CN101519420A - 高速逆流色谱法制备高纯度扁蒴藤素的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种高速逆流色谱法制备高纯度扁蒴藤素的方法，包括：制备构成固定相和流动相的溶剂体系；调节流动相流速；调节主机转速；其特征在于，所述溶剂体系由石油醚、乙醇和水组成，三种组分的体积比为9～12∶9～10∶1～1.1，该溶剂体系的上相为固定相，下相为流动相。该方法分离条件温和，分离效率高，且分离时间短，能得到高纯度的扁蒴藤素。

Description

高速逆流色谱法制备高纯度扁蒴藤素的方法

技术领域

本发明涉及用高速逆流色谱法(HSCCC)制备高纯度扁蒴藤素的方法。

背景技术

南蛇藤(Celastrus orbiculatus Thumb)是我国民间常用的一种植物药，有驱风除湿，活血解毒消肿功效，主治筋骨疼痛、四肢麻木、风湿性关节炎、腰腿痛、闭经、小儿惊风、痧症、痢疾、肿毒、跌打损伤(守立人.现代中药学大辞典(下册)[M].北京：人民卫生出版社.2001.1457)。南蛇藤主要药用成分有倍半萜及倍半萜衍生物、生物碱、三萜、黄酮等四类物质，其中三萜类成分主要存在于南蛇藤属植物的根皮中，主要类型有羽扇豆烷型和齐墩果酸型。扁蒴藤素(Pristmerin)是药理活性很强的五环三萜类化合物，具有显著的抗肿瘤、抗炎活性。

扁蒴藤素在体外的抗癌活性筛选中，对P₃₈₈(IC₅₀为0.267μg/mL)及LAX细胞(IC₅₀为0.018μg/mL)有很强的抑制作用(蒋毅等.南蛇藤活性成分的研究.中草药1996；27(2)：73)。扁蒴藤素在体外对HL-60细胞的生长有明显抑制作用，处理时间在24～72h时抑制率与浓度呈正相关，IC₅₀分别为1.79、0.39、0.72和0.83ml/L。对Fe²⁺-抗坏血酸诱导的大鼠心、肝、肾组织匀浆MDA生成均有明显抑制作用，说明扁蒴藤素既有抗氧化作用，也有抗肿瘤作用(陈长瑞，李文广等.扁蒴藤素的抗氧化与抗肿瘤作用[J].中药药理与临床，2002；18(5)：20-21)。扁蒴藤素还有抗疟作用(Katchrinnee Pavanand，et al：Schizontocidal activity of Celastruspaniculatus Willd Against plasmodium falciparumin vitro，PhytotherapyResearch 1989；3(4)：136～139〕。扁蒴藤素腹腔注射0.156～0.625mg·kg^-1或肌肉注射1～4mg·kg^-1明显抑制小鼠耳肿和足肿(P<0.05)；肌肉注射2～4mg·kg^-1明显抑制小鼠毛细血管通透性增高(P<0.05)；肌肉注射1～2mg·kg^-1抑制大鼠腹膜炎白细胞渗出、蛋白质渗出及NAG释放，降低NO含量，抑制MDA生成，增强SOD及CAT活性。扁蒴藤素表现出明显的抗炎作用；抗炎作用可能与其抑制NO生成、清除氧自由基、抗脂质过氧化、稳定溶酶体膜有关。

扁蒴藤素药理活性，特别其抗肿瘤活性非常显著，自然界中含量低，且容易混有杂质。经过HPLC测定，发现扁蒴藤素在南蛇藤根皮部位含量很高，超过1％，利用此方法可以简单的从南蛇藤根皮粗提物中得到量多、高纯度扁蒴藤素。文献报道了用柱层析方法得到扁蒴藤素单体的方法(蒋毅等.南蛇藤活性成分的研究.中草药1996；27(2)：73)：南蛇藤根1500g，粉碎，用石油醚提取3次。浓缩提取液得7.22g半固体状物。通过低压硅胶柱层析分离，以不同比例的石油醚-乙酸乙酯洗脱，得到单体扁蒴藤素。但该方法操作步骤繁琐，过程中损失大，从而回收率低。

