CN105497035A - 乌洛托品在制备炎性细胞因子抑制药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了乌洛托品在药物中的应用，涉及乌洛托品在制备炎性细胞因子抑制药物中的应用，属医药领域。本发明将乌洛托品应用于制备炎性细胞因子抑制药物，能有效地抑制炎性细胞因子的过度分泌。其中，所述炎性细胞因子为促炎细胞因子、趋化性细胞因子或具有炎性特质的活性氧自由基。本发明开拓了乌洛托品新的应用领域，发现通常在偏碱性的血液、组织中不分解的乌洛托品对动物体内炎性细胞因子有抑制作用，将经典、廉价、安全、治疗尿路细菌感染的乌洛托品药物应用于炎性细胞因子抑制剂。对治疗目前多种常见病症提供了另一种药物治疗途径。

Description

乌洛托品在制备炎性细胞因子抑制药物中的应用

技术领域

本发明涉及乌洛托品在药物中的应用，尤其涉及乌洛托品在制备炎性细胞因子抑制药物中的应用，属医药领域。

背景技术

炎症是指具有血管系统的活体组织对损伤因子发生的防御反应，包括感染性炎症与非感染性炎症，以炎性细胞浸润与促炎细胞因子释放为特征。炎症最主要的特征是通过机体的免疫系统募集大量炎症细胞、活化促炎症细胞、产生大量促炎细胞因子及具有炎性特质的活性氧自由基。与炎症性疾病发生、发展密切相关的细胞主要是单核/巨噬细胞。促炎细胞因子、活性氧自由基主要由单核/巨噬细胞分泌，并可通过炎症网络放大炎症反应，损伤局部组织。促炎细胞因子如白细胞介素(IL－6)、肿瘤坏死因子(TNF－a)、趋化蛋白(IP-10)和IL－8与炎症关系最为密切，过度分泌促炎细胞因子是导致多种疾病发生、发展的重要因素。研究表明，SARS诱导炎性细胞因子风暴是该病致患者死亡的主要原因(JMedVirol2005；75:185-194)。研究证明，IL－6、TNF－a、IP-10和IL－8的抑制剂能适用于类风湿性关节炎、脓毒性休克、感染性休克、多器官功能障碍综合症、骨关节炎、呼吸道病毒性感染、慢性心功能不全、脊柱关节病、高血压病、冠心病、糖尿病、心肌梗塞、系统性红斑狼疮、狼疮性肾炎、白塞氏病、硬皮病、结节病、皮肌炎、银屑病、慢性阻塞性肺病、哮喘、胰腺炎、肝硬化、炎症性肠病、获得性免疫缺陷综合症、帕金森氏病、早老年痴呆、病毒性脑病、急性髓性白血病、血管性头痛、全身炎性反应综合症、脓毒血症、中枢性神经损伤、急性脑出血、脑梗塞、脑损伤、脑损伤后感染性并发症、慢性肾功能不全、原发性肾病综合症、反流性肾病、失血性休克、阻塞性睡眠呼吸暂停综合症、坏疽性脓皮病、多发性骨髓炎、葡萄膜炎、骨髓增生异常综合症、肿瘤、移植物抗宿主病、牙周炎、细菌感染、肥胖、神经性疼痛、偏头疼、紧张性疼痛、从发性头痛、神经痛、肌－骨骼疼痛、骨－外伤性疼痛、术后疼痛、癌症－相关疼痛、内脏疼痛、HIV－相关的疼痛。炎性细胞因子抑制剂是目前新药开发的重要的作用靶点。

