CN102204942B - 一种榛叶黄酮的提取方法 - Google Patents

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Abstract

一种榛叶黄酮的提取方法，涉及黄酮类物质的提取方法。提取方法有机溶剂残留低、无环境污染，收率高，得到的榛叶黄酮杂质含量低。将榛属植物叶子粉体与固定化酶混合的萃取料进行超临界二氧化碳萃取；其中，在进行超临界二氧化碳萃取过程中，还可添加夹带剂，夹带剂为甲醇、乙醇和丙酮中的一种或者其中几种的混合物。与目前应用广泛的溶剂提取技术相比，本发明采用固定化酶酶解与超临界CO2萃取技术相结合提取榛叶中黄酮类化合物，有机溶剂残留低，固定化酶可回收利用，提取时间短且收率高，榛叶黄酮收率达0.57％～5.12％，可以除去较多杂质，对榛黄酮可以起到浓缩富集的作用，具有较强的应用前景。

Description

一种榛叶黄酮的提取方法
技术领域
本发明涉及黄酮类物质的提取方法，具体涉及榛叶黄酮的提取方法。
背景技术
植物材料中的活性成分存在于由细胞壁及原生质体包围的细胞中，其外壁是由纤维素、半纤维素、果胶质，木质素等物质构成，细胞内同时存在着蛋白质、脂质化合物、糖类等多种物质，形成黄酮等天然化合物提取纯化的障碍。近年来陆续有研究者采取液相酶(如水相酶)酶解法降解细胞壁、胞间连接物和一些干扰提取的成分，不仅可以缩短提取时间，而且可以提高有效成分的收率。近年来，在水相酶催化研究开发的基础发现了一种新的颇具特色的非水介质，即超临界流体。一般认为，在非水体系中，如超临界二氧化碳流体，溶剂和酶的相互作用类似于酶的天然细胞环境，故有时比纯水中表现出更高活性。而且在非水溶剂中，底物更易解，能得到更高的反应速率，此外还能简化分离过程。但是液相酶应用也存在一些不足，液相酶应用后只能进行灭活处理，昂贵的酶仅能利用一次，致使生产成本提高，而且它们会残留在提取物中，成为新的杂质，而采用固定化酶可以避免这些问题。目前常用的固定化酶载体是不溶于水的材料，如壳聚糖微球、海藻酸钙、聚四氟乙烯膜等，酶被固定化于这些固体材料表面或者内部，使用完成后容易从体系中分离且不对产物造成污染，能够实现酶的重复利用。
目前，国内外对于黄酮等天然化合物的提取主要是采用溶剂提取法，但是该方法存在大量有机溶剂残留、污染环境、提取物质杂质含量大等缺陷。而且由于黄酮类化合物位于细胞内，外有细胞壁包被，因此，黄酮类化合物的提取会受到细胞壁的阻碍，收率较低。近年来，利用超临界二氧化碳萃取技术提取具有生理活性的天然产物越来越受到人们的关注。超临界二氧化碳流体无毒、廉价、化学性质惰性、无溶剂残留、无污染、能保持天然成分活性，是优良的环保型溶剂，由于超临界二氧化碳萃取技术绿色环保的特点，因此具有非常广阔的应用前景。
榛黄酮是榛中富含的一种生物活性物质，由含有槲皮素、山奈酚及其苷等成分为特征的多种黄酮类物质组成，它们具有多种生理功能，可有效的防癌，抗氧化，降血脂，对心血管疾病具有预防作用，基于榛黄酮独特的生理作用，它的应用价值很高，但是对榛黄酮的提取方法未有报道。目前市场上还未有榛黄酮的生产和销售，因而制约了榛黄酮的应用。
发明内容
本发明的目的是为了提供一种榛叶黄酮的提取方法，提取方法有机溶剂残留低、无环境污染，收率高，得到的榛叶黄酮杂质含量低，将榛叶充分利用，提高了榛叶的附加值。
本发明的榛叶黄酮的提取方法是通过以下步骤实现的：
一、采摘无病害的榛属植物的叶子，用水清冲洗干净，然后在30℃～100℃条件下干燥至叶子中水分的质量百分含量低于3％，再将干燥后的叶子粉碎至粒径为20～120目，得榛属植物叶子粉体；
