CN102309494A - 扁蒴藤素作为炎性细胞因子抑制剂的医药用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了扁蒴藤素在制备炎性细胞因子抑制剂中的应用，具体地说，与TNF-α、IL-6、IL-8过度分泌有关的病症中的应用，和/或在活性氧自由基抑制剂方面的应用。

Description

扁蒴藤素作为炎性细胞因子抑制剂的医药用途

技术领域

本发明涉及扁蒴藤素的应用。

背景技术

炎症是机体对各种刺激的防御反应，也是感染、创伤及过敏反应等最后的共同途径，炎症最主要的特征是通过机体的免疫系统募集大量炎症细胞、活化促炎症细胞、产生大量促炎细胞因子及具有炎性特质的活性氧自由基。与炎症性疾病发生、发展密切相关的细胞主要是单核/巨噬细胞。促炎细胞因子、活性氧自由基主要由单核/巨噬细胞分泌，并可通过炎症网络放大炎症反应，损伤局部组织。促炎细胞因子如白细胞介素IL-6、TNF-α和IL-8与炎症关系最为密切，过度分泌促炎细胞因子是导致多种疾病发生、发展的重要因素。已有的研究证明，IL-6、TNF-α和IL-8的抑制剂能适用于类风湿性关节炎、脓毒性休克、感染性休克、多器官功能障碍综合症、骨关节炎、呼吸道病毒性感染、慢性心功能不全、脊柱关节病、高血压病、冠心病、糖尿病、心肌梗塞、系统性红斑狼疮、狼疮性肾炎、白塞氏病、硬皮病、结节病、皮肌炎、银屑病、慢性阻塞性肺病、哮喘、胰腺炎、肝硬化、炎症性肠病、获得性免疫缺陷综合症、帕金森氏病、早老年痴呆、病毒性脑病、急性髓性白血病、血管性头痛、全身炎性反应综合症、脓毒血症、中枢性神经损伤、急性脑出血、脑梗塞、脑损伤、脑损伤后感染性并发症、慢性肾功能不全、原发性肾病综合症、反流性肾病、失血性休克、阻塞性睡眠呼吸暂停综合症、坏疽性脓皮病、多发性骨髓炎、葡萄膜炎、骨髓增生异常综合症、肿瘤、移植物抗宿主病、牙周炎、细菌感染、肥胖、神经性疼痛、偏头疼、紧张性疼痛、从发性头痛、神经痛、肌-骨骼疼痛、骨-外伤性疼痛、术后疼痛、癌症-相关疼痛、内脏疼痛、HIV-相关的疼痛。炎性细胞因子抑制剂是目前新药开发的重要的作用靶点。

TNF-α是1975年发现的一个能被内毒素脂多糖(LPS)诱导的糖蛋白，活化的单核/巨噬细胞是TNF-α产生的主要来源，此外，肥大细胞、T淋巴细胞、B淋巴细胞、NK细胞、内皮细胞、心肌细胞、成纤维细胞及骨细胞等也能分泌。TNF-α在正常的个体中几乎检测不到，但在炎症性疾病或感染性疾病病人的血清及组织中能检测到高浓度的TNF-α，而且血清中TNF-α浓度高低与疾病的恶化程度呈正相关。研究表明，TNF-α能够介导血管内皮细胞与白细胞相互作用，促进E-选择素、血管细胞粘附分子、细胞粘附分子、趋化性细胞因子等介质表达，活化环氧化酶-2等酶活性；增加活性氧自由基、抑制或杀灭肿瘤细胞、提高中性粒细胞的吞噬能力、参与炎症反应、抗感染、增加血管内凝血等生物活性。已有的文献表明，抑制TNF-α的释放可以用于多种病症的治疗：全身炎性反应综合症、脓毒血症、多器官功能障碍综合症、类风湿性关节炎、骨关节炎、脊柱关节炎、炎症性肠病、心力衰竭、糖尿病、系统性红斑狼疮、硬皮病、结节病、皮肌炎、银屑病、急性髓性白血病、帕金森氏病、早老年痴呆、抑郁症、白塞氏病、慢性阻塞性肺病、哮喘、中枢性神经损伤、呼吸道病毒感染、多发性骨髓瘤、骨髓增生异常综合症、坏疽性脓皮病、移植物抗宿主病、葡萄膜炎、牙周炎、细菌感染、肥胖、神经性疼痛、偏头疼、紧张性疼痛、从发性头痛、神经痛、肌-骨骼疼痛、骨-外伤性疼痛、术后疼痛、癌症-相关疼痛、内脏疼痛、HIV-相关的疼痛。以TNF-α为靶点是目前新药开发一个热点领域，一些TNF-α的抑制剂如Humira，Remicade，Enbrel等已近被批准用于治疗类风湿性关节炎及炎症性疾病如强直性脊柱炎、crohn病，并取得了良好的治疗效果。

