CN102260664A

CN102260664A - 固定化全细胞催化剂及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN102260664A
Application number: CN2011101553408A
Authority: CN
Inventors: 梁晓亮; 王娟; 王波; 曾聪明; 孙勇; 文军
Original assignee: SYNCORE LABORATORIES (SHANGHAI) Co Ltd
Current assignee: SYNCORE LABORATORIES (SHANGHAI) Co Ltd
Priority date: 2011-06-10
Filing date: 2011-06-10
Publication date: 2011-11-30

Abstract

本发明涉及制药工业生物技术领域，公开了一种固定化全细胞催化剂的制备及在普利中间体（R）-2-羟基-4-苯基-丁酸合成中的应用。建立含有D型乳酸脱氢酶基因和甲酸脱氢酶基因的重组细胞，并固定，制备得到固定化全细胞催化剂。用这种催化剂合成赖诺普利的中间体（R）-2-羟基-4-苯基-丁酸，反应条件温和，作用专一，无副产物，在医药及食品等行业中均有应用价值。

Description

固定化全细胞催化剂及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于制药工业生物技术领域，涉及一种固定化全细胞催化剂的制备及在普利中间体（R）-2-羟基-4-苯基-丁酸合成中的应用。

背景技术

赖诺普利（Lisinopril）是一种抗高血压病药，具强力血管紧张素转换酶抑制作用。传统的合成方式是利用有机化学合成的路线（US 2007/0093664 A1，CN 1053437 C），污染大，成本高。

生物催化法中使用的辅酶NAD⁺可用于底物转化，但不可再生，需要补充入新的辅酶。因此，若能使反应过程中辅酶再生，则可以大大降低成本。

发明内容

本发明旨在提供一种固定化全细胞催化剂及制备方法。

本发明还提供了应用上述固定化全细胞催化剂制备中间体（R）-2-羟基-4-苯基-丁酸的方法。

本发明技术方案为，建立含有D型乳酸脱氢酶基因和甲酸脱氢酶基因的重组细胞，并固定，制备得到固定化全细胞催化剂。用这种催化剂合成赖诺普利的中间体（R）-2-羟基-4-苯基-丁酸。

一种固定化全细胞催化剂的制备方法，包括以下步骤：

（1）将含有D型乳酸脱氢酶基因和甲酸脱氢酶基因的重组质粒转入大肠杆菌宿主菌，得到重组细胞；

（2）将重组细胞与固定剂溶液混合，铺于平面上，25～35℃下保温1～1.5小时，并用盐溶液稳定后洗涤；

固定剂为聚乙二醇与聚丙烯酰胺、聚乙烯醇或海藻酸钙中至少一种的混合物；

聚乙二醇的浓度为0.08～0.1g/ml；聚丙烯酰胺、聚乙烯醇或海藻酸钙浓度为0.1～0.2 g/ml。

优选的，步骤（2）所述重组细胞湿重与聚乙二醇重量比为1：1～1：2。

所述的D型乳酸脱氢酶基因和甲酸脱氢酶基因序列分别如SEQ ID No.1及SEQ ID No.2所示；优选为来自上皮葡萄球菌和路德酵母。

通过上述方法所制备得到的固定化全细胞催化剂可用于制备中间体（R）-2-羟基-4-苯基-丁酸。

制备的步骤包括：

（1）将固定化全细胞催化剂与（R）-2-羟基-4-苯基-丁酸钠盐、甲酸铵和NAD⁺（烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，辅酶I）与磷酸缓冲液混合，在ph6.0～8.0、25～40℃条件下反应1～10小时；反应混合液中固定化全细胞催化剂湿重浓度为10～500g/L，（R）-2-羟基-4-苯基-丁酸钠盐浓度为10～100mmol/L，甲酸铵浓度为50～250 mmol/L，NAD⁺浓度为0.05～0.5g/L。