二、将步骤一得到的榛属植物叶子粉体和固定化酶混合得萃取料，其中榛属植物叶子粉体和固定化酶的质量比为0.1～100∶1，固定化酶中采用的酶为纤维素酶、木聚糖酶、果胶酶、半纤维素酶和蜗牛酶中的一种或其中的几种；
三、将步骤二的萃取料装入萃取釜，进行超临界二氧化碳萃取得萃取混合物，其中萃取条件如下：萃取压力为15MPa～50MPa，萃取温度30℃～75℃，超临界二氧化碳流量为5～45kg/h，萃取时间为0.5h～3h；
四、将步骤四得到的萃取混合物通过减压分离釜，进行二级分离，其中一级减压分离压力为5～10MPa，温度为40～50℃，二级减压分离压力为5～6MPa，温度为35～50℃，获得榛叶黄酮提取物，即完成榛叶黄酮的提取方法。
本发明的步骤三中在进行超临界二氧化碳萃取过程中，还添加了夹带剂，夹带剂与萃取料的质量比为1∶1.4～20，夹带剂为甲醇、乙醇和丙酮中的一种或者其中几种的的混合物。其中夹带剂还可以为由有机溶剂溶解于pH值为4～7的缓冲液中配制的体积百分浓度为50％～90％的有机溶剂溶液，有机溶剂为甲醇、乙醇和丙酮中的一种或者其中几种的混合物。夹带剂还可以是由有机溶剂溶解于水中配制的体积百分浓度为50％～90％的有机溶剂水溶液。夹带剂的加入，提高了本发明提取方法的收率。
本发明的提取方法中，从萃取后的剩余物料中筛分出固定化酶，加以回收利用。
本发明步骤一中所述榛属植物选自平榛、毛榛、刺榛、川榛、华榛、绒苞榛、滇榛、维西榛、藏刺榛、短柄川榛和欧洲榛中一种或者其中两种之间的杂交品种榛中的一种。本发明步骤二中采用的固定化酶采用现有公开技术制备即可。
本发明的提取方法具有以下优点：与目前应用广泛的溶剂提取技术相比，本发明采用固定化酶酶解与超临界二氧化碳萃取技术相结合提取榛叶中黄酮类化合物，有机溶剂残留低，固定化酶可回收利用，提取时间短且提取效率高，榛叶黄酮收率达0.57％～5.12％，可以除去较多杂质，对榛黄酮可以起到浓缩富集的作用，具有较强的应用前景。
具体实施方式
本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。
具体实施方式一：本实施方式为榛叶黄酮的提取方法，其是通过以下步骤实现的：
一、采摘无病害的榛属植物的叶子，用水清冲洗干净，然后在30℃～100℃条件下干燥至叶子中水分的质量百分含量低于3％，再将干燥后的叶子粉碎至粒径为20～120目，得榛属植物叶子粉体；
二、将步骤一得到的榛属植物叶子粉体和固定化酶混合得萃取料，其中榛属植物叶子粉体和固定化酶的质量比为0.1～100∶1，固定化酶中采用的酶为纤维素酶、木聚糖酶、果胶酶、半纤维素酶和蜗牛酶中的一种或其中的几种；
三、将步骤二的萃取料装入萃取釜，进行超临界二氧化碳萃取得萃取混合物，其中萃取条件如下：萃取压力为15MPa～50MPa，萃取温度30℃～75℃，超临界二氧化碳流量为5～45kg/h，萃取时间为0.5h～3h；
四、将步骤三得到的萃取混合物通过减压分离釜，进行二级分离，其中一级减压分离压力为5～10MPa，温度为40～50℃，二级减压分离压力为5～6MPa，温度为35～50℃，获得榛叶黄酮提取物，即完成榛叶黄酮的提取方法。
本实施方式步骤二中采用的固定化酶采用现有公开技术制备即可，固定化酶为其中几种时，可以任意比组合。
本实施方式的提取方法中，从萃取后的剩余物料中筛分出固定化酶，加以回收利用。
本实施方式对制备得到的榛叶黄酮提取物进行黄酮类物质鉴定：步骤四得的榛叶黄酮提取物经在温度50℃下减压干燥后用5mL甲醇溶解得待测样品，进行鉴定反应：
