CN102247377B

CN102247377B - 降碳醌甲基三萜在制备防治糖尿病药物中的应用

Info

Publication number: CN102247377B
Application number: CN 201110133694
Authority: CN
Inventors: 孙连娜; 王燕; 李霞; 赵贵钧; 席忠新; 陈伟; 梁凤英; 韩军; 陈万生
Original assignee: Second Military Medical University SMMU
Current assignee: Second Military Medical University SMMU
Priority date: 2011-05-23
Filing date: 2011-05-23
Publication date: 2013-10-09
Anticipated expiration: 2031-05-23
Also published as: CN102247377A

Abstract

本发明提供一种降碳醌甲基三萜在制备防治糖尿病药物中的应用。所述的降碳醌甲基三萜具有下列结构式I。所述降碳醌甲基三萜包括下列化合物：扁蒴藤素、Isoiguesterin、Netzahualcoyene。本发明化合物经实验证实，阔叶五层龙根总提取物对α-淀粉酶表现出一定的抑制作用，降碳醌甲基三萜、扁蒴藤素、isoiguesterin、netzahualcoyene具有显著抑制α-淀粉酶的作用，即能抑制α-淀粉酶将淀粉分解为糖，表现出降糖活性，因此，可用于制备防治糖尿病药物。本发明提供了新的防治糖尿病药物，药物的活性成分由中药提取分离得到，原料来源丰富，减少化学药物副作用，有利于环保，有较大的临床应用价值。其中，R₁为CH₃或Δ¹⁴⁽¹⁵⁾；R₂为Δ¹⁴⁽¹⁵⁾或H；R₃为CH₃或H；R₄为α-COOCH₃或Δ²⁰⁽²⁹⁾。

Description

降碳醌甲基三萜在制备防治糖尿病药物中的应用

技术领域

本发明涉及药物化学，具体涉及降碳醌甲基三萜在制备防治糖尿病药物中的应用。

背景技术

α-淀粉酶为1，4-α-D-葡聚糖水解酶，其特异性作用于淀粉、糖原以及相关多糖，使其水解为寡糖片段。食物中碳水化合物先在唾液、胰液α-淀粉酶作用下分解为寡糖，然后在小肠粘膜细胞刷状缘处经α-葡萄糖苷酶分解为单糖，被小肠上皮细胞吸收入血液循环。α-淀粉酶抑制剂通过抑制肠道内唾液及胰α-淀粉酶活性，阻碍食物中淀粉及其他碳水化合物的消化吸收，减少葡萄糖产生和摄取，降低血糖含量，减少脂肪合成，故临床上可用于预防和治疗糖尿病、高血糖和高血脂等症。既可单独使用，也可与其他降糖药或降血脂药联合使用。因此，筛选和寻找有效、安全的α-淀粉酶抑制剂具有较重要的临床意义。

阔叶五层龙为翅子藤科五层龙属植物，中国专利CN1742763A公开了阔叶五层龙提取物能显著降低四氧嘧啶诱发的高血糖模型小鼠的血糖水平，同时对外源性葡萄糖引起的小鼠血糖升高也有明显的抑制作用，但其降糖的物质基础仍未明确。降碳醌甲基三萜是重要的木栓烷型三萜类化合物，扁蒴藤素(雷公藤红素甲酯)、isoiguesterin及netzahualcoyene是此类型代表性化合物。中国专利CN101624415A公开了雷公藤红素甲酯用于癌症、炎症及中枢神经系统疾病的治疗，但是，尚未见该类化合物具有防治糖尿病活性的报道。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于研究降碳醌甲基三萜的药物活性，设计制备新的防治糖尿病药物。

本发明提供一种降碳醌甲基三萜在制备防治糖尿病药物中的应用。

所述的降碳醌甲基三萜具有下列结构式I：

其中，R₁为CH₃或Δ¹⁴⁽¹⁵⁾；

R₂为Δ¹⁴⁽¹⁵⁾或H；

R₃为CH₃或H；

R₄为α-COOCH₃或Δ²⁰⁽²⁹⁾。

上式中，当R₁为CH₃，R₂为H，R₃为H，R₄为α-COOCH₃时，则为化合物扁蒴藤素(pristimerin)(雷公藤红素甲酯)；

当R₁为CH₃，R₂为H，R₃为H，R₄为Δ²⁰⁽²⁹⁾时，则为化合物isoiguesterin；

当R₁和R₂各为Δ¹⁴⁽¹⁵⁾，R₃为CH₃，R₄为α-COOCH₃时，则为化合物netzahualcoyene。

本发明上述化合物经实验证实，采用碘-淀粉显色法，选用葡萄糖检测试剂盒(葡萄糖氧化酶-过氧化酶法，上海荣盛生物技术有限公司，20070722)，检测阔叶五层龙根总提取物和化合物扁蒴藤素、isoiguesterin、netzahualcoyene对α-淀粉酶的抑制作用，以显示其降糖活性。实验结果表明，阔叶五层龙根总提取物对α-淀粉酶表现出一定的抑制作用，降碳醌甲基三萜扁蒴藤素、isoiguesterin、netzahualcoyene具有显著抑制α-淀粉酶的作用，即能抑制α-淀粉酶将淀粉分解为糖，表现出降糖活性，因此，可用于制备防治糖尿病药物。