（2）回收细胞，将反应液pH调节至2.5～3.5，用乙酸乙酯萃取，干燥过滤。

甲酸脱氢酶作为能使辅因子再生的酶。

由于固定化全细胞催化具有成本低，操作方便的优点，本发明将来自上皮葡萄球菌（Staphylococcus epidermidis ATCC 12228）的D型乳酸脱氢酶(D-lactate dehydrogenase, D-LDH)和来自路德酵母（Lodderomyces elongisporus NRRL YB-4239）的甲酸脱氢酶(Formate dehydrogenase, FDH, 辅酶再生用)克隆到重组大肠杆菌中共表达，并将重组细胞固定化，由固定化重组全细胞催化合成赖诺普利的中间体（R）-2-羟基-4-苯基-丁酸。

这种（R）-2-羟基-4-苯基-丁酸的合成方法属于生物合成法，可在无有机溶剂的条件下进行，反应条件温和，作用专一，无副产物，在医药及食品等行业中均有应用价值。

附图说明

图1为含有D型乳酸脱氢酶基因的重组质粒pACYCDuet-1-SeLDH的图谱。

图2为含有甲酸脱氢酶基因的重组质粒pET21a-LeFDH图谱。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步详细、完整地说明：

实施例1

包含来自上皮葡萄球菌（Staphylococcus epidermidis ATCC 12228）的D型乳酸脱氢酶（D-lactate dehydrogenase）和来自路德酵母（Lodderomyces elongisporus NRRL YB-4239）的甲酸脱氢酶的全细胞催化剂的制备：

（一）重组质粒pACYCDuet-1-SeLDH的制备：

按照本领域通用的方法（《分子克隆实验指南》，科学出版社，第3版）提取上皮葡萄球菌的基因组DNA，利用特异性引物扩增出D型乳酸脱氢酶基因片段，将此片段用限制性内切酶NcoI和HindIII做双酶切，用琼脂糖凝胶电泳纯化基因片段，与经相同限制酶消化的pACYCDuet-1连接并转化大肠杆菌宿主菌Top10细胞。挑取转化子接种LB液体培养基，37℃培养20小时，用质粒提取试剂盒（博大泰克）提取重组质粒。重组质粒图谱如图1所示。

（二）重组质粒pET21a-LeFDH的制备：

按照上述方法提取路德酵母的基因组DNA，利用特异性引物扩增出甲酸脱氢酶基因片段，将此片段用限制性内切酶NdeI和BamHI做双酶切，用琼脂糖凝胶电泳纯化基因片段，与经相同限制酶消化的pET-21a连接并转化大肠杆菌宿主菌Top10细胞。挑取转化子接种LB液体培养基，37℃培养20小时，用质粒提取试剂盒（博大泰克）提取重组质粒。重组质粒图谱如图2所示。

（三）重组菌株的制备：

将重组质粒pET21a-LeFDH转化大肠杆菌表达宿主BL21（DE3）的化学感受态细胞，这一质粒含有编码来自路德酵母的甲酸脱氢酶的基因。

将此重组大肠杆菌BL21（DE3）（pET21a-LeFDH）制成化学感受态细胞，用重组质粒pACYCDuet-1-SeLDH转化上述重组菌，该质粒含有来自上皮葡萄球菌的D型乳酸脱氢酶基因。这两个基因均在T7启动子的控制下表达，D型乳酸脱氢酶和甲酸脱氢酶的基因的序列在下文示出，即SEQ ID No.1和SEQ ID No.2，氨基酸序列为SEQ ID No.3和SEQ ID No.4。