(1)盐酸-镁粉反应：在试管中加入2mL待测样品，加入少许镁粉，震荡后，滴加浓盐酸数滴，充分振摇，反应完全后，观察颜色变化，可见溶液显棕红色。
(2)AlCl3显色反应：量取100μL待测样品点于在硅胶薄层板上，静置使溶剂挥发，然后在相应位置喷上AlCl3溶液，出现黄色斑点，紫外灯下观察呈亮黄绿色荧光斑点。
(3)与氨水的反应：量取100μL待测样品滴于滤纸上，然后置于氨水瓶口熏2-3min，立即置于紫外灯下观察，可见亮黄绿色荧光斑点。
通过上述的颜色鉴定反应可知，待测样品中含有黄酮类物质，即步骤四得的榛叶黄酮提取物中含有黄酮类物质。
与目前应用广泛的溶剂提取技术相比，本实施方式采用固定化酶酶解与超临界二氧化碳萃取技术相结合提取榛叶中黄酮类化合物，有机溶剂残留低，固定化酶可回收利用，提取时间短且提取效率高，榛叶黄酮收率达0.57％～5.12％，可以除去较多杂质，对榛黄酮可以起到浓缩富集的作用，具有较强的应用前景。
具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一不同的是步骤一中所述榛属植物选自平榛、毛榛、刺榛、川榛、华榛、绒苞榛、滇榛、维西榛、藏刺榛、短柄川榛和欧洲榛中的一种或者其中两种之间的杂交品种榛中的一种。其它步骤及参数与具体实施方式一相同。
具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一或二不同的是步骤一中在40℃～80℃条件下干燥至叶子中水分的质量百分含量低于3％。其它步骤及参数与具体实施方式一或二相同。
具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式一或二不同的是步骤一中在50℃条件下干燥至叶子中水分的质量百分含量低于3％。其它步骤及参数与具体实施方式一或二相同。
具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式一至四之一不同的是步骤一中干燥至叶子中水分的质量百分含量低于3％中采用常压干燥或者减压干燥方式。其它步骤及参数与具体实施方式一至四之一相同。
具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式一至五之一不同的是步骤一中将干燥后的叶子粉碎至粒径为80～110目。其它步骤及参数与具体实施方式一至五之一相同。
具体实施方式七：本实施方式与具体实施方式一至五之一不同的是步骤一中将干燥后的叶子粉碎至粒径为100目。其它步骤及参数与具体实施方式一至五之一相同。
具体实施方式八：本实施方式与具体实施方式一至七之一不同的是步骤二中榛属植物叶子粉体和固定化酶的质量比为0.5～1∶1。其它的步骤及参数与具体实施方式一至七之一相同。
具体实施方式九：本实施方式与具体实施方式一至七之一不同的是步骤二中榛属植物叶子粉体和固定化酶的质量比为2～50∶1。其它的步骤及参数与具体实施方式一至七之一相同。
具体实施方式十：本实施方式与具体实施方式一至七之一不同的是步骤二中榛属植物叶子粉体和固定化酶的质量比为5～10∶1。其它的步骤及参数与具体实施方式一至七之一相同。
具体实施方式十一：本实施方式与具体实施方式一至十之一不同的是步骤二中采用的固定化酶中载体为明胶、硅胶、海藻酸、壳聚糖、琼脂糖、葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶、胶原、尼龙、树脂、多聚氨基酸或乙烯一顺丁烯二酸酐共聚物，或上述载体之一的衍生物。其它步骤及参数与具体实施方式一至十之一相同。