TNF－a是1975年发现的一个能被内毒素脂多糖(LPS)诱导的糖蛋白，活化的单核/巨噬细胞是TNF—a产生的重要来源，此外，肥大细胞、T淋巴细胞、B淋巴细胞、NK细胞、内皮细胞、心肌细胞、成纤维细胞及骨细胞等也能分泌。TNF－a在正常的个体中几乎检测不到，但在炎症性疾病或感染性疾病病人的血清及组织中能检测到高浓度的TNF－a，而且血清中TNF－a浓度高低与疾病的恶化程度呈正相关。研究表明，TNF－a能够介导血管内皮细胞与白细胞相互作用，促进E－选择素、血管细胞粘附分子、细胞粘附分子、趋化性细胞因子等介质表达，活化环氧化酶－2等酶活性；增加活性氧自由基、抑制或杀灭肿瘤细胞、提高中性粒细胞的吞噬能力、参与炎症反应、抗感染、增加血管内凝血等生物活性。已有的文献表明，抑制TNF－a的释放可以用于多种病症的治疗：全身炎性反应综合症、脓毒血症、多器官功能障碍综合症、类风湿性关节炎、骨关节炎、脊柱关节炎、炎症性肠病、心力衰竭、糖尿病、系统性红斑狼疮、硬皮病、结节病、皮肌炎、银屑病、急性髓性白血病、帕金森氏病、多发性骨髓瘤、骨髓增生异常综合症、坏疽性脓皮病、移植物抗宿主病、葡萄膜炎、牙周炎、细菌感染、肥胖、神经性疼痛、偏头疼、紧张性疼痛、从发性头痛、神经痛、肌－骨骼疼痛、骨－外伤性疼痛、术后疼痛、癌症－相关疼痛、内脏疼痛、HIV－相关的疼痛。以TNF－a为靶点是目前新药开发一个热点领域，一些TNF－a的抑制剂如Humira，Remicade，Enbrel等已被批准用于治疗类风湿性关节炎及炎症性疾病如强直性脊柱炎、crohn病，并取得了良好的治疗效果。

IL－6是一个多效能的促炎细胞因子，多种细胞能分泌IL－6，其中单核/巨噬细胞是IL－6的主要来源。IL－6影响B细胞增殖分化、促进T细胞激活、参与CTL分化过程、增强血细胞分化过程，IL－6本身具有生长因子样的作用或者抗凋亡作用，此外，IL－6还参与机体的应激过程、免疫应答、炎症等病理过程，而过表达IL－6与多种疾病有关，如全身炎性反应综合症、脓毒血症、脓毒性休克、感染性休克、多器官功能障碍综合症、类风湿性关节炎、获得性免疫缺陷综合症、心脏粘液瘤、巨大淋巴结增生、急性脑出血、急性脑梗塞、脑损伤、脑损伤后感染性并发症、流感病毒性脑病、冠心病、重症胰腺炎、狼疮性肾炎、慢性肾功能不全、原发性肾病综合症、反流性肾病、失血性休克、阻塞性睡眠呼吸暂停综合症和肿瘤等有关。已被证实tocilizumab(一种IL－6受体的拮抗剂)对风湿性关节炎、巨大淋巴结增生、Crohn氏病有良好的治疗效果。

IL－8是强力的中性粒细胞、T淋巴细胞及嗜碱性粒细胞趋化因子，是一种重要的炎症介质。脂多糖、TNF－a等多种物质能诱导单核细胞、巨噬细胞、淋巴细胞、血管内皮细胞等产生IL－8，其中单核巨噬细胞是IL－8的主要来源。IL－8对中性粒细胞有较强的趋化和激活作用，参与局部炎症的形成，是一种新发现的炎性细胞因子。IL－8能激活中性粒细胞，诱导其变形、趋化、脱颗粒、短暂上升胞浆内钙、合成生物活性脂类、上调整合素及诱导呼吸爆发等活性，此外，对T淋巴细胞和嗜碱性粒细胞也有趋化作用。IL－8属于调节炎症的介质，对炎症和免疫过程有重要的调节作用，在类风湿性关节炎、囊性纤维化、银屑病、慢性阻塞性肺疾病、成人呼吸窘迫综合症、急性鼻炎、自发性肺纤维化、石棉沉积病、败血症休克、内毒素血症、脑膜炎、溃疡性结肠炎、输血溶血反应、HIV感染以及动脉粥样硬化等炎症性疾病和心脑血管性疾病的发生、发展及加重病情中有重要作用，也是目前药物治疗的一个重要靶点。IP-10、单核趋化蛋白(MCP-1)也是重要的细胞趋化因子，与IL-8有类似的作用。