（四）活性细胞的制备：

将大肠杆菌BL21（DE3）（pACYCDuet-1-SeLDH，pET21a-LeFDH）的一个菌落在加入了抗生素（100μg/ml氨苄青霉素和34μg/ml氯霉素）的5ml LB培养基中在37℃振荡（160rpm）培养过夜。以1：100的接种量转接该菌到100ml 新鲜LB培养基（含100μg/ml氨苄青霉素和34μg/ml氯霉素）中，37℃培养到OD₆₀₀到达0.8左右，加入0.1 mM IPTG诱导剂，在20℃振荡培养20小时。通过离心（10,000g，10分钟，4℃）收获细胞，弃去上清，将细胞用于生物转化实验或储存于-20℃。

实施例2

固定化全细胞制备：

将3.0克聚乙二醇溶解在35ml的水中，加入5.0克聚乙烯醇（PVA）并将温度升到90-95℃溶解。待聚乙烯醇完全溶解后，将温度降至25℃-30℃，加入4克重组细胞(湿重)，混合均匀，用一次性吸管吸取混合液，并注在平面上形成圆片状，并在30℃温浴1到1.5小时。移入0.1M 硫酸钠溶液稳定2小时，滤干并用清水洗涤两次，置于10mM 磷酸钠缓冲液中待用。

细胞固定化试剂聚乙烯醇也可以用聚丙烯酰胺或海藻酸钙代替，效果相同。

实施例3

使用包含D型乳酸脱氢酶和甲酸脱氢酶的全细胞催化剂合成（R）-2-羟基-4-苯基-丁酸：

在30℃向反应容器中加入100mM磷酸缓冲液（pH值调节至6.5）、40g/L细胞浓度（湿重）的全细胞催化剂BL21(DE3)( pET21a-LeFDH、pACYCDuet-1-SeLDH)（包含来自上皮葡萄球菌的D型乳酸脱氢酶和路德酵母的甲酸脱氢酶）、终浓度为30mM 的（R）-2-羟基-4-苯基-丁酸钠盐和75mM的甲酸铵。将反应混合物在30℃搅拌1.5小时。在一定的时间间隔取样，产物的生成量用HPLC确定。在反应1.5小时后转化率大于99%。反应完成后，离心回收细胞，将离心液上清用30%盐酸酸化到pH 3，先加120毫升乙酸乙酯萃取一次，再用40毫升乙酸乙酯萃取一次，萃取液合并，加无水硫酸钠干燥，过滤，蒸干得产品。

实施例4

使用包含D型乳酸脱氢酶和甲酸脱氢酶的固定化全细胞催化剂合成（R）-2-羟基-4-苯基-丁酸：

在30℃向反应容器中加入100mM磷酸缓冲液（pH值调节至6.5）、终浓度为500g/L固定化重组细胞催化剂、80mM 的（R）-2-羟基-4-苯基-丁酸钠盐，200mM的甲酸铵和0.1g/L NAD⁺。将反应混合物在30℃搅拌。在一定的时间间隔取样，产物的生成量用HPLC确定。在反应6小时后转化率大于97%。反应完成后，离心回收细胞，将离心液上清用30%盐酸酸化到pH 3，先加120毫升乙酸乙酯萃取一次，再用40毫升乙酸乙酯萃取一次，萃取液合并，加无水硫酸钠干燥，过滤，蒸干得产品。

实施例5

（R）-2-羟基-4-苯基-丁酸酯化：

混合450毫升乙醇和50克合成实施例2中得到的全细胞催化反应产物，控温在40℃以下滴加氯化亚砜27克（30分钟左右滴加完毕）。控温在30-40℃反应至(R)-2-羟基-4-苯基丁酸反应完全（HPLC监控）。减压蒸馏去除乙醇，蒸馏过程中釜内温度控制在40℃以下。将300毫升乙酸乙酯与100毫升 6%碳酸氢钠混合溶液预先降温到10℃以下，将上述去除乙醇的剩余反应液边搅拌边滴加到其中。滴加完以后，继续搅拌10分钟，静置10分钟，分液。有机层用100毫升 6%碳酸氢钠洗涤，HPLC监控，确保原料残留≤0.5%，再用50克饱和氯化钠溶液洗涤，用50克无水硫酸钠干燥，过滤，蒸掉溶剂，得粗产品（微黄色液体）61克。粗产品在23Pa下进行减压蒸馏，收集104℃馏分，得到(R)-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯纯品（无色透明液体）54.5克，收率94%，纯度99.40%，光学纯度大于99.8%。