本发明的上述化合物通过下述方法制备：

阔叶五层龙干燥根药材22kg，切段，以80％乙醇溶液，60℃回流提取，提取液经减压回收乙醇至无醇味，得总提取物。乙醇提取物加水混悬，分别以等体积的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇(水饱和)萃取三次，回收萃取溶剂得到石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位及水部位。对四个部位进行活性检测，显示石油醚部位活性最强，取石油醚部位，经硅胶柱层析，依次以石油醚/乙酸乙酯(40∶1，30∶1，20∶1，10∶1，5∶1，3∶1，2∶1，1∶1，乙酸乙酯)梯度洗脱，得到9个流份(I-IX)。流份V(15.1g)以石油醚/丙酮(30∶1，20∶1，10∶1，1∶1)洗脱，得到四个流份：Fr.5A-Fr.5D；Fr.5B再通过石油醚/乙酸乙酯(25∶1)洗脱，得到化合物isoiguesterin。流份VI通过反相柱层析(50-100％甲醇/水梯度洗脱)，得到四个流份：Fr6A-Fr6D；Fr6C、Fr6D经硅胶柱层析，以石油醚/乙酸乙酯(20∶1)洗脱，分别得到化合物netzahualcoyene、扁蒴藤素。

本发明使用的阔叶五层龙干燥根药材通过市售得到。

本发明药物是由降碳醌甲基三萜作为活性成分与药用辅料组成的药物组合物。

本发明药物是由扁蒴藤素作为活性成分与药用辅料组成的药物组合物。

本发明药物是由Isoiguesterin作为活性成分与药用辅料组成的药物组合物。

本发明药物是由Netzahualcoyene作为活性成分与药用辅料组成的药物组合物。

本发明提供了新的防治糖尿病药物，药物的活性成分由中药提取分离得到，原料来源丰富，可以减少化学药物的副作用，有利于环保，有较大的临床应用价值。

具体实施方式

下面用非限定性实施例对本发明进一步说明。

实施例1制备降碳醌甲基三萜

阔叶五层龙干燥根药材(采自海南省兴隆县)22kg，切制成条状(长4-6cm，宽1-2cm)，以80％乙醇溶液(25L×3)，60℃回流提取，提取液经减压回收乙醇至无醇味，得阔叶五层龙总提取物1.25Kg。乙醇提取物加水(3000ml)混悬，分别以等体积的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇(水饱和)萃取三次，得到石油醚部位(45g)、乙酸乙酯部位(165g)、正丁醇部位(165g)及水部位(875g)。对四个部位进行活性检测，显示石油醚部位活性最强，取石油醚部位(45g)，经硅胶柱层析(1kg，200～300目，10cm×60cm)，依次以石油醚/乙酸乙酯(40∶1，30∶1，20∶1，10∶1，5∶1，3∶1，2∶1，1∶1，乙酸乙酯)各梯度10L进行洗脱，得到9个流份(I-IX)。其中，流份V(15.1g)经硅胶柱层析(150g，200～300目，5cm×20cm)，以石油醚/丙酮(30∶1，20∶1，10∶1，1∶1)各梯度1L进行洗脱，得到四个流份：Fr.5A-Fr.5D；Fr.5B(3.5g)再通过硅胶柱层析(30g，200～300目，2cm×15cm)，以石油醚/乙酸乙酯(25∶1)洗脱500mL，60℃减压回收溶剂，得到化合物isoiguesterin(15mg)。流份VI(19.4g)通过反相柱层析(150g，200～300目，5cm×20cm)，以甲醇/水(1∶1，6∶4，7∶3，纯甲醇)各梯度1L进行洗脱，得到四个流份：Fr.6A-Fr.6D；Fr.6B(5.2g)、Fr.6C(4.8g)经硅胶柱层析(40g，200～300目，2cm×20cm)，以石油醚/乙酸乙酯(20∶1)洗脱500mL，60℃减压回收溶剂，分别得到化合物netzahualcoyene(25mg)、扁蒴藤素(25mg)。

上述化合物通过ESI-MS、IR、¹H-NMR(DMSO-d₆，600MHz)、¹³C-NMR(DMSO-d₆，150MHz)等检测，并与相关文献报道核对，确证了他们的结构，其中