本实施方式利用能够与载体共价结合的酶的功能基团如氨基、羧基、酚基、巯基、羟基、咪唑基、吲哚基，将酶与载体共价偶联形成固定化酶。
本实施方式的固定化酶采用现有公开技术制备得到。
具体实施方式十二：本实施方式与具体实施方式一至十一之一不同的是步骤三中萃取条件如下：萃取压力为20MPa～40MPa，萃取温度40℃～70℃，超临界二氧化碳流量为15～35kg/h，萃取时间为0.8h～2.5h。其它步骤及参数与具体实施方式一至十一之一相同。
具体实施方式十三：本实施方式与具体实施方式一至十一之一不同的是步骤三中萃取条件如下：萃取压力为25MPa～30MPa，萃取温度50℃～65℃，超临界二氧化碳流量为20～30kg/h，萃取时间为1h～2h。其它步骤及参数与具体实施方式一至十一之一相同。
具体实施方式十四：本实施方式与具体实施方式一至十三之一不同的是步骤四中一级减压分离压力为10MPa，温度为45℃。其它步骤及参数与具体实施方式一至十三之一相同。
具体实施方式十五：本实施方式与具体实施方式一至十四之一不同的是步骤四中二级减压分离压力为5MPa，温度为35℃。其它步骤及参数与具体实施方式一至十四之一相同。
具体实施方式十六：本实施方式与具体实施方式一至十五之一不同的是步骤三中进行超临界二氧化碳萃取过程中，还添加了夹带剂，控制夹带剂与萃取料的质量比为1∶1.4～20，夹带剂为甲醇、乙醇和丙酮中的一种或者其中几种的混合物。其它步骤及参数与具体实施方式一至十五之一相同。
本实施方式夹带剂中的有机溶剂为几种的混合物时，以任意比混合。甲醇、乙醇和丙酮为分析纯或者化学纯。
本实施方式中夹带剂的加入，提高本实施方式的提取效率。
具体实施方式十七：本实施方式与具体实施方式十六不同的上夹带剂还可以是由有机溶剂溶解于pH值为4～7的缓冲液中配制的体积百分浓度为50％～90％的有机溶剂溶液，有机溶剂为甲醇、乙醇和丙酮中的一种或者其中几种的混合物。其它步骤及参数与具体实施方式十六相同。
本实施方式中pH值为4～7的缓冲液的配制是本领域技术人员的公知常识，缓冲液的种类对本实施方式没有影响。如采用常规的醋酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液或柠檬酸盐缓冲液。
本实施方式中更优的是采用pH值为4～5的缓冲液配制有机溶剂溶液。有机溶剂溶液的体积百分浓度更优的是60％～80％，最优的是80％的乙醇溶液。
本实施方式中夹带剂还可以是由有机溶剂溶解于水中配制的体积百分浓度为50％～90％的有机溶剂水溶液，有机溶剂为甲醇、乙醇和丙酮中的一种或者其中几种的混合物。其中更优的是体积百分浓度为60％～80％的有机溶剂水溶液，最优的是80％的乙醇水溶液。
本实施方式夹带剂中的有机溶剂为几种的混合物时，以任意比混合。
具体实施方式十八：本实施方式与具体实施方式十六或十七不同的是控制夹带剂与萃取料的质量比为1∶3～18。其它步骤及参数与具体实施方式十六或十七相同。
具体实施方式十九：本实施方式与具体实施方式十六或十七不同的是控制夹带剂与萃取料的质量比为1∶5～10。其它步骤及参数与具体实施方式十六或十七相同。