序列表

SEQUENCE LISTING

<110> 尚科生物医药（上海）有限公司

<120> 固定化全细胞催化剂及其制备方法和应用

<130> none

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 993

<212> DNA

<213> 上皮葡萄球菌

<400> 1

atgacaaaaa ttatgttttt cggcacaaga gcatatgaga aggacatggc attacgttgg 60

ggaaagaaaa ataatatcga tgtcactaca tcaacagaac ttttaagtgt agatactgtc 120

gatcaattaa aagattatga cggtgttaca acaatgcagt tcggtaaatt agaacctgaa 180

gtttacccta aattagagtc ctatggtatt aaacaaattg cacaacgtac ggctggattt 240

gatatgtatg acttagaact tgcaaaaaaa catgaaatta ttatctcgaa tatacctagt 300

tattcacctg aaacaattgc tgaatattcg gtatctatcg ctctgcaact cgtacgaaaa 360

ttcccaacaa ttgaaaaacg tgtgcaagca cataatttca catgggcgtc ccctattatg 420

tctcgtccag taaaaaatat gactgtagca atcatcggta cagggcgtat tggtgctgca 480

actggtaaaa tctatgctgg ttttggtgcg agagtagttg gttatgatgc atatcctaat 540

cattctttat ctttcttaga atataaagaa acagtagagg atgcaattaa agatgctgat 600

attatctcat tacatgtacc cgctaataaa gatagtttcc atttatttga taacaatatg 660

tttaaaaatg ttaaaaaagg tgccgtttta gtcaatgccg caagaggagc tgtgataaac 720

acgcctgatt taattgaagc agtaaataat ggtacattat caggtgctgc cattgacaca 780

tatgaaaatg aagctaatta tttcacattt gattgttcaa atcaaacgat tgacgaccca 840

atattattag acctaattag aaatgaaaat attttagtta cacctcatat tgcctttttc 900

tccgatgaag cagtacaaaa tttagtagag ggtggtttga atgcagcatt atcagtaatt 960

aatactggca catgtgatac gcgattaaac taa 993

<210> 2

<211> 1170

<212> DNA

<213> 路德酵母

<400> 2

atgggtaagc caaaggtttt attagttctt tacgctggtg gtgagcatgc caaacaagaa 60

aagaaattgt tgggtgcaat tgagaatgag ttgggccttc gtcaatttat tgaggaccat 120

ggctacgact tggttgcaac aaccgacaaa gaaggtgaaa actcggcttt tgacaagaac 180

ttggaagatg cagaggttgt tattaccacg ccattttacc cagcttatct taccaaggag 240

agaatcgaaa aagcacctaa attgaagatt gccattaccg ctggtgttgg ttccgaccat 300

gtcaacttgg atgctgctaa tgccagagat atttcagttt tggaggttac tggttccaac 360

gtccagtcgg ttgcagagca tgctgttatg accatgcttg tgttgattag aaactacaac 420

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ttggaaagat tagtcccatt caacccaaag aaattattgt actatgacta ccaacctttg 600

cccgctgctg ctgaagaaaa gttgaacaag gcttcccaat tgtacaatga cgttgacact 660

attgttgaaa aagttgacca attagaagac ttggttgccg aggctgatat cgtgactatc 720

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caaacagagg ctggaaatgt ttataagtaa 1170