活性氧自由基主要有：超氧化物阴离子、羟自由基、过氧化氢分子、氢过氧基、氢过氧化物和单线态氧等，机体在代谢过程中不断产生活性氧自由基，也不断地被消除，使机体维持有利无害、低水平、稳定平衡的生理性自由基含量。但过量自由基将导致氧化应激发生，导致机体细胞非特异性氧化损伤，而引发各种疾病，如多发性硬化病、膝骨关节炎、原发性的骨关节炎、糖尿病肾病、糖尿病、阿尔茨海默病、帕金森病、肌萎缩性侧索硬化症、家族性遗传性共济失调、肿瘤、动脉粥样硬化、缺血性心肌病和急性心肌梗死。

乌洛托品是一种经典的廉价的安全的治疗尿路细菌感染的药物。其作用机理为，乌洛托品在偏酸性尿液中可分解出甲醛，对病菌有杀灭作用，而在偏碱性的血液、组织中则不分解。目前乌洛托品对炎性细胞因子有抑制作用未见相关报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种乌洛托品在医药领域中的新应用，具体地为在制备炎性细胞因子抑制药中的应用。在本发明中，所述乌洛托品能有效地抑制炎性细胞因子的过度分泌。

其中，所述炎性细胞因子较佳地为促炎细胞因子、趋化性细胞因子或具有炎性特质的活性氧自由基。所述促炎细胞因子较佳地为TNF－a或IL－6；所述趋化性细胞因子较佳地为IL－8、MCP-1、IP-10；所述具有炎性特质的活性氧自由基选自下列组中的一种或多种：超氧化物阴离子、羟自由基、过氧化氢分子、氢过氧基、氢过氧化物和单线态氧。

在本发明中，所述乌洛托品作为炎性细胞因子抑制剂可以用于下列病症的治疗，包括但不限于：类风湿性关节炎、脓毒性休克、感染性休克、多器官功能障碍综合症、类风湿性关节炎、骨关节炎、呼吸道病毒性感染、慢性心功能不全、脊柱关节病、高血压病、冠心病、糖尿病、心肌梗塞、系统性红斑狼疮、狼疮性肾炎、白塞氏病、硬皮病、结节病、皮肌炎、银屑病、慢性阻塞性肺病、哮喘、胰腺炎、肝硬化、炎症性肠病、获得性免疫缺陷综合症、帕金森氏病、早老年痴呆、病毒性脑病、急性髓性白血病、血管性头痛、全身炎性反应综合症、脓毒血症、中枢性神经损伤、急性脑出血、脑梗塞、脑损伤、脑损伤后感染性并发症、慢性肾功能不全、原发性肾病综合症、反流性肾病，失血性休克、阻塞性睡眠呼吸暂停综合症、坏疽性脓皮病、多发性骨髓炎、葡萄膜炎、骨髓增生异常综合症、肿瘤、移植物抗宿主病、牙周炎、细菌感染、肥胖。

在本发明中，乌洛托品作为TNF－a抑制剂，可用于治疗下列病症，包括但不局限于：全身炎性反应综合症、脓毒血症、多器官功能障碍综合症、类风湿性关节炎、骨关节炎、脊柱关节炎、炎症性肠病、心力衰竭、糖尿病、系统性红斑狼疮、硬皮病、结节病、皮肌炎、银屑病、急性髓性白血病、帕金森氏病、早老年痴呆、抑郁症、白塞氏病、慢性阻塞性肺病、哮喘、中枢性神经损伤、呼吸道病毒感染、多发性骨髓瘤、骨髓增生异常综合症、坏疽性脓皮病、移植物抗宿主病、葡萄膜炎、牙周炎、细菌感染、牙周炎、细菌感染、肥胖、神经性疼痛、偏头疼、紧张性疼痛、从发性头痛、神经痛、肌－骨骼疼痛、骨－外伤性疼痛、术后疼痛、癌症－相关疼痛、内脏疼痛、HIV－相关的疼痛。

在本发明中，乌洛托品作为IL－6抑制剂，可用于但不局限于治疗下列病症：全身炎性反应综合症、脓毒血症、脓毒性休克、感染性休克、多器官功能障碍综合症、类风湿性关节炎、获得性免疫缺陷综合症、心脏粘液瘤、巨大淋巴结增生、急性脑出血、急性脑梗塞、脑损伤、脑损伤后感染性并发症、流感病毒性脑病、冠心病、重症胰腺炎、狼疮性肾炎、慢性肾功能不全、原发性肾病综合症、反流性肾病、失血性休克、阻塞性睡眠呼吸暂停综合症和肿瘤。

