CN102205076B - 一种具有镇痛活性的三棱总酚的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种具有镇痛活性的三棱总酚的制备方法。将三棱粉碎，过40-80目筛，置提取罐中，加入体积量V：三棱粉末重量Kg为5-10:1的50%-95%乙醇，浸渍12小时；将浸渍的三棱回流提取2-4次，每次提取1-3小时，滤过，合并提取液，浓缩，干燥，得到三棱的醇提物；将三棱醇提物干法上聚酰胺柱，先分别以水和5%乙醇洗脱，再用40%-65%的乙醇洗脱，薄层色谱检识，收集40%-65%乙醇洗脱的馏分，浓缩，减压干燥，得三棱总酚，总酚含量为50%-99%。采用醋酸扭体法对制得的三棱总酚进行镇痛活性试验，结果显示三棱总酚物具有明显的镇痛作用。
Description
技术领域
本发明属于医药领域，涉及一种从中药三棱中提取并富集具有镇痛活性的总酚的制备方法。
技术背景
中药三棱为黑三棱科植物黑三棱(Sparganium stoloniferum Buch.—Hma.)的块茎，始载于唐代《本草拾遗》并沿用至今，其药用价值已受广泛肯定。其性苦、平，入肝、脾经，具有破血行气、消积止痛等功能，属活血化瘀中药。三棱临床应用广泛，常用于治疗肿瘤、肝脾肿大、胁肋疼痛、产后瘀血、盆腔炎等证，疗效确切。三棱的镇痛活性明显，以昆明小鼠为实验，分别采用醋酸扭体法和热板法实验，结果表明：黑三棱的氯仿、乙酸乙酯、正丁醇及水的提取物均具有镇痛作用，且乙酸乙酯提取物的镇痛作用最明显[21邓英君. 三棱不同提取物镇痛及抗凝作用研究[J].时珍国医国药,1999,10(12):882—883.]。三棱生药经炮制后，其镇痛作用有较明显的提高。同样采用上述实验方法对生三棱、醋炙三棱、醋蒸三棱及醋煮三棱进行镇痛实验，结果显示各炮制品的镇痛作用均增强，且醋炙三棱的镇痛作用最显著[22陆兔林等. 三棱炮制品不同提取物镇痛作用研究[J].三棱炮制品不同提取物镇痛作用研究,1998,20(8)：22—23.]。
现代药理研究表明，多酚类成分具有较强的镇痛活性（Ghannadi A，J Med Food. 2005 ，8(4):488-93；V Hajhashemi，Research in Pharmaceutical Science，2007,92-98），而三棱含有苯丙素类、口山 酮类、黄酮类等多酚类成分，如：阿魏酸及其苷类衍生物、山奈酚、芦丁、芒柄花素、黄酮醇、三棱双苯内酯、2,7-二羟基呫吨酮、三棱二苯乙炔等（董学等.齐鲁药事，2005，24（10），612；董学等，药学学报, 2008, 43(1)：63-66；孔丽娟等，中草药，2011,42（3）:440-4442）.但三棱总酚类成分的制备方法及其镇痛活性未见报道。
发明内容
发明目的：本发明的目的是提供具有镇痛活性的三棱总酚的制备方法。本发明的制备方法能有效提取分离三棱中的总酚，提取物中总酚含量高，工艺完善、合理；所制得的三棱总酚具有明显的镇痛活性。
技术方案：本发明提供一种具有镇痛活性的三棱总酚的制备方法，具体包括以下步骤：
(1)将三棱粉碎，过40-80目筛，得到三棱粉末备用；
(2)取步骤（1）得到的三棱粉末置提取罐中，加入50%-95%乙醇，加入乙醇的体积量V：三棱粉末重量Kg的比例为5-10:1，浸渍12小时备用；
(3)取步骤（2）得到的浸渍三棱回流提取2-4次，每次提取1-3小时，滤过，合并提取液，浓缩，干燥，得到三棱的醇提物备用；
(4)取步骤（3）得到的提物三棱醇提物，以三棱醇提物:聚酰胺=1:1.5的质量比拌样，上聚酰胺柱；先分别用水和5%乙醇洗脱，接着用40%-65%的乙醇洗脱，薄层色谱检识，收集40%-65%乙醇洗脱的馏分，浓缩，减压干燥，得三棱总酚，总酚含量为50%-99%。
