CN102258564B - 一种微重力环境下提高免疫力的药物及其筛选方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了属于航天医学与组织工程领域的一种微重力环境下提高免疫力的药物及其筛选方法。本发明的药物由黄芪多糖、人参多糖、灵芝多糖、茯苓多糖和香菇多糖混合而成。通过如下筛选方法获得，首先制备淋巴细胞悬液，然后将淋巴细胞置于旋转式生物反应器的模拟微重力环境培养并添加不同比例配伍的多糖混合物，通过淋巴细胞免疫功能的改变得到在微重力环境下提高免疫力的药物配方。本发明的构建方法操作工艺简单、实施条件温和，可以高效、快速筛选出对抗微重力环境免疫功能降低的药物，对未来航天员对抗失重效应的健康防护具有重要意义。

Description

一种微重力环境下提高免疫力的药物及其筛选方法
技术领域
本发明属于航天医学与组织工程领域，特别涉及一种微重力环境下提高免疫力的药物及其筛选方法。
背景技术
持续失重、太空辐射、高真空、微磁场以及昼夜节律改变等均成为太空环境中影响航天员健康的因素，在轨空间飞行过程中，航天员的免疫系统功能在失重环境下会出现抑制现象，从而导致其机体罹患各种感染性疾病和自身免疫疾病的几率大大提高。因此，针对可以提高微重力环境下免疫功能的药物筛选是有效对抗失重效应措施的重要研究方面。然而，目前为止，未见利用旋转式生物反应器模拟微重力环境进行提高免疫力药物筛选的报道。
本发明旨在公开一种微重力环境下提高免疫力的药物及其筛选方法，该药物可以对抗微重力环境下免疫功能降低的作用，同时该筛选方法具有高效、快速的特点，对未来航天员对抗失重效应的健康防护具有重要意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种微重力环境下提高免疫力的药物。
本发明的目的还在于提供一种微重力环境下提高免疫力的药物的筛选方法。
一种微重力环境下提高免疫力的药物，由黄芪多糖、人参多糖、灵芝多糖、茯苓多糖和香菇多糖混合而成；黄芪多糖、人参多糖、灵芝多糖、茯苓多糖和香菇多糖分别占该药物总质量的百分比为20-50％、20-50％、10-40％、10-40％和10-40％。
一种微重力环境下提高免疫力药物的筛选方法，按照如下操作步骤进行：
(1)制备淋巴细胞悬液
用RMPI 1640培养液重悬制备细胞总数为5×104～5×108个的淋巴细胞悬液；
(2)将制得的淋巴细胞悬液置于不同容积的旋转式生物反应器中进行模拟微重力环境培养，同时添加不同浓度的淋巴细胞刺激物；
(3)将不同比例的黄芪多糖、人参多糖、灵芝多糖、茯苓多糖和香菇多糖的混合多糖溶于注射用水，其中混合多糖的浓度为0.2-5mg/ml，将混合多糖溶液加入到步骤(2)所述的体系中培养，在3-96h中的不同时间点取样，测定淋巴细胞免疫功能指标的改变，以此筛选出微重力环境下可以提高免疫力的药物。所述淋巴细胞刺激物为刀豆蛋白A，其浓度为10-40μg/ml；或植物凝激素A，其浓度为10-40μg/ml。
所述淋巴细胞免疫功能指标为淋巴细胞的增殖度、淋巴细胞细胞因子的分泌或淋巴细胞表面标志的表达。
所述淋巴细胞因子优选IL-2和IFN-γ；所述淋巴细胞表面标志优选CD4和CD8。本发明的有益效果：本发明采用旋转式生物反应器进行对抗微重力环境免疫功能低下药物的筛选，通过添加不同比例配伍的多糖混合物对淋巴细胞免疫功能的改变测定，包括淋巴细胞的增殖、细胞因子的分泌以及表面标志的表达等，从而可以高效、快速筛选出对抗微重力环境免疫功能降低的药物，对未来航天员对抗失重效应的健康防护具有重要意义。本发明的构建方法操作工艺简单、实施条件温和。