具体实施方式二十：本实施方式为固定化酶，以壳聚糖为载体，将纤维素酶固定至壳聚糖载体上，其是通过以下步骤制备得到的：一、将40目壳聚糖加入体积分数为5％的戊二醛溶液中，然后室温下搅拌3～4h，再在4℃下静置15～20h，然后离心，弃去上清液，将沉淀物清洗3次，得处理后的壳聚糖，其中壳聚糖与戊二醛溶液为固液比为5％(5g/100mL)；二、向步骤一得的处理后的壳聚糖中加入浓度为1mg/mL的纤维素酶溶液，然后室温下搅拌2h，再离心，弃去上清液，将沉淀物水洗3次，过滤得固定化酶，步骤二中处理后的壳聚糖质量与纤维素酶溶液体积的比例为15g∶100mL。
本实施方式中壳聚糖与戊二醛溶液为固液比(g/mL)为5％中的5％为质量体积百分浓度，即5g壳聚糖加入100mL戊二醛溶液中为5％，依此类推。
具体实施方式二十一：本实施方式为榛叶黄酮的提取方法，其是通过以下步骤实现的：
一、采摘无病害的榛属植物的叶子，用水清冲洗干净，然后在50℃条件下干燥至叶子中水分的质量百分含量低于3％，再将干燥后的叶子干法粉碎至粒径为100目，得榛属植物叶子粉体；
二、将100g步骤一得到的榛属植物叶子粉体和40g固定化酶(采用具体实施方式二十中记载的固定化酶)混合得萃取料，其中榛属植物叶子粉体和固定化酶的质量比为2.5∶1；
三、将步骤二的萃取料装入萃取釜，进行超临界二氧化碳萃取得萃取混合物，其中萃取条件如下：萃取压力为25MPa，萃取温度50℃，超临界二氧化碳流量为20kg/h，萃取时间为1h；进行超临界二氧化碳萃取过程中添加夹带剂，夹带剂与萃取料的质量比为1∶3.3，夹带剂为将乙醇溶液于pH值为5的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液(0.05mol/L柠檬酸溶液和0.05mol/L柠檬酸钠溶液按体积比8.2∶11.8的比例混合得到)中配制的80％(体积)的乙醇溶液；
四、将步骤三得到的萃取混合物通过减压分离釜，进行二级分离，其中一级减压分离压力为10MPa，温度为45℃，二级减压分离压力为5MPa，温度为35℃，获得榛叶黄酮提取物，即完成榛叶黄酮的提取方法。
本实施方式步骤一中榛属植物为平榛。
本实施方式将萃取后剩余物料，用100目筛筛出固定化酶回收利用。
对本实施方式得到的榛叶黄酮提取物进行黄酮类物质鉴定：步骤四得的榛叶黄酮提取物经在温度50℃下减压干燥后用5mL甲醇溶解得待测样品，进行盐酸-镁粉反应的鉴定反应：在试管中加入2ml待测样品，加入少许镁粉，震荡后，滴加浓盐酸数滴，充分振摇，反应完全后，观察颜色变化，可见溶液显棕红色。证明本实施方式得到的榛叶黄酮提取物中含有黄酮类物质。
本实施方式得到的榛叶黄酮提取物中黄酮类物质含量的测定，依据中华人民共和国药典2010年版一部山楂叶含量测定项下总黄酮含量测定方法进行，按干燥品计算，以芦丁(C27H30O16)计，测得本实施方式提取到4.98g榛叶黄酮，榛叶黄酮收率为4.98％。
具体实施方式二十二：本实施方式为固定化酶，以壳聚糖为载体，将木聚糖酶固定至壳聚糖载体上，其是通过以下步骤制备得到的：一、制备壳聚糖小球：将壳聚糖加入2％(体积)的醋酸溶液中，配制得固液比为2.5％(2.5g壳聚糖/100mL醋酸溶液)的壳聚糖溶液，然后将壳聚糖溶液以1mL/min的流速流经口径为0.3mm的滴管，滴入成型剂内形成直径为1.0～2.0mm的壳聚糖载体小球，再将小球清洗至pH至6～7，成型剂为30％(体积)的乙醇水溶液与10％(质量)的氢氧化钠溶液配制成的混合溶液；二、将步骤一得到的壳聚糖载体小球加入体积分数为5％的戊二醛溶液中，然后室温下搅拌3～4h，再在4℃下静置15～20h，然后离心，弃去上清液，将沉淀物清洗3次，得处理后的壳聚糖，其中壳聚糖与戊二醛溶液为固液比为5％(5g/100mL)；三、向步骤一得的处理后的壳聚糖中加入浓度为1mg/mL的木聚糖酶溶液，然后室温下搅拌2h，再离心，弃去上清液，将沉淀物水洗3次，过滤得固定化酶，步骤二中处理后的壳聚糖质量与木聚糖酶溶液体积的比例为15g∶100mL。