步骤（1）中所述的三棱粉末的粒径为过60目筛。
步骤（2）中加入的乙醇浓度为75%，加入乙醇的体积量V：三棱粉末重量Kg比例为8:1。
步骤（3）中的提取条件为持续回流2小时，连续提取3次。
步骤（4）中收集65%乙醇洗脱的馏分。
将得到的三棱总酚，采用醋酸扭体法对三棱总酚进行镇痛活性试验，结果表明三棱总酚痛作用明显。
具体实施方式：
实施例1：
取三棱5Kg，将其粉碎，过40目筛，置提取罐中，加入体积量V：三棱粉末重量Kg为5:1的50%乙醇，浸渍12小时；将浸渍的三棱回流提取2次，每次提取1小时，滤过，合并提取液，浓缩，干燥，得到三棱的醇提物；将三棱醇提物干法上聚酰胺柱，先分别以水和5%乙醇洗脱，再用40%的乙醇洗脱，聚酰胺薄层色谱检识，收集40%乙醇洗脱的馏分，浓缩，减压干燥，得三棱总酚，含量为50.3%。
实施例2：
取三棱5Kg，将其粉碎，过60目筛，置提取罐中，加入体积量V：三棱粉末重量Kg为5:1的50%乙醇，浸渍12小时；将浸渍的三棱回流提取2次，每次提取1小时，滤过，合并提取液，浓缩，干燥，得到三棱的醇提物；将三棱醇提物干法上聚酰胺柱，先分别以水和5%乙醇洗脱，再用40%的乙醇洗脱，聚酰胺薄层色谱检识，收集40%乙醇洗脱的馏分，浓缩，减压干燥，得三棱总酚，含量为57.8%。
实施例3：
取三棱5Kg，将其粉碎，过80目筛，置提取罐中，加入体积量V：三棱粉末重量Kg为5:1的50%乙醇，浸渍12小时；将浸渍的三棱回流提取2次，每次提取1小时，滤过，合并提取液，浓缩，干燥，得到三棱的醇提物；将三棱醇提物干法上聚酰胺柱，先分别以水和5%乙醇洗脱，再用40%的乙醇洗脱，聚酰胺薄层色谱检识，收集40%乙醇洗脱的馏分，浓缩，减压干燥，得三棱总酚，含量为53.2%。
实施例4：
取三棱5Kg，将其粉碎，过60目筛，置提取罐中，加入体积量V：三棱粉末重量Kg为8:1的50%乙醇，浸渍12小时；将浸渍的三棱回流提取2次，每次提取1小时，滤过，合并提取液，浓缩，干燥，得到三棱的醇提物；将三棱醇提物干法上聚酰胺柱，先分别以水和5%乙醇洗脱，再用40%的乙醇洗脱，聚酰胺薄层色谱检识，收集40%乙醇洗脱的馏分，浓缩，减压干燥，得三棱总酚，含量为59.4%。
实施例5：
取三棱5Kg，将其粉碎，过60目筛，置提取罐中，加入体积量V：三棱粉末重量Kg为10:1的50%乙醇，浸渍12小时；将浸渍的三棱回流提取2次，每次提取1小时，滤过，合并提取液，浓缩，干燥，得到三棱的醇提物；将三棱醇提物干法上聚酰胺柱，先分别以水和5%乙醇洗脱，再用40%的乙醇洗脱，聚酰胺薄层色谱检识，收集40%乙醇洗脱的馏分，浓缩，减压干燥，得三棱总酚，含量为59.6%。
实施6：
取三棱5Kg，将其粉碎，过60目筛，置提取罐中，加入体积量V：三棱粉末重量Kg为8:1的75%乙醇，浸渍12小时；将浸渍的三棱回流提取2次，每次提取1小时，滤过，合并提取液，浓缩，干燥，得到三棱的醇提物；将三棱醇提物干法上聚酰胺柱，先分别以水和5%乙醇洗脱，再用40%的乙醇洗脱，聚酰胺薄层色谱检识，收集40%乙醇洗脱的馏分，浓缩，减压干燥，得三棱总酚，含量为71.6%。
实施例7：
取三棱5Kg，将其粉碎，过60目筛，置提取罐中，加入体积量V：三棱粉末重量Kg为8:1的95%乙醇，浸渍12小时；将浸渍的三棱回流提取2次，每次提取1小时，滤过，合并提取液，浓缩，干燥，得到三棱的醇提物；将三棱醇提物干法上聚酰胺柱，先分别以水和5%乙醇洗脱，再用40%的乙醇洗脱，聚酰胺薄层色谱检识，收集40%乙醇洗脱的馏分，浓缩，减压干燥，得三棱总酚，含量为65.1%。