IL-6是一个多效能的促炎细胞因子，多种细胞能分泌IL-6，其中单核/巨噬细胞是IL-6的主要来源。IL-6影响B细胞增殖分化、促进T细胞激活、参与CTL分化过程、增强血细胞分化过程，IL-6本身具有生长因子样的作用或者抗凋亡作用，此外，IL-6还参与机体的应激过程、免疫应答、炎症等病理过程，而过表达IL-6与多种疾病有关，如全身炎性反应综合症、脓毒血症、脓毒性休克、感染性休克、多器官功能障碍综合症、类风湿性关节炎、获得性免疫缺陷综合症、心脏粘液瘤、巨大淋巴结增生、急性脑出血、急性脑梗塞、脑损伤、脑损伤后感染性并发症、流感病毒性脑病、冠心病、重症胰腺炎、狼疮性肾炎、慢性肾功能不全、原发性肾病综合症、反流性肾病、失血性休克、阻塞性睡眠呼吸暂停综合症和肿瘤等有关。已经被证实tocilizumab(一种IL-6受体的拮抗剂)对风湿性关节炎、巨大淋巴结增生、Crohn氏病有良好的治疗效果。

IL-8是强力的中性粒细胞、T淋巴细胞及嗜碱性粒细胞趋化因子，是一种重要的炎症介质。脂多糖、TNF-α等多种物质能诱导单核细胞、巨噬细胞、淋巴细胞、血管内皮细胞等产生IL-8，其中单核巨噬细胞是IL-8的主要来源。IL-8对中性粒细胞有较强的趋化和激活作用，参与局部炎症的形成，是一种新发现的炎性细胞因子。IL-8能激活中性粒细胞，诱导其变形、趋化、脱颗粒、短暂上升胞浆内钙、合成生物活性脂类、上调整合素、及诱导呼吸爆发等活性，此外，对T淋巴细胞和嗜碱性粒细胞也有趋化作用。IL-8属于调节炎症的介质，对炎症和免疫过程有重要的调节作用，在类风湿性关节炎、囊性纤维化、银屑病、慢性阻塞性肺疾病、成人呼吸窘迫综合症、急性鼻炎、自发性肺纤维化、石棉沉积病、败血症休克、内毒素血症、脑膜炎、溃疡性结肠炎、输血溶血反应、HIV感染以及动脉粥样硬化等炎症性疾病和心脑血管性疾病的发生、发展及加重病情中重要作用，也是目前药物治疗的一个重要靶点。

活性氧自由基主要有：超氧化物阴离子、羟自由基、过氧化氢分子、氢过氧基、氢过氧化物和单线态氧等，机体在代谢过程中不断产生活性氧自由基，也不断地被消除，使机体维持有利无害、低水平、稳定平衡的生理性自由基含量。但过量自由基可造成都将导致氧化应激发生，导致机体细胞非特异性氧化损伤，而引发各种疾病；多发性硬化病、膝骨关节炎、原发性的骨关节炎、糖尿病肾病、糖尿病、阿尔茨海默病、帕金森病、肌萎缩性侧索硬化症、家族性遗传性共济失调、肿瘤、动脉粥样硬化，缺血性心肌病和急性心肌梗死。

扁蒴藤素的化学结构如下所示：

中国专利ZL02145134.6报道了扁蒴藤素提取分离方法、体外抑制4种细胞增殖(抗肿瘤作用)及抑制大鼠组织匀浆中丙二醛的产生作用；CN200810033906.8报道了一种高速逆流色谱法制备高纯度扁蒴藤素的方法。美国专利文献(No7,323,476)中报道了扁蒴藤素抑制NF-κB、内皮素受体活性以及通过抑制NF-κB及内皮素受体活性的而产生的临床用途。未曾发现扁蒴藤素对促炎细胞因子如TNF-α、IL-6及趋化性细胞因子IL-8，活性氧自由基的作用进行研究的文献。

发明内容

本发明的目的在于提供一种扁蒴藤素在医药领域中的新应用，具体地为在制备炎性细胞因子抑制剂中的应用。在本发明中，所述扁蒴藤素能有效地抑制炎性细胞因子的过度分泌。

其中，所述炎性细胞因子较佳地为促炎细胞因子、趋化性细胞因子或具有炎性特质的活性氧自由基。所述促炎细胞因子较佳地为TNF-α或IL-6；所述趋化性细胞因子较佳地为IL-8；所述具有炎性特质的活性氧自由基选自下列组中的一种或多种：超氧化物阴离子、羟自由基、过氧化氢分子、氢过氧基、氢过氧化物和单线态氧。