扁蒴藤素，橙红色结晶，C₃₀H₄₀O₄，ESI-MS m/z：465[M+H]⁺，487[M+Na]⁺，核磁数据与文献(Phytochemistry，1995，40(4)：1227-1231；中草药，1996，27(2)：73-74)报道的一致。

Netzahualcoyene，红色结晶，C₃₀H₃₈O₄，ESI-MS m/z：463[M+H]⁺，485[M+Na]⁺，核磁数据与文献(Phytochemistry，1996，42(5)：1377-1385)报道的一致。

Isoiguesterin，橙红色无定形粉末，C₂₈H₃₆O₂，ESI-MS m/z：405[M+H]⁺，427[M+Na]⁺，核磁数据与文献(Journal of Natural Products，1994，57(2)：270-276)报道的一致。

实施例2体外降糖活性试验

1、试验药物：

实施例1制备的阔叶五层龙根总提取物和从中分离得到的化合物扁蒴藤素、isoiguesterin、netzahualcoyene。

2、试剂和材料

葡萄糖检测试剂盒(葡萄糖氧化酶-过氧化酶法，上海荣盛生物技术有限公司，20100811)；

阿卡波糖(Bayer AG，Wuppertal，German)；

α-淀粉酶(Wako Pure Chemicals Ind.，Ltd.，Osaka，Japan)；

其他试剂(分析纯)。

3、实验仪器

酶标仪(Elx800，Biotek)；

96孔细胞培养板(Corning/Costar)；

4、实验方法

将阔叶五层龙根总提取物和化合物扁蒴藤素、isoiguesterin、netzahualcoyene分别用DMSO配制成10mg/ml的溶液，再用水稀释成浓度为0.556mg/ml溶液；

将阿卡波糖用蒸馏水配制成浓度为0.556mg/ml溶液；

将α-淀粉酶用25mM的PIPES缓冲液配制成浓度为27.8mg/L溶液，PH 6.9；

将淀粉用蒸馏水配制成浓度为0.16％的淀粉溶液。

显色剂：先将苯甲酸钠10.8克，碘化钾5克溶于400ml水中，然后定容至500mL。

用96孔细胞培养板，实验分5组，分别为空白对照组(蒸馏水)、阳性对照组(阿卡波糖组)、3个样品测定组，每组各设6个复孔。

操作方法为：分别将上述3个化合物及阿卡波糖溶液加入板孔上编组的相应各孔，每孔25μl样品溶液，空白对照组加等量蒸馏水，分别于每组其中三个孔加入12.5μLα-淀粉酶溶液，另三个孔加12.5μL蒸馏水，37℃温孵10min，然后于每个孔加入12.5μL淀粉溶液，37℃温孵10min，最后分别于各孔加入500μL显色试剂终止反应，在酶标仪630nm波长下测定吸光度(A)，按下列方法计算抑制率(％)：抑制率(％)＝[1-(A_{样品不加酶}-A_样品加酶)/(A_{空白对照不加酶}-A_{空白对照加酶})]×100％。对每个化合物采用五个不同浓度，计算相应的半数抑制浓度(IC₅₀)。

5、实验结果

阔叶五层龙根总提取物和降碳醌甲基三萜扁蒴藤素、isoiguesterin、netzahualcoyene对α-淀粉酶的抑制活性，结果见表1。

表1

其中，^a数据为三次实验的平均值

从表1可见，在样品终浓度为556μg/ml时，阳性对照阿卡波糖的抑制率记为100％。阔叶五层龙根总提取物对α-淀粉酶表现出一定的抑制作用，isoiguesterin和netzahualcoyene对α-淀粉酶表现出明显的抑制作用，isoiguesterin的抑制率已高于阳性对照组，其半数抑制浓度达到13.44μg/ml。扁蒴藤素也呈现一定的抑制作用。因此，降碳醌甲基三萜扁蒴藤素、isoiguesterin和netzahualcoyene可用于制备防治糖尿病药物。

Claims

1.降碳醌甲基三萜在制备防治糖尿病药物中的应用，其特征在于，所述降碳醌甲基三萜包括化合物Isoiguesterin和Netzahualcoyene它们的结构式如下：

Isoiguesterin：

其中R₁为CH₃、R₂为H、R₃为H，R₄为Δ²⁰⁽²⁹⁾；

Netzahualcoyene：

其中R₁和R₂各为Δ¹⁴⁽¹⁵⁾，R₃为CH₃，R₄为各α-COOCH₃。

2.根据权利要求1的应用，其特征在于，所述药物是由降碳醌甲基三萜作为活性成分与药用辅料组成的药物组合物。

3.根据权利要求1的应用，其特征在于，所述药物是由Isoiguesterin作为活性成分与药用辅料组成的药物组合物。

4.根据权利要求1的应用，其特征在于，所述药物是由Netzahualcoyene作为活性成分与药用辅料组成的药物组合物。