实施例8：
取三棱5Kg，将其粉碎，过60目筛，置提取罐中，加入体积量V：三棱粉末重量Kg为8:1的75%乙醇，浸渍12小时；将浸渍的三棱回流提取3次，每次提取1小时，滤过，合并提取液，浓缩，干燥，得到三棱的醇提物；将三棱醇提物干法上聚酰胺柱，先分别以水和5%乙醇洗脱，再用40%的乙醇洗脱，聚酰胺薄层色谱检识，收集40%乙醇洗脱的馏分，浓缩，减压干燥，得三棱总酚，含量为75.2%。
实施例9：
取三棱5Kg，将其粉碎，过60目筛，置提取罐中，加入体积量V：三棱粉末重量Kg为8:1的75%乙醇，浸渍12小时；将浸渍的三棱回流提取4次，每次提取1小时，滤过，合并提取液，浓缩，干燥，得到三棱的醇提物；将三棱醇提物干法上聚酰胺柱，先分别以水和5%乙醇洗脱，再用40%的乙醇洗脱，聚酰胺薄层色谱检识，收集40%乙醇洗脱的馏分，浓缩，减压干燥，得三棱总酚，含量为75.5%。
实施例10：
取三棱5Kg，将其粉碎，过60目筛，置提取罐中，加入体积量V：三棱粉末重量Kg为8:1的75%乙醇，浸渍12小时；将浸渍的三棱回流提取3次，每次提取2小时，滤过，合并提取液，浓缩，干燥，得到三棱的醇提物；将三棱醇提物干法上聚酰胺柱，先分别以水和5%乙醇洗脱，再用40%的乙醇洗脱，聚酰胺薄层色谱检识，收集40%乙醇洗脱的馏分，浓缩，减压干燥，得三棱总酚，含量为81.7%。
实施例11：
取三棱5Kg，将其粉碎，过60目筛，置提取罐中，加入体积量V：三棱粉末重量Kg为8:1的75%乙醇，浸渍12小时；将浸渍的三棱回流提取3次，每次提取3小时，滤过，合并提取液，浓缩，干燥，得到三棱的醇提物；将三棱醇提物干法上聚酰胺柱，先分别以水和5%乙醇洗脱，再用40%的乙醇洗脱，聚酰胺薄层色谱检识，收集40%乙醇洗脱的馏分，浓缩，减压干燥，得三棱总酚，含量为82.4%。
实施例12：
取三棱5Kg，将其粉碎，过60目筛，置提取罐中，加入体积量V：三棱粉末重量Kg为8:1的75%乙醇，浸渍12小时；将浸渍的三棱回流提取3次，每次提取2小时，滤过，合并提取液，浓缩，干燥，得到三棱的醇提物；将三棱醇提物干法上聚酰胺柱，先分别以水和5%乙醇洗脱，再用55%的乙醇洗脱，聚酰胺薄层色谱检识，收集55%乙醇洗脱的馏分，浓缩，减压干燥，得三棱总酚，含量为89.6%。
实施例13：
取三棱5Kg，将其粉碎，过60目筛，置提取罐中，加入体积量V：三棱粉末重量Kg为8:1的75%乙醇，浸渍12小时；将浸渍的三棱回流提取3次，每次提取2小时，滤过，合并提取液，浓缩，干燥，得到三棱的醇提物；将三棱醇提物干法上聚酰胺柱，先分别以水和5%乙醇洗脱，再用65%的乙醇洗脱，聚酰胺薄层色谱检识，收集65%乙醇洗脱的馏分，浓缩，减压干燥，得三棱总酚，含量为99.1%。
实施例14：
取得到的三棱总酚（以FeCl3-K3Fe(CN)6为显色剂，经紫外可见分光光度法测定其总酚含量>90%）1.8g，加入适量的吐温-80—蒸馏水（1:10）60ml，配制成30mg/ml的药液，备用。将昆明小鼠50只，随机分为5组，每组10只，雌雄各半。其中第1组为空白对照组，第2组为阳性药物对照组（阿司匹林），第3、4、5组分别为高剂量组(1.0g/kg)、中剂量组(0.5g/kg)、低剂量组(0.25g/kg)。采取灌胃给药的方法，第1、2、3、4、5组分别给予生理盐水、阿司匹林和相应剂量的三棱总酚酸提取物的药液，每日一次，连续4d。末次给药前禁食12 h（8:00 pm–8:00 am），给药后60min腹腔注射新鲜配制的1%的醋酸溶液0.2ml/只后致痛，观察并记录小鼠在5-15min内扭体反应（腹部内凹，后肢伸展，臀部抬高）的次数，并计算各组的扭体抑制率。结果如表1：