在本发明中，所述扁蒴藤素作为炎性细胞因子抑制剂可以用于下列病症的治疗，包括但不局限于：类风湿性关节炎、脓毒性休克、感染性休克、多器官功能障碍综合症、类风湿性关节炎、骨关节炎、呼吸道病毒性感染、慢性心功能不全、脊柱关节病、高血压病、冠心病、糖尿病、心肌梗塞、系统性红斑狼疮、狼疮性肾炎、白塞氏病、硬皮病、结节病、皮肌炎、银屑病、慢性阻塞性肺病、哮喘、胰腺炎、肝硬化、炎症性肠病、获得性免疫缺陷综合症、帕金森氏病、早老年痴呆、病毒性脑病、急性髓性白血病、血管性头痛、全身炎性反应综合症、脓毒血症、中枢性神经损伤、急性脑出血、脑梗塞、脑损伤、脑损伤后感染性并发症、慢性肾功能不全、原发性肾病综合症、反流性肾病，失血性休克、阻塞性睡眠呼吸暂停综合症、坏疽性脓皮病、多发性骨髓炎、葡萄膜炎、骨髓增生异常综合症、肿瘤、移植物抗宿主病、牙周炎、细菌感染、肥胖。

在本发明中，扁蒴藤素作为TNF-α抑制剂，可用于治疗下列病症，包括但不局限于：全身炎性反应综合症、脓毒血症、多器官功能障碍综合症、类风湿性关节炎、骨关节炎、脊柱关节炎、炎症性肠病、心力衰竭、糖尿病、系统性红斑狼疮、硬皮病、结节病、皮肌炎、银屑病、急性髓性白血病、帕金森氏病、早老年痴呆、抑郁症、白塞氏病、慢性阻塞性肺病、哮喘、中枢性神经损伤、呼吸道病毒感染、多发性骨髓瘤、骨髓增生异常综合症、坏疽性脓皮病、移植物抗宿主病、葡萄膜炎、牙周炎、细菌感染、肥胖、神经性疼痛、偏头疼、紧张性疼痛、从发性头痛、神经痛、肌-骨骼疼痛、骨-外伤性疼痛、术后疼痛、癌症-相关疼痛、内脏疼痛、HIV-相关的疼痛。

在本发明中，扁蒴藤素作为IL-6抑制剂，可用于但不局限于治疗下列病症：全身炎性反应综合症、脓毒血症、脓毒性休克、感染性休克、多器官功能障碍综合症、类风湿性关节炎、获得性免疫缺陷综合症、心脏粘液瘤、巨大淋巴结增生、急性脑出血、急性脑梗塞、脑损伤、脑损伤后感染性并发症、流感病毒性脑病、冠心病、重症胰腺炎、狼疮性肾炎、慢性肾功能不全、原发性肾病综合症、反流性肾病、失血性休克、阻塞性睡眠呼吸暂停综合症和肿瘤。

在本发明中，扁蒴藤素作为IL-8抑制剂可用于治疗下列病症，包括但不局限于：类风湿性关节炎、囊性纤维化、银屑病、慢性阻塞性肺疾病、成人呼吸窘迫综合症、急性鼻炎、自发性肺纤维化、石棉沉积病、败血症休克、内毒素血症、脑膜炎、溃疡性结肠炎、输血溶血反应、HIV感染以及动脉粥样硬化等炎症性疾病和心脑血管性疾病。。

在本发明中，扁蒴藤素作为活性氧自由基抑制剂，可用于但不局限于下列病症的治疗：多发性硬化病、膝骨关节炎、原发性的骨关节炎、糖尿病肾病、糖尿病、阿尔茨海默病、帕金森病、肌萎缩性侧索硬化症、家族性遗传性共济失调、肿瘤、动脉粥样硬化、缺血性心肌病和急性心肌梗死

在本发明中，所述扁蒴藤素可以单独适用也可以药物组合形式适用。药物组合形式包括作为活性成分的扁蒴藤素及药学上可接受的载体。

在本发明中，所述扁蒴藤素作为炎性细胞因子抑制剂有效剂量范围为0.01-0.1mg/kg/日/人，以上用量是根据体外实验及动物药理实验结果推算的，因动物与人体的差异性、体内外实验的差异性、疾病的差异性、特定细胞因子作用的差异性，允许临床实际用量有所调整。