本实施方式中壳聚糖与戊二醛溶液为固液比(g/mL)为5％中的5％为质量体积百分浓度，5g壳聚糖加入100mL戊二醛溶液中记为5％，依此类推。
具体实施方式二十三：本实施方式为榛叶黄酮的提取方法，其是通过以下步骤实现的：
一、采摘无病害的榛属植物的叶子，用水清冲洗干净，然后在50℃条件下干燥至叶子中水分的质量百分含量低于3％，再将干燥后的叶子干法粉碎至粒径为120目，得榛属植物叶子粉体；
二、将100g步骤一得到的榛属植物叶子粉体和50g固定化酶(采用具体实施方式二十二中记载的固定化酶)混合得萃取料，其中榛属植物叶子粉体和固定化酶的质量比为2∶1；
三、将步骤二的萃取料装入萃取釜，进行超临界二氧化碳萃取得萃取混合物，其中萃取条件如下：萃取压力为30MPa，萃取温度55℃，超临界二氧化碳流量为20kg/h，萃取时间为1.5h；进行超临界二氧化碳萃取过程中添加夹带剂，夹带剂与萃取料的质量比为1∶4，夹带剂为将乙醇溶液于pH值为5的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液(0.05mol/L柠檬酸溶液和0.05mol/L柠檬酸钠溶液按体积比8.2∶11.8的比例混合得到)中配制的95％(体积)的乙醇溶液；
四、将步骤四得到的萃取混合物通过减压分离釜，进行二级分离，其中一级减压分离压力为10MPa，温度为45℃，二级减压分离压力为5MPa，温度为35℃，获得榛叶黄酮提取物，即完成榛叶黄酮的提取方法。
本实施方式步骤一中榛属植物为毛榛。
本实施方式将萃取后剩余物料加入2倍体积的pH4缓冲溶液(68mL 36％醋酸溶于200ml水中，加醋酸钠(NaAc.3H2O)32g，溶解后用水稀释至500mL)，过20目筛，截留固定化酶，将固定化酶在温度50℃下减压干燥，干燥至其中水分≤3％，回收利用。
对本实施方式得到的榛叶黄酮提取物进行黄酮类物质鉴定：步骤四得的榛叶黄酮提取物经在温度50℃下减压干燥后用5mL甲醇溶解得待测样品，进行鉴定反应：与氨水的反应，量取100μL待测样品滴于滤纸上，然后置于氨水瓶口熏2-3min，立即置于紫外灯下观察，可见亮黄绿色荧光斑点。证明本实施方式得到的榛叶黄酮提取物中含有黄酮类物质。
本实施方式得到的榛叶黄酮提取物中黄酮类物质含量的测定，依据中华人民共和国药典2010年版一部山楂叶含量测定项下总黄酮含量测定方法进行，按干燥品计算，以芦丁(C27H30O16)计，测得本实施方式提取到4.32g榛叶黄酮，榛叶黄酮收率为4.32％。
具体实施方式二十四：本实施方式为固定化酶，以3-氨丙基硅胶为载体，将纤维素酶固定至3-氨丙基硅胶载体上，其是通过以下步骤制备得到的：一、将80目3-氨丙基硅胶加入体积分数为2％的戊二醛溶液中，然后室温下搅拌4h，然后离心，弃去上清液，将沉淀物清洗3次，再放至60℃下干燥，得活化3-氨丙基硅胶，其中3-氨丙基硅胶与戊二醛溶液的固液比为5％(5g/100mL)；二、向步骤一得的活化3-氨丙基硅胶中加入浓度为1mg/mL的纤维素酶溶液，纤维素酶用量与3-氨丙基硅胶的用量比例为100mg/g，然后室温下搅拌10h，再抽滤，将沉淀物水洗3次，真空干燥得固定化酶，步骤二中活化3-氨丙基硅胶质量与纤维素酶溶液体积的比例为15g∶100mL。
本实施方式中3-氨丙基硅胶与戊二醛溶液的固液比为5％(5g/100mL)中的5％为质量体积百分浓度，5g壳聚糖加入100mL戊二醛溶液中为5％，依此类推。