高速逆流色谱(High Speed Countercurrent Chromatography，简称HSCCC)是国际上于上世纪80年代以来在液-液分配色谱基础上发展起来的新型分离技术，其分离原理是利用螺旋柱在高速行星运动时产生的巨大离心力，使螺旋柱中互不相溶的两相不断混合，达到稳定的流体动力学平衡态，此时在螺旋柱中任何一部分，两相溶剂都反复进行着混合和静置的分配过程，这一过程频率极高，当柱心以800rpm旋转时，频率超过每秒13次。流动相不断地穿过固定相，同时保留其中的一相(固定相)，利用恒流泵连续输入另一相(流动相)，流动相载着溶质(样品)进入螺旋柱并不断反复穿过固定相，使样品在两相之间也不断反复地进行分配，由于样品中各组分在两相中分配系数不同，导致在螺旋柱中的移动速度不同，因而能使样品各组分按分配系数的次序，依次得到分离。

高速逆流色谱作为一种新型的分离技术，有许多优点是传统液-固色谱无法比拟的，因而有很广阔的应用前景。首先，它的流动相、间定相均为液体，不需要固体载体，避免了液-固色谱常会造成的固体载体对样品的不可逆吸附，可以保证样品在不损失任何一种组分的情况下得到分离，理论上样品回收率相当高；其次，它的分离效率高，可以达到几千个理论塔板数，尤其在天然产物组分分离提取中有较高的分离度，有的样品经过一次分离就可以得到一个甚至多个单体，并且分离时间也短，一般是几个小时即可完成一次分离：此外，它使用常规试剂，有广泛的液-液分配体系可供选择体系更换方便、快捷：它的进样量大，可以从毫克到克量级，进样体积可达20mL以上，这对于样品的纯化制备显示出惊人的优势。

但欲用HSCCC进行成功的分离，选择适宜的溶剂系统非常重要。不同的溶剂系统，具有不同的上、下相之比，其粘度、极性、密度等性质相差甚远，对相同的成分具有不同的溶解、分配能力，形成分配系数的差异，对分离效果产生不同的影响。目前，溶剂体系的选择还没有一套完整的理论依据。另外，在选定了溶剂体系后，有时需要对四个仪器运行参数(温度、转速、流动相流速、进样体积)进行设定。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服传统分离技术的缺陷，采用高速逆流色谱技术(HSCCC)制备高纯度扁蒴藤素。该方法分离条件温和，分离效率高，且分离时间短，能得到高纯度的扁蒴藤素。

本发明的技术方案如下：

高速逆流色谱法制备高纯度扁蒴藤素的方法，包括：制备构成固定相和流动相的溶剂体系；设置恒温循环器的温度；调节流动相流速；调节主机转速；其特征在于，所述溶剂体系由石油醚、乙醇和水组成，三种组分的体积比为9～12：9～10：1～1.1，该溶剂体系的上相为固定相，下相为流动相。

在不破坏体系平衡的调节下，可在上述范围内任意调节石油醚：乙醇：水的体积比，优选的体积比为10：10：1或10：9：1或11：9：1.1。

恒温循环器的温度须控制在22～27℃，优选25℃；主机转速须控制在800～880rpm范围内，优选840rpm；流动相的流速须控制在1.0～2.2ml/min范围内，优选1.6ml/min。