在本发明中，所述扁蒴藤素作为炎性细胞因子抑制剂用法可根据具体疾病进行选择。

具体实施方式

材料：THP-1细胞株购自中国科学院细胞库；RPM I 1640培养基为美国Gibco公司产品；胎牛血清为美国Hyclone公司产品；脂多糖(LPS)为sigma公司严品；MTT为sigma公司产品；人TNF-α、IL-8、IL-6ELISA测定试剂盒为R&D公司产品，精美生物工程有限公司分装；DHR123美国Sigma公司产品；扁蒴藤素购自PayPay TECHNOLOGIES INC.，以DMSO(二甲基亚砜)溶解并稀释至合适的浓度；其他试剂均为国产分析纯。细胞培养箱购自德国Heracell公司；酶标仪购自奥地利TECAN公司；流式细胞仪(美国Becton-Dickinson，San Diego，CA，USA)；低温高速离心机为美国Beckman公司产品

实施例1扁蒴藤素体外抑制TNF-α、IL-8以及IL-6的释放

细胞培养：THP-1细胞株用含10％胎牛血清的RPMI 1640培养液，添加青霉素100U/mL、链霉素100U/mL，置37℃、5％CO₂培养箱内培养。

细胞因子(TNF-α、IL-6和IL-8)含量测定：THP-1细胞以细胞数1×10⁶/mL接种于48孔板中，分为空白对照组(DMSO)、LPS组(不加入测试样品)、扁蒴藤素组(0.15μM、0.3μM和0.6μM)及地基米松(Dex)组，每个样品3平行孔。扁蒴藤素及Dex作用4h后，除空白对照组外，各孔均加入1μg/mL LPS作用12h，离心收集上清液，用于TNF-α、IL-6和IL-8含量测定。使用下面的公式计算抑制率：

结果见表1～3所示。

表1扁蒴藤素抑制TNF-α的分泌

备注：^##与空白对照组相比p＜0.01；^**与模型对照组相比p＜0.01

表2扁蒴藤素抑制IL-8的分泌

备注：^##与空白对照组相比p＜0.01；^*与模型对照组相比p＜0.05；^**与模型对照组相比p＜0.01

表3扁蒴藤素抑制IL-6的分泌

备注：^##与空白对照组相比p＜0.01；^*与模型对照组相比p＜0.05；^**与模型对照组相比p＜0.01

实验结果显示，扁蒴藤素能剂量依赖性地显著抑制LPS诱导的TNF-α、IL-8和IL-6的分泌。

实施例2扁蒴藤素对活性氧自由基的抑制

细胞培养：THP-1细胞株用含10％胎牛血清的RPMI 1640培养液，添加青霉素100U/mL、链霉素100U/mL，置37℃、5％CO₂培养箱内培养。

ROS(活性氧分子)含量测定：THP-1细胞1×10⁶/mL接种于24孔板中，每组平行4孔，空白对照组(DMSO)、LPS组(不加被测试样品)分别加入等量溶媒，扁蒴藤素组分别加入0.15μM、0.3μM和0.6μM扁蒴藤素，孵育2h，除空白对照组外，各孔均加入1μg/mL LPS作用12h，然后每孔均加入5μM DHR 123(二氢罗丹明123)再孵育30min，收集细胞，上流式细胞仪测定，结果见表4。

表4扁蒴藤素对ROS产生的影响

备注：^##与空白对照组相比p＜0.01；^*与模型对照组相比p＜0.05；^**与模型对照组相比p＜0.01

实验结果显示，扁蒴藤素能显著抑制LPS诱导的活性氧自由基的产生。

实施例3扁蒴藤素对THP-1细胞毒性的影响

细胞培养：THP-1细胞株用含10％胎牛血清的RPMI 1640培养液，添加青霉素100U/mL、链霉素100U/mL，置37℃、5％CO₂培养箱内培养。

方法：1×10⁴cells/孔接种于96孔板中，给药组分别加入0.15μM、0.3μM和0.6μM扁蒴藤素，空白对照组细胞加入等量的溶媒，在37℃培养，12小时后，每孔加入10μL MTT(5mg/mL)，共同孵育4h后，测定活细胞中琥珀酸脱氢酶活性，在490nm处测量OD值，结果以抑制率表示。实验结果见表5所示。