具体实施方式二十五：本实施方式本实施方式为榛叶黄酮的提取方法，其是通过以下步骤实现的：
一、采摘无病害的榛属植物的叶子，用水清冲洗干净，然后在50℃条件下干燥至叶子中水分的质量百分含量低于3％，再将干燥后的叶子干法粉碎至粒径为120目，得榛属植物叶子粉体；
二、将100g步骤一得到的榛属植物叶子粉体和40g固定化酶(采用具体实施方式二十四中记载的固定化酶)混合得萃取料，其中榛属植物叶子粉体和固定化酶的质量比为2.5∶1；
三、将步骤二的萃取料装入萃取釜，进行超临界二氧化碳萃取得萃取混合物，其中萃取条件如下：萃取压力为25MPa，萃取温度50℃，超临界二氧化碳流量为20kg/h，萃取时间为1h；进行超临界二氧化碳萃取过程中添加夹带剂，夹带剂与萃取料的质量比为1∶7，夹带剂为将乙醇溶液于pH值为5的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液(0.05mol/L柠檬酸溶液和0.05mol/L柠檬酸钠溶液按体积比8.2∶11.8的比例混合得到)中配制的80％(体积)的乙醇溶液；
四、将步骤四得到的萃取混合物通过减压分离釜，进行二级分离，其中一级减压分离压力为10MPa，温度为45℃，二级减压分离压力为5MPa，温度为35℃，获得榛叶黄酮提取物，即完成榛叶黄酮的提取方法。
本实施方式步骤一中榛属植物为川榛。
本实施方式将萃取后剩余物料，用120目筛筛出固定化酶回收利用。
对本实施方式得到的榛叶黄酮提取物进行黄酮类物质鉴定：步骤四得的榛叶黄酮提取物经在温度50℃下减压干燥后用5mL甲醇溶解得待测样品，进行盐酸-镁粉反应的鉴定反应：在试管中加入2ml待测样品，加入少许镁粉，震荡后，滴加浓盐酸数滴，充分振摇，反应完全后，观察颜色变化，可见溶液显棕红色。证明本实施方式得到的榛叶黄酮提取物中含有黄酮类物质。证明本实施方式得到的榛叶黄酮提取物中含有黄酮类物质。
本实施方式得到的榛叶黄酮提取物中黄酮类物质含量的测定，依据中华人民共和国药典2010年版一部山楂叶含量测定项下总黄酮含量测定方法进行，按干燥品计算，以芦丁(C27H30O16)计，测得本实施方式提取到2.02g榛叶黄酮，榛叶黄酮收率为2.02％。
具体实施方式二十六：本实施方式为固定化酶，以明胶为载体，将果胶酶固定至明胶载体上，其是通过以下步骤制备得到的：一、将100mL的15％(质量)的明胶溶液加入1mL的浓度为60mg/ml的果胶酶液中，搅拌均匀，然后再加入10mL的5％(体积)浓度的戊二醛，搅拌均匀，静置凝固后置于4℃条件下保存4h，然后取出，破碎约成1mm的颗粒；二、将步骤一得到的颗粒加入0.5％(体积)浓度的戊二醛溶液中浸泡16h，然后将颗粒用蒸馏水洗涤3次，过滤，即可。其中，明胶溶液、果胶酶液、戊二醛溶液均用pH值为4的缓冲液(68mL 36％醋酸溶于200ml水中，加醋酸钠(NaAc.3H2O)32g，溶解后用水稀释至500mL)配制或稀释得到。
具体实施方式二十七：本实施方式本实施方式为榛叶黄酮的提取方法，其是通过以下步骤实现的：
一、采摘无病害的榛属植物的叶子，用水清冲洗干净，然后在50℃条件下干燥至叶子中水分的质量百分含量低于3％，再将干燥后的叶子干法粉碎至粒径为120目，得榛属植物叶子粉体；
二、将100g步骤一得到的榛属植物叶子粉体和50g固定化酶(采用具体实施方式二十六中记载的固定化酶)混合得萃取料，其中榛属植物叶子粉体和固定化酶的质量比为2∶1；