本发明的具体操作步骤如下：

南蛇藤干燥根皮(湖南省南部山区所产)用二氯甲烷冷浸提取，每次冷浸24小时，再回收溶剂，重复三次，得褐色干燥粉末状物质，即为粗提干燥物，精确称取二氯甲烷粗提干燥物，用固定相溶解样品，开启恒温循环器并设置温度，用双泵等比例同时泵入流动相(下相)和固定相(上相)，当溶剂从管路出口流出时，停止泵入固定相，设定流动相流速，同时启动主机电机，调节转速，十几分钟后，管柱内溶剂达成动态平衡，管柱出口处只有流动相流出。通过进样器注入样品，设定检测器的波长为254nm，在进样后约105分钟至430分钟出现扁蒴藤素峰，收集该流份，浓缩后得到纯扁蒴藤素单体。

由于采用了合理的溶剂体系，控制主机转速和流动相流速等工艺条件，用本发明方法可得到高纯度的扁蒴藤素。且该分离纯化过程条件温和，分离时间短，由于不引入酸碱，从而减少了化合物化学性质的变化，保持化合物的稳定而减少损失，化合物不流失也不存在死吸附。

具体实施方式

实施例1

南蛇藤干燥根皮100克(湖南省南部山区所产)用二氯甲烷冷浸提取，每次冷浸24小时，再回收溶剂，重复三次，得褐色干燥粉末状物质，即为粗提干燥物，精确称取二氯甲烷粗提干燥物11.2克。

精确称取二氯甲烷粗提干燥物1克，用石油醚：乙醇：水(溶剂体积比10：10：1)溶剂系统的上相溶解样品，开启恒温循环器，设置温度为25摄氏度，以该溶剂系统上相为固定相，下相为流动相，用双泵等比例同时泵入流动相(下相)和固定相(上相)，当溶剂从管路出口流出时，停止泵入固定相，设定流动相流速为2ml/min，同时开启主机电机，调节转速为880rpm，十几分钟后，管柱内溶剂系统达成动态平衡，管柱出口处只有流动相流出。通过进样器注入样品，设定波长为254nm，在进样后约180分钟出现扁蒴藤素峰，收集该流分，浓缩后得到纯扁蒴藤素102mg，纯度大于99.5％，相对进样前收率为10.2％，相对于药材1.142％。

实施例2

精确称取二氯甲烷粗提干燥物1.2克，用石油醚：乙醇：水(溶剂体积比10：9：1)溶剂系统的上相溶解样品，开启恒温循环器，设置温度为24摄氏度，以该溶剂系统上相为固定相，下相为流动相，用双泵等比例同时泵入流动相(下相)和固定相(上相)，当溶剂从管路出口流出时，停止泵入固定相，设定流动相流速为1.8ml/min，同时开启主机电机，调节转速为860rpm，十几分钟后，管柱内溶剂系统达成动态平衡，管柱出口处只有流动相流出。通过进样器注入样品，设定波长为254nm，在进样后约295分钟出现扁蒴藤素峰，收集该流分，浓缩后得到纯扁蒴藤素114mg，纯度大于99％，相对进样前收率为9.50％，相对于药材1.064％。

实施例3

精确称取二氯甲烷粗提干燥物1.6克，用石油醚：乙醇：水(溶剂体积比9：10：1)溶剂系统的上相溶解样品，开启恒温循环器，设置温度为23摄氏度，以该溶剂系统上相为固定相，下相为流动相，用双泵等比例同时泵入流动相(下相)和固定相(上相)，当溶剂从管路出口流出时，停止泵入固定相，设定流动相流速为2.2ml/min，同时开启主机电机，调节转速为840rpm，十几分钟后，管柱内溶剂系统达成动态平衡，管柱出口处只有流动相流出。通过进样器注入样品，设定波长为254nm，在进样后约105分钟出现扁蒴藤素峰，收集该流分，浓缩后得到纯扁蒴藤素143mg，纯度大于99％，相对进样前收率为8.938％，相对于药材1.001％。

