鱼白细胞提取物，37℃下分别处理30min和1hr，以不处理作为对照。将白细胞提取物1^#离心，沉淀用pH8.0的PBS洗3次，每次15min；用2.5％(1克/100毫升)的戊二醛固定1hr；再用pH8.0的PBS洗6次，每次15min；依次用50体积％、70体积％、90体积％的乙醇脱水一次，每次10min，再分别用100体积％的无水乙醇和乙酸乙酯脱水2次，每次10min；临界点干燥后，装台，喷金；在热场发射环境扫描电镜-能谱-电子背散射衍射系统下观察样品的外貌形态，结果见图6。结果显示，没有处理过的S.aureus表面光滑、形状饱满，经白细胞提取物1^#处理后，菌体表面变得粗糙，细胞壁有内陷，可见部分内容物泌出，有的细胞严重萎缩、变形。

Claims (6)

1.一种来源于暹罗鳄白细胞抗菌活性物质的制备方法，其特征在于包括如下步骤：

(1)从暹罗鳄采集外周血，加入抗凝素，用明胶溶液沉淀红细胞，取上层离心，收集白细胞；

(2)用超声波破碎收集的白细胞，并加入等体积5～15体积％的乙酸溶液，震荡10～16小时，离心分别取上清和沉淀；沉淀部分直接加0.01～0.1体积％乙酸溶解，即为暹罗鳄白细胞提取物1^#；上清部分先透析，再真空冷冻干燥，加0.01～0.1体积％乙酸溶解，即为暹罗鳄白细胞提取物2^#。

2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤(1)所述的暹罗鳄为6年生以上，体重大于50kg的暹罗鳄。

3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤(1)所述的抗凝素为肝素钠溶液。

4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤(2)所述的超声波破碎的时间5min，超声波20s，间隔20s。

5.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤(2)所述的透析是采用3.5kD的透析袋进行透析。

6.一种来源于暹罗鳄白细胞抗菌活性物质，其特征在于由权利要求1所述方法制备而成。

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