表5扁蒴藤素对THP-1细胞增殖的影响

实验结果显示，扁蒴藤素对细胞的增殖没有明显的抑制作用。

实施例4扁蒴藤素对小鼠内毒素模型中TNF-α分泌的影响

实验材料

1.1实验动物：昆明种小鼠，体重18-22克，购自上海斯莱克实验动物有限公司。

1.2受试药品及阳性对照药：扁蒴藤素(PayPay TECHNOLOGIES INC，深圳)，地塞米松注射液(天津药业集团)。

1.3试剂：大肠杆菌内毒素(LPS，E.coli 0111：B4)，sigma公司产品；肿瘤坏死因子(TNF-α)R&D公司产品，精美生物工程有限公司分装。

2、实验方法：

32只昆明种小鼠，分为4组：扁蒴藤素组(扁蒴藤素+LPS)，地塞米松组(Dex+LPS)，模型组(LPS)，空白对照组(溶媒组含体积等量的二甲基亚矾)，每组8只。对照组、模型组分别肌肉注射(im)等量溶媒，地塞米松组im地塞米松注射液(2mg/kg)，扁蒴藤素im扁蒴藤素4mg/kg，给药后2h，除空白对照组外，其余各组均腹腔注射(ip)LPS(65ng/鼠)，空白对照组注射等量生理盐水。4h后，眼眶采血，以ELISA法测定TNF-α，用抑制率表示实验结果。

表6扁蒴藤素对内毒素小鼠TNF-α的分泌影响

备注：^##与空白对照组相比p＜0.01；^**与模型对照组相比P＜0.01

实验结果显示，扁蒴藤素能显著地抑制内毒素小鼠TNF-α的分泌。

结论：从以上结果可知，扁蒴藤素无论是体内还是体外可显著抑制促炎细胞因子TNF、IL-6，趋化性细胞因子IL-8及活性氧自由基的分泌。因此，扁蒴藤素能用于促炎细胞因子TNF，IL-6，趋化性细胞因子IL-8及活性氧自由基过度分泌引起的炎症性病症的治疗及预防。

Claims (10)

1.扁蒴藤素在制备炎性细胞因子抑制剂中的应用。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述炎性细胞因子为促炎细胞因子、趋化性细胞因子或具有炎性特质的活性氧自由基。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述促炎细胞因子为TNF-α。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述炎性细胞因子抑制剂用于治疗下列病症中的一种或几种：全身炎性反应综合症、脓毒血症、多器官功能障碍综合症、类风湿性关节炎、骨关节炎、脊柱关节炎、炎症性肠病、心力衰竭、糖尿病、系统性红斑狼疮、硬皮病、结节病、皮肌炎、银屑病、急性髓性白血病、帕金森氏病、早老年痴呆、抑郁症、白塞氏病、慢性阻塞性肺病、哮喘、中枢性神经损伤、呼吸道病毒感染、多发性骨髓瘤、骨髓增生异常综合症、坏疽性脓皮病、移植物抗宿主病、葡萄膜炎、牙周炎、细菌感染、肥胖、神经性疼痛、偏头疼、紧张性疼痛、从发性头痛、神经痛、肌-骨骼疼痛、骨-外伤性疼痛、术后疼痛、癌症-相关疼痛、内脏疼痛、HIV-相关的疼痛。

5.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述促炎细胞因子为IL-6。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述炎性细胞因子抑制剂用于治疗下列病症中的一种或者几种：全身炎性反应综合症、脓毒血症、脓毒性休克、感染性休克、多器官功能障碍综合症、类风湿性关节炎、获得性免疫缺陷综合症、心脏粘液瘤、巨大淋巴结增生、急性脑出血、急性脑梗塞、脑损伤、脑损伤后感染性并发症、流感病毒性脑病、冠心病、重症胰腺炎、狼疮性肾炎、慢性肾功能不全、原发性肾病综合症、反流性肾病、失血性休克、阻塞性睡眠呼吸暂停综合症和肿瘤。

7.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述趋化性细胞因子为IL-8。

8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述炎性细胞因子抑制剂用于治疗下列病症中的一种或者几种：类风湿性关节炎、囊性纤维化、银屑病、慢性阻塞性肺疾病、成人呼吸窘迫综合症、急性鼻炎、自发性肺纤维化、石棉沉积病、败血症休克、内毒素血症、脑膜炎、溃疡性结肠炎、输血溶血反应、HIV感染以及动脉粥样硬化等炎症性疾病和心脑血管性疾病。

9.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述具有炎性特质的活性氧自由基选自下列组中的一种或多种：超氧化物阴离子、羟自由基、过氧化氢分子、氢过氧基、氢过氧化物和单线态氧。

10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述炎性细胞因子抑制剂用于治疗下列病症中的一种或者几种：多发性硬化病、膝骨关节炎、原发性的骨关节炎、糖尿病肾病、糖尿病、阿尔茨海默病、帕金森病、肌萎缩性侧索硬化症、家族性遗传性共济失调、肿瘤、动脉粥样硬化、缺血性心肌病和急性心肌梗死。