<210> 3

<211> 330

<212> PRT

<213> 上皮葡萄球菌

<400> 3

Met Thr Lys Ile Met Phe Phe Gly Thr Arg Ala Tyr Glu Lys Asp Met

1 5 10 15

Ala Leu Arg Trp Gly Lys Lys Asn Asn Ile Asp Val Thr Thr Ser Thr

20 25 30

Glu Leu Leu Ser Val Asp Thr Val Asp Gln Leu Lys Asp Tyr Asp Gly

35 40 45

Val Thr Thr Met Gln Phe Gly Lys Leu Glu Pro Glu Val Tyr Pro Lys

50 55 60

Leu Glu Ser Tyr Gly Ile Lys Gln Ile Ala Gln Arg Thr Ala Gly Phe

65 70 75 80

Asp Met Tyr Asp Leu Glu Leu Ala Lys Lys His Glu Ile Ile Ile Ser

85 90 95

Asn Ile Pro Ser Tyr Ser Pro Glu Thr Ile Ala Glu Tyr Ser Val Ser

100 105 110

Ile Ala Leu Gln Leu Val Arg Lys Phe Pro Thr Ile Glu Lys Arg Val

115 120 125

Gln Ala His Asn Phe Thr Trp Ala Ser Pro Ile Met Ser Arg Pro Val

130 135 140

Lys Asn Met Thr Val Ala Ile Ile Gly Thr Gly Arg Ile Gly Ala Ala

145 150 155 160

Thr Gly Lys Ile Tyr Ala Gly Phe Gly Ala Arg Val Val Gly Tyr Asp

165 170 175

Ala Tyr Pro Asn His Ser Leu Ser Phe Leu Glu Tyr Lys Glu Thr Val

180 185 190

Glu Asp Ala Ile Lys Asp Ala Asp Ile Ile Ser Leu His Val Pro Ala

195 200 205

Asn Lys Asp Ser Phe His Leu Phe Asp Asn Asn Met Phe Lys Asn Val

210 215 220

Lys Lys Gly Ala Val Leu Val Asn Ala Ala Arg Gly Ala Val Ile Asn

225 230 235 240

Thr Pro Asp Leu Ile Glu Ala Val Asn Asn Gly Thr Leu Ser Gly Ala

245 250 255

Ala Ile Asp Thr Tyr Glu Asn Glu Ala Asn Tyr Phe Thr Phe Asp Cys

260 265 270

Ser Asn Gln Thr Ile Asp Asp Pro Ile Leu Leu Asp Leu Ile Arg Asn

275 280 285

Glu Asn Ile Leu Val Thr Pro His Ile Ala Phe Phe Ser Asp Glu Ala

290 295 300

Val Gln Asn Leu Val Glu Gly Gly Leu Asn Ala Ala Leu Ser Val Ile

305 310 315 320

Asn Thr Gly Thr Cys Asp Thr Arg Leu Asn

325 330

<210> 4

<211> 389

<212> PRT

<213> 路德酵母

<400> 4

Met Gly Lys Pro Lys Val Leu Leu Val Leu Tyr Ala Gly Gly Glu His

1 5 10 15

Ala Lys Gln Glu Lys Lys Leu Leu Gly Ala Ile Glu Asn Glu Leu Gly

20 25 30

Leu Arg Gln Phe Ile Glu Asp His Gly Tyr Asp Leu Val Ala Thr Thr

35 40 45

Asp Lys Glu Gly Glu Asn Ser Ala Phe Asp Lys Asn Leu Glu Asp Ala

50 55 60

Glu Val Val Ile Thr Thr Pro Phe Tyr Pro Ala Tyr Leu Thr Lys Glu

65 70 75 80

Arg Ile Glu Lys Ala Pro Lys Leu Lys Ile Ala Ile Thr Ala Gly Val