在本发明中，乌洛托品作为IL－8、MCP-1、IP-10抑制剂可用于治疗下列病症，包括但不局限于：类风湿性关节炎、囊性纤维化、银屑病、慢性阻塞性肺疾病、流感、成人呼吸窘迫综合症、急性鼻炎、自发性肺纤维化、石棉沉积病、败血症休克、内毒素血症、脑膜炎、溃疡性结肠炎、输血溶血反应、HIV感染以及动脉粥样硬化等炎症性疾病和心脑血管性疾病。

在本发明中，乌洛托品作为活性氧自由基抑制剂，可用于但不局限于下列病症的治疗：多发性硬化病、膝骨关节炎、原发性的骨关节炎、糖尿病肾病、糖尿病、阿尔茨海默病、帕金森病、肌萎缩性侧索硬化症、家族性遗传性共济失调、肿瘤、动脉粥样硬化、缺血性心肌病和急性心肌梗死

在本发明中，所述乌洛托品可以单独适用也可以药物组合形式适用。药物组合形式包括作为活性成分的乌洛托品及药学上可接受的载体。

在本发明中，所述乌洛托品作为炎性细胞因子抑制剂有效剂量范围为0.1-100mg/kg/日/人，以上用量是根据体外实验及动物药理实验结果推算的，因动物与人体的差异性、体内外实验的差异性、疾病的差异性、特定细胞因子作用的差异性，允许临床实际用量有所调整。

在本发明中，所述乌洛托品作为炎性细胞因子抑制剂用法用量可根据具体疾病进行选择。

本发明创新点及优点在于：开拓了乌洛托品新的应用领域，发现通常在偏碱性的血液、组织中不分解的乌洛托品对动物体内炎性细胞因子有抑制作用，将经典、廉价、安全、治疗尿路细菌感染的乌洛托品药物应用于炎性细胞因子抑制剂。对治疗目前多种常见病症提供了另一种药物治疗途径。

具体实施方式

为对本发明进行更好地说明，举实施例如下：

材料及仪器：乌洛托品、地塞米松(Dex)由鹤壁泰德生化科技有限公司提供；SABC免疫组化试剂盒、小鼠TNF－a、IP－10、MCP－1多克隆抗体、DAB显色剂、多聚赖氨酸、柠檬酸缓冲盐均为武汉博士德有限公司提供。流感病毒亚洲甲型鼠肺适应株A/FM/1/34(H1N1)(FM1)，由中国预防医学科学院病毒研究所提供，采用郭元吉方法(流行性感冒病毒及其实验技术，中国三峡出版社，1997，,111-112)测定其对小鼠的半数致死量(LD50)。BALB/c小鼠，体重(16±2)g，雄性，由郑州大学实验动物中心提供。病理切片机(Leica)，日本OlympusBX51光学显微镜，美国Image-ProRPlusVersion5.0(IPP)图像分析软件。美国Beckman低温高速离心机，美国(Becton-Dickinson,SanDiego)流式细胞仪，奥地利TECAN公司酶标仪，上海诵诚实业发展有限公司细胞培养箱。THP－1细胞株购自中国科学院细胞库，RPMI1640培养基为美国Gibco公司产品；胎牛血清为美国Hyclone公司产品；脂多糖(LPS)为Sigma公司产品；MTT为Sigma公司产品；人TNF－a、IL－6、IL－8ELISA测定试剂盒为R&D公司产品；DHR123为美国Sigma公司产品；其他试剂均为国产分析纯。

实施例1.乌洛托品对流感病毒感染小鼠肺组织中MCP－1、TNF－a和IP－10表达的影响(n＝9)

实验方法：

1实验动物分组及给药：将小鼠随机分为以下3组:正常对照组，病毒感染模型组，乌洛托品治疗组(40mg/kg·d，相当成人临床等效剂量)。小鼠以乙醚轻度麻醉后，正常对照组以无菌生理盐水滴鼻，每只25uL止；其余各组以25uLFM1病毒液滴鼻，感染量为15LD50。模型复制后1h给药，连续给药4天，2次/日，每次20mg/kg，各组均灌胃给药，正常对照和模型组用无菌蒸馏水灌胃。