具体实施方式
通过以下实施例对本发明做详细描述，但是以下实施例仅仅是作为例证，并不对本发明构成任何限制。以下实施例中未详细说明的部分请参阅Robert Lanza，Robert Langer and Joseph Vacanti编写的《Principles of Tissue Engineering》第三版和Anthony Atala，Robert P.Lanza编写的《Methods of tissue engineering》(2006)。
以下实施例构建方法中使用的细胞分离、培养所需试剂：
(1)RMPI 1640细胞培养基：RMPI 1640干粉培养基一袋，2.2g NaHCO3，2.383gHEPES，10万单位青霉素，10万单位链霉素，溶解于1000ml超纯水中，调节pH值为7.2-7.4，经0.22μm微孔滤膜过滤除菌，4℃保存。使用时添加10％胎牛血清(FBS)和淋巴细胞刺激物，用于淋巴细胞的培养。
(2)PBS：称取8g NaCl，0.2g KCl，3.491g Na2HPO4·12H2O，0.2g KH2PO4，溶解于1000ml超纯水中，调节pH值为7.2-7.4，121℃高压蒸汽灭菌20min，4℃保存。
实施例1 以人外周血单核细胞为种子细胞筛选多糖混合物
(1)采用密度梯度离心法分离人外周血单核细胞
取肝素抗凝血用Hanks液稀释一倍，将其轻铺在Ficoll分离液(比重为1.077g/mL)上，然后2000rpm，水平离心30min。单个核细胞悬于分离液上层，呈白色膜状。用吸管小心吸取单个核细胞层，加入Hanks液后洗涤3遍。加入含10％胎牛血清的RPMI-1640培养基，常规培养。
(2)将制得的人外周血单核细胞悬液(细胞总数为1×107)置于50mL的旋转式生物反应器中培养，同时添加浓度为20μg/mL的植物凝激素A(PHP-A)。
(3)将黄芪多糖、人参多糖、灵芝多糖、茯苓多糖、香菇多糖按照质量百分比为20％、20％、30％、10％、20％混合，称取1mg混合多糖充分溶解于2mL注射用水中，并将其加入(2)中所述的体系中。
(4)对添加了多糖混合物的淋巴细胞在3h、6h、9h和12h分别取样，测定淋巴细胞的增殖度、IL-2，IFN-γ分泌以及CD4，CD8表面标志的表达。从而筛选出微重力环境下提高免疫力的药物。
实施例2 以小鼠骨髓单核细胞为种子细胞筛选多糖混合物
(1)采用密度梯度离心法分离小鼠骨髓单核细胞
取已死亡小鼠股骨，将股骨放入无菌的冷PBS中；用1mL注射器冲出小鼠股骨中的细胞，直到股骨腔呈白色；充分混匀细胞，使用200目的滤网过滤，收集过滤液于10mL离心管中，1500rpm。离心5min；弃上清，加入8mLNH4Cl-Tris溶液，将细胞悬起，溶解红细胞约6min，1500rpm，离心5min。弃上清，在离心管中加入5mL无菌冷PBS，重悬细胞；将上述细胞悬液轻轻加到5mL Ficoll-paqul(1.086g/mL)，1500rpm，离心30min；小心取出离心管，溶液分为三层：从上往下依次是透明的PBS层、单核细胞层、RBS层；用口径较大的细吸管吸出单个核细胞到50mL的离心管中，加入30mLPBS混匀清洗细胞，1500rpm，离心5min。10mLPBS，1500rpm，离心5min再洗涤1次；重悬细胞，接种于含有10％FBS的RMPI1640培养液中，常规培养。