85 90 95

Gly Ser Asp His Val Asn Leu Asp Ala Ala Asn Ala Arg Asp Ile Ser

100 105 110

Val Leu Glu Val Thr Gly Ser Asn Val Gln Ser Val Ala Glu His Ala

115 120 125

Val Met Thr Met Leu Val Leu Ile Arg Asn Tyr Asn Ile Gly His Leu

130 135 140

Gln Ala Glu Ser Gly Gly Trp Asp Val Ala Ala Val Ala Lys Glu Glu

145 150 155 160

Phe Asp Leu Glu Gly Lys Val Ile Ala Thr Val Gly Ala Gly Arg Ile

165 170 175

Gly Tyr Arg Ile Leu Glu Arg Leu Val Pro Phe Asn Pro Lys Lys Leu

180 185 190

Leu Tyr Tyr Asp Tyr Gln Pro Leu Pro Ala Ala Ala Glu Glu Lys Leu

195 200 205

Asn Lys Ala Ser Gln Leu Tyr Asn Asp Val Asp Thr Ile Val Glu Lys

210 215 220

Val Asp Gln Leu Glu Asp Leu Val Ala Glu Ala Asp Ile Val Thr Ile

225 230 235 240

Asn Cys Pro Leu His Glu Lys Thr Lys Gly Leu Phe Asp Lys Ala Leu

245 250 255

Ile Ser Arg Met Lys Lys Gly Ser Tyr Leu Val Asn Thr Ala Arg Gly

260 265 270

Ala Ile Cys Asp Ala Asp Ala Val Val Asp Ala Leu Ser Ser Gly His

275 280 285

Leu Ala Gly Tyr Gly Gly Asp Val Trp Asn Val Gln Pro Ala Pro Lys

290 295 300

Asp His Pro Trp Arg Lys Met His Asn Pro Tyr Gly Pro Glu Tyr Gly

305 310 315 320

Asn Ala Met Thr Ile His Val Ser Gly Thr Ser Leu Asp Ala Gln Ala

325 330 335

Arg Tyr Ala Glu Gly Val Lys Gln Ile Leu Thr Gln Tyr Phe Asp Lys

340 345 350

Thr Tyr Asn Tyr Arg Pro Gln Asp Ile Ile Cys Ile Asp Gly Asp Tyr

355 360 365

Ala Thr Lys Ala Tyr Gly Gln Arg Ala Lys Lys Glu Gln Thr Glu Ala

370 375 380

Gly Asn Val Tyr Lys

385

Claims

1. 一种固定化全细胞催化剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

2. 权利要求1所述固定化全细胞催化剂的制备方法，其特征在于，步骤（2）所述重组细胞湿重与聚乙二醇重量比为1：1～1：2。

3. 权利要求1所述固定化全细胞催化剂的制备方法，其特征在于，所述的D型乳酸脱氢酶基因和甲酸脱氢酶基因序列分别如SEQ ID No.1及SEQ ID No.2所示。

4. 权利要求1或3所述固定化全细胞催化剂的制备方法，其特征在于，所述的D型乳酸脱氢酶基因和甲酸脱氢酶基因分别来自上皮葡萄球菌和路德酵母。

5. 一种固定化全细胞催化剂，其特征在于，通过权利要求1～4任一项所述的方法制备。

6.权利要求5所述固定化全细胞催化剂在制备中间体（R）-2-羟基-4-苯基-丁酸方面的应用。

7. 制备（R）-2-羟基-4-苯基-丁酸的方法，其特征在于，步骤包括：

（1）将权利要求5所述固定化全细胞催化剂与（R）-2-羟基-4-苯基-丁酸钠盐、甲酸铵和NAD⁺与磷酸缓冲液混合，在pH6.0～8.0、25～40℃条件下反应1～10小时；反应混合液中固定化全细胞催化剂湿重浓度为10～500g/L，（R）-2-羟基-4-苯基-丁酸钠盐浓度为10～100mmol/L，甲酸铵浓度为50～250 mmol/L，NAD⁺浓度为0.05～0.5g/L。

8.（2）回收细胞，将反应液pH调至2.5～3.5，用乙酸乙酯萃取，干燥过滤。