实施例4

精确称取二氯甲烷粗提干燥物0.8克，用石油醚：乙醇：水(溶剂体积比10：10：1.1)溶剂系统的上相溶解样品，开启恒温循环器，设置温度为26摄氏度，以该溶剂系统上相为固定相，下相为流动相，用双泵等比例同时泵入流动相(下相)和固定相(上相)，当溶剂从管路出口流出时，停止泵入固定相，设定流动相流速为1.4ml/min，同时开启主机电机，调节转速为820rpm，十几分钟后，管柱内溶剂系统达成动态平衡，管柱出口处只有流动相流出。通过进样器注入样品，设定波长为254nm，在进样后约260分钟出现扁蒴藤素峰，收集该流分，浓缩后得到纯扁蒴藤素27mg，纯度大于98.5％，相对进样前收率为3.375％，相对于药材0.378％。

实施例5

精确称取二氯甲烷粗提干燥物1.9克，用石油醚：乙醇：水(溶剂体积比12：10：1.1)溶剂系统的上相溶解样品，开启恒温循环器，设置温度为22摄氏度，以该溶剂系统上相为固定相，下相为流动相，用双泵等比例同时泵入流动相(下相)和固定相(上相)，当溶剂从管路出口流出时，停止泵入固定相，设定流动相流速为1ml/min，同时开启主机电机，调节转速为800rpm，十几分钟后，管柱内溶剂系统达成动态平衡，管柱出口处只有流动相流出。通过进样器注入样品，设定波长为254nm，在进样后约430分钟出现扁蒴藤素峰，收集该流分，浓缩后得到纯扁蒴藤素189mg，纯度大于99％，相对进样前收率为9.947％，相对于药材1.114％。

实施例6

精确称取二氯甲烷粗提干燥物2克，用石油醚：乙醇：水(溶剂体积比11：9：1.1)溶剂系统的上相溶解样品，开启恒温循环器，设置温度为27摄氏度，以该溶剂系统上相为固定相，下相为流动相，用双泵等比例同时泵入流动相(下相)和固定相(上相)，当溶剂从管路出口流出时，停止泵入固定相，设定流动相流速为2.2ml/min，同时开启主机电机，调节转速为870rpm，十几分钟后，管柱内溶剂系统达成动态平衡，管柱出口处只有流动相流出。通过进样器注入样品，设定波长为254nm，在进样后约215分钟出现扁蒴藤素峰，收集该流分，浓缩后得到纯扁蒴藤素205mg，纯度大于99.5％，相对进样前收率为10.25％，相对于药材1.148％。

Claims (10)

1.高速逆流色谱法制备高纯度扁蒴藤素的方法，包括：制备构成固定相和流动相的溶剂体系；设置恒温循环器的温度；调节流动相流速；调节主机转速；其特征在于，所述溶剂体系由石油醚、乙醇和水组成，三种组分的体积比为9～12：9～10：1～1.1，该溶剂体系的上相为固定相，下相为流动相。

2.如权利要求1所述的制备高纯度扁蒴藤素的方法，其特征在于，所述恒温循环器的温度为22～27℃。

3.如权利要求2所述的制备高纯度扁蒴藤素的方法，其特征在于，所述恒温循环器的温度为25℃。

4.如权利要求1所述的制备高纯度扁蒴藤素的方法，其特征在于，所述流动相的流速为1.0～2.2ml/min。

5.如权利要求4所述的制备高纯度扁蒴藤素的方法，其特征在于，所述流动相的流速为1.6ml/min。

6.如权利要求1所述的制备高纯度扁蒴藤素的方法，其特征在于，所述主机转速为800～880rpm。

7.如权利要求6所述的制备高纯度扁蒴藤素的方法，其特征在于，所述主机转速为840rpm。

8.如权利要求1所述的制备高纯度扁蒴藤素的方法，其特征在于，所述溶剂体系的三种组分的体积比为10：10：1。

9.如权利要求1所述的制备高纯度扁蒴藤素的方法，其特征在于，所述溶剂体系的三种组分的体积比为10：9：1。

10.如权利要求1所述的制备高纯度扁蒴藤素的方法，其特征在于，所述溶剂体系的三种组分的体积比为11：9：1.1。