2.取材方法：感染后第5天，先禁食不禁水8h以上，脱颈处死各组小鼠，取出肺组织，生理盐水洗涤两次，10％的福尔马林液中固定，按常规方法石蜡包埋做HE染色组织切片和免疫组化切片。

3.光学显微镜肺组织病理变化分级方法：“-”肺组织正常；“+”细支气管周围及肺组织出现炎细胞浸润，间质毛细血管扩张充血；“++”细支气管有大量的炎细胞浸润，肺泡渗出物增多，部分已实变，间质明显增厚，“+++”肺组织大部分实变。

4.图像定量分析：每组切片随机选3张，每张取3个高倍视野(×200)，用高清晰度OlympusBXS1光学显微镜加制冷摄像头，采集图像，Image—ProRplusversion5.0(up)图像分析软件测定肺内TNF—a、IP-10、MCP-1蛋白表达。测定阳性颗粒(棕黄色)的积分光密度(IOD)，IOD值越大，说明其蛋白表达越多。

5.统计学处理：免疫组化数据为计量资料，实验数据用SPss12.0统计软件行单因素方差分析；肺脏组织病理学变化用非参数检验，以P<0.05为有显著性差异。

注：与正常对照组比较，＊＊P<0.01，与病毒感染模型组比，#P<0.05。

注：与正常对照组比较，**P<0.01,与病毒感染模型组比，#P<0.05，##P<0.01。

以上结果表明：乌洛托品对MCP-1、IP-10以及TNF-a的表达有明显抑制作用，并能显著减轻肺组织损伤。

实施例2.乌洛托品体外抑制TNF－a、IL－8以及IL－6的释放

细胞培养：THP－1细胞株用含质量百分10％胎牛血清的RPMI1640培养液，添加青霉素100U/mL、链霉素100U/mL，置37C、5％CO2培养箱内培养。

细胞因子(TNF－a、IL－8和IL－6)含量测定：THP－1细胞以细胞数1X106/mL接种于48孔板中，分为空白对照组(DMSO)、LPS组(不加入测试样品)、乌洛托品组及地基米松(Dex)组，每个样品3平行孔。乌洛托品及Dex作用4h后，除空白对照组外，各孔均加入1ug/mLLPS作用12h，离心收集上清液，用于TNF－a、IL－6和IL－8含量测定。适用下面的公式计算抑制率：

抑制率(％)＝(1-(药物处理组－空白对照组)/(模型处理组－空白对照组))X100结果见表3～5所示。

注：##与空白对照组相比p<0.01；**与模型对照组相比p<0.01

注：##与空白对照组相比p<0.01；*与模型对照组相比p<0.05；**与模型对照组相比p<0.01

注：##与空白对照组相比p<0.01；*与模型对照组相比p<0.05；**与模型对照组相比p<0.01

以上实验结果表明：乌洛托品在体外实验中可以明显地抑制TNF-a、IL-8和IL-6的表达。

实施例3.乌洛托品对活性氧自由基的抑制

细胞培养：THP－1细胞株用含质量百分10％胎牛血清的RPMI1640培养液，添加青霉素100U/mL、链霉素100U/mL，置37C、5％CO2培养箱内培养。

ROS(活性氧分子)含量测定：THP－1细胞1X106/mL接种于24孔板中，每组平行4孔，空白对照组(DMSO)、LPS组(不加被测试样品)分别加入等量溶媒，乌洛托品组分别加入0.1mg/mL乌洛托品，孵育2h，除空白对照组外，各孔均加入1ug/mLLPS作用12h，然后每孔均加入5uMDHR123(二氢罗丹明123)再孵育30min，收集细胞，上流式细胞仪测定，结果见表6。

注：##与空白对照组相比p<0.01；*与模型对照组相比p<0.05；**与模型对照组相比p<0.01

以上实验结果表明：乌洛托品能显著抑制活性氧自由基的产生。

将乌洛托品应用于抑制促炎细胞因子、趋化性细胞因子或具有炎性特质的活性氧自由基药物的制备具有良好的应用前景。

Claims (7)