(2)将制得的小鼠骨髓单核细胞悬液(细胞总数为3×107)置于50mL的旋转式生物反应器中培养，同时添加浓度为25μg/mL的植物凝激素A(PHP-A)。
(3)将黄芪多糖、人参多糖、灵芝多糖、茯苓多糖、香菇多糖按照质量百分比为30％、30％、20％、10％、10％混合，称取1mg混合多糖充分溶解于2mL注射用水中，并将其加入(2)中所述的体系中。
(4)对添加了多糖混合物的淋巴细胞在6h、12h和24h分别取样，测定淋巴细胞的增殖度、IL-2，IFN-γ分泌以及CD4，CD8表面标志的表达。从而筛选出微重力环境下提高免疫力的药物。
实施例3 以小鼠脾淋巴细胞为种子细胞筛选多糖混合物
(1)采用密度梯度离心法分离小鼠脾淋巴细胞
取已死亡小鼠的脾脏组织，置于盛有无菌的冷PBS中，然后将脾脏剪碎，使用200目的滤网过滤，收集过滤液于10mL离心管中，1500rpm。离心5min；弃上清，加入8mLNH4Cl-Tris溶液，将细胞悬起，溶解红细胞约8min，1500rpm，离心5min。弃上清，在离心管中加入5mL无菌冷PBS，重悬细胞；将上述细胞悬液轻轻加到5mL Ficoll(1.086g/mL)，2000rpm，离心15min；小心取出离心管，溶液分为三层：从上往下依次是透明的PBS层、单核细胞层、RBS层；用口径较大的细吸管吸出淋巴细胞到10mL的离心管中，加入5mLPBS混匀清洗细胞2次，1500rpm，离心5min。重悬细胞，接种于含有10％FBS的RMPI1640培养液中，常规培养。
(2)将制得的小鼠脾淋巴细胞悬液(细胞总数为5×107)置于50mL的旋转式生物反应器中培养，同时添加浓度为20μg/mL的刀豆蛋白A(ConA)。
(3)将黄芪多糖、人参多糖、灵芝多糖、茯苓多糖、香菇多糖按照质量百分比为30％、30％、20％、10％、10％混合，称取2mg混合多糖充分溶解于2mL注射用水中，并将其加入(2)中所述的体系中。
(4)对添加了多糖混合物的淋巴细胞在24h、48h和72h分别取样，测定淋巴细胞的增殖度、IL-2，IFN-γ分泌以及CD4，CD8表面标志的表达。从而筛选出微重力环境下提高免疫力的药物。

Claims (3)

1.一种微重力环境下提高免疫力药物的筛选方法，该药物由以下组分组成：黄芪多糖、人参多糖、灵芝多糖、茯苓多糖和香菇多糖，其特征在于，按照如下操作步骤进行：
（1）制备淋巴细胞悬液
用RMPI 1640培养液重悬制备细胞总数为5×104~5×108个的淋巴细胞悬液；
（2）将制得的淋巴细胞悬液置于不同容积的旋转式生物反应器中进行模拟微重力环境培养，同时添加不同浓度的淋巴细胞刺激物；
（3）将不同比例的黄芪多糖、人参多糖、灵芝多糖、茯苓多糖和香菇多糖的混合多糖溶于注射用水，其中混合多糖的浓度为0.2-5mg/ml，将混合多糖溶液加入到步骤（2）所述的体系中培养，在3-96h中的不同时间点取样，测定淋巴细胞免疫功能指标的改变，以此筛选出微重力环境下可以提高免疫力的药物。
2.根据权利要求2所述一种微重力环境下提高免疫力药物的筛选方法，其特征在于，所述淋巴细胞刺激物为刀豆蛋白A，其浓度为10-40μg/ml；或植物凝激素A，其浓度为10-40μg/ml。
3.根据权利要求2所述一种微重力环境下提高免疫力药物的筛选方法，其特征在于，所述淋巴细胞免疫功能指标为淋巴细胞的增殖度、淋巴细胞细胞因子的分泌或淋巴细胞表面标志的表达。
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