表1 三棱总酚对小鼠醋酸扭体反应的影响( 
±s)
Table 1.Influence on mouse writhing response by HAc from Sparganium stoloniferum Buch.—Hma. Total phenols.
| 组别 | 剂量(g/kg) | 扭体次数 | 抑制率(%) |
| NS对照组 | — | 50.5±4.9 | — |
| 阿司匹林组 | 0.4 | 22.6±10.8*** | 55.2 |
| 低剂量组 | 0.25 | 42.6±7.2* | 15.6 |
| 中剂量组 | 0.5 | 36±10.7*** | 28.7 |
| 高剂量组 | 1.0 | 30.3±6.6*** | 40.0 |
注：与NS对照组比较，*P<0. 05，**P<0. 01，***P<0.001；n=10
结果表明：NS对照组、阿斯匹林组、低剂量组、中剂量组、高剂量组的扭体次数分别为50.5±4.9次、22.6±10.8次、42.6±7.2次、36±10.7次、30.3±6.6次；根据公式扭体抑制率=（模型组扭体次数-药物组扭体次数）/模型组扭体次数×100%计算抑制率，与NS对照组相比，阿斯匹林组、低剂量组、中剂量组、高剂量组的抑制率分别为55.2%、15.6%、28.7%、40.0%。三棱总酚对小鼠因醋酸刺激引起的疼痛具有一定的镇痛作用，且镇痛作用强度呈剂量依赖关系。
Claims (2)
1.一种具有镇痛活性的三棱总酚的制备方法，其特征在于制备步骤如下：
（1） 将三棱粉碎，过40-80目筛，得到三棱粉末备用；
（2） 取步骤（1）得到的三棱粉末置提取罐中，加入50%-95%乙醇，加入乙醇的体积量L：三棱粉末重量Kg的比例为5-10:1，浸渍12小时备用；
（3） 取步骤（2）得到的浸渍三棱回流提取2-4次，每次提取1-3小时，滤过，合并提取液，浓缩，干燥，得到三棱的醇提物备用；
（4）取步骤（3）得到的三棱醇提物，以三棱醇提物:聚酰胺=1:1.5的质量比拌样，上聚酰胺柱；先分别用水和5%乙醇洗脱，接着用40%-65%的乙醇洗脱，薄层色谱检识，收集40%-65%乙醇洗脱的馏分，浓缩，减压干燥，得三棱总酚，总酚含量为50%-99%。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）中所述的三棱粉末的粒径为过60目筛。
3. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）中加入的乙醇浓度为75%，加入乙醇的体积量L：三棱粉末重量Kg比例为8:1。
4. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（3）中的提取条件为持续回流2小时，连续提取3次。
5. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（4）中收集65%乙醇洗脱的馏分。
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| 戴仕林.中药三棱的现代研究进展.《中国民族民间医药》.2011,(第1期),第63-64页. * |
| 毛春芹等.三棱不同炮制品总黄酮镇痛作用研究.《南京中医药大学学报(自然科学版)》.2001,第17卷(第5期),第299-300页. * |
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