1.乌洛托品在制备炎性细胞因子抑制药物中的应用，其特征在于，所述炎性细胞因子为促炎细胞因子、趋化性细胞因子或具有炎性特质的活性氧自由基。

2.如权利要求1所述乌洛托品在制备炎性细胞因子抑制药物中的应用，其特征在于，所述促炎细胞因子为TNF-a，用于治疗下列病症药物的制备：全身炎性反应综合症、脓毒血症、多器官功能障碍综合症、类风湿性关节炎、骨关节炎、脊柱关节炎、炎症性肠病、心力衰竭、糖尿病、系统性红斑狼疮、硬皮病、结节病、皮肌炎、银屑病、急性髓性白血病、帕金森氏病、早老年痴呆、抑郁症、白塞氏病、慢性阻塞性肺病、哮喘、中枢性神经损伤、呼吸道病毒感染、多发性骨髓瘤、骨髓增生异常综合症、坏疽性脓皮病、移植物抗宿主病、葡萄膜炎、牙周炎、细菌感染、肥胖、神经性疼痛、偏头痛、紧张性疼痛、从发性头痛、神经痛、肌－骨骼疼痛、骨外伤性疼痛、术后疼痛、癌症相关疼痛、内脏疼痛或HIV相关的疼痛。

3.如权利要求1所述的乌洛托品在制备炎性细胞因子抑制药物中的应用，其特征在于，所述促炎细胞因子为IL－6，用于治疗下列病症药物的制备：全身炎性反应综合症、脓毒血症、脓毒性休克、感染性休克、多器官功能障碍综合症、类风湿性关节炎、获得性免疫缺陷综合症、心脏粘液瘤、巨大淋巴结增生、急性脑出血、急性脑梗塞、脑损伤、脑损伤后感染性并发症、流感、流感病毒性脑病、冠心病、重症胰腺炎、狼疮性肾炎、慢性肾功能不全、原发性肾病综合症、反流性肾病、失血性休克、阻塞性睡眠呼吸暂停综合症或肿瘤。

4.如权利要求1所述的乌洛托品在制备炎性细胞因子抑制药物中的应用，其特征在于，所述趋化性细胞因子为IL－8，用于治疗下列病症药物的制备：类风湿性关节炎、囊性纤维化、银屑病、慢性阻塞性肺疾病、成人呼吸窘迫综合症、急性鼻炎、自发性肺纤维化、石棉沉积病、败血症休克、内毒素血症、流感、脑膜炎、溃疡性结肠炎、输血溶血反应、HIV感染以及动脉粥样硬化或心脑血管性疾病。

5.如权利要求1所述的乌洛托品在制备炎性细胞因子抑制药物中的应用，其特征在于，所述趋化性细胞因子为MCP-1，用于治疗下列病症药物的制备：病毒性感染、细菌感染、类风湿性关节炎、囊性纤维化、银屑病、慢性阻塞性肺疾病、成人呼吸窘迫综合症、急性鼻炎、自发性肺纤维化、石棉沉积病、败血症休克、内毒素血症、流感、脑膜炎或溃疡性结。

6.如权利要求1所述的乌洛托品在制备炎性细胞因子抑制药物中的应用，其特征在于，所述趋化性细胞因子为IP-10，用于治疗下列病症药物的制备：病毒性感染、细菌感染、类风湿性关节炎、囊性纤维化、银屑病或慢性阻塞性肺疾。

7.如权利要求1所述的乌洛托品在制备炎性细胞因子抑制药物中的应用，其特征在于，所述具有炎性特质的活性氧自由基选自下列组中的一种或多种：超氧化物阴离子、羟自由基、过氧化氢分子、氢过氧基、氢过氧化物或单线态氧，用于治疗下列病症药物的制备：多发性硬化病、膝骨关节炎、原发性的骨关节炎、糖尿病肾病、糖尿病、阿尔茨海默病、帕金森病、肌萎缩性侧索硬化症、家族性遗传性共济失调、肿瘤、动脉粥样硬化、缺血性心肌病或急性心肌梗死。