三、将步骤二的萃取料装入萃取釜，进行超临界二氧化碳萃取得萃取混合物，其中萃取条件如下：萃取压力为25MPa，萃取温度50℃，超临界二氧化碳流量为30kg/h，萃取时间为1.5h；
四、将步骤四得到的萃取混合物通过减压分离釜，进行二级分离，其中一级减压分离压力为10MPa，温度为45℃，二级减压分离压力为5MPa，温度为35℃，获得榛叶黄酮提取物，即完成榛叶黄酮的提取方法。
本实施方式步骤一中榛属植物为刺榛。
本实施方式将萃取后剩余物料，用40目筛筛出固定化酶回收利用。
对本实施方式得到的榛叶黄酮提取物进行黄酮类物质鉴定：步骤四得的榛叶黄酮提取物经在温度50℃下减压干燥后用5mL甲醇溶解得待测样品，进行鉴定反应：与氨水的反应，量取10μL待测样品滴于滤纸上，然后置于氨水瓶口熏2～3min，立即置于紫外灯下观察，可见亮黄绿色荧光斑点。证明本实施方式得到的榛叶黄酮提取物中含有黄酮类物质。
本实施方式得到的榛叶黄酮提取物中黄酮类物质含量的测定，依据中华人民共和国药典2010年版一部山楂叶含量测定项下总黄酮含量测定方法进行，按干燥品计算，以芦丁(C27H30O16)计，测得本实施方式提取到0.57g榛叶黄酮，榛叶黄酮收率为0.57％。
具体实施方式二十八：本实施方式本实施方式为榛叶黄酮的提取方法，其是通过以下步骤实现的：
一、采摘无病害的榛属植物的叶子，用水清冲洗干净，然后在50℃条件下干燥至叶子中水分的质量百分含量低于3％，再将干燥后的叶子干法粉碎至粒径为120目，得榛属植物叶子粉体；
二、将100g步骤一得到的榛属植物叶子粉体和40g固定化酶(采用具体实施方式二十四中记载的固定化酶)混合得萃取料，其中榛属植物叶子粉体和固定化酶的质量比为0.5∶1；
三、将步骤二的萃取料装入萃取釜，进行超临界二氧化碳萃取得萃取混合物，其中萃取条件如下：萃取压力为25MPa，萃取温度50℃，超临界二氧化碳流量为20kg/h，萃取时间为1h；进行超临界二氧化碳萃取过程中添加夹带剂，夹带剂与萃取料的质量比为1∶7，夹带剂为将乙醇溶液于pH值为5的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液(0.05mol/L柠檬酸溶液和0.05mol/L柠檬酸钠溶液按体积比8.2∶11.8的比例混合得到)中配制的80％(体积)的乙醇溶液；
四、将步骤四得到的萃取混合物通过减压分离釜，进行二级分离，其中一级减压分离压力为10MPa，温度为45℃，二级减压分离压力为5MPa，温度为35℃，获得榛叶黄酮提取物，即完成榛叶黄酮的提取方法。
本实施方式步骤一中榛属植物为平榛。
本实施方式将萃取后剩余物料，用120目筛筛出固定化酶回收利用。
对本实施方式得到的榛叶黄酮提取物进行黄酮类物质鉴定：步骤四得的榛叶黄酮提取物经在温度50℃下减压干燥后用5mL甲醇溶解得待测样品，进行盐酸-镁粉反应的鉴定反应：在试管中加入2ml待测样品，加入少许镁粉，震荡后，滴加浓盐酸数滴，充分振摇，反应完全后，观察颜色变化，可见溶液显棕红色。证明本实施方式得到的榛叶黄酮提取物中含有黄酮类物质。证明本实施方式得到的榛叶黄酮提取物中含有黄酮类物质。
本实施方式得到的榛叶黄酮提取物中黄酮类物质含量的测定，依据中华人民共和国药典2010年版一部山楂叶含量测定项下总黄酮含量测定方法进行，按干燥品计算，以芦丁(C27H30O16)计，测得本实施方式提取到5.12g榛叶黄酮，榛叶黄酮收率为5.12％。
具体实施方式二十九：本实施方式为对比实验：采用现有70％(体积)乙醇水溶液为提取溶液，将100g榛叶粉在60℃条件下回流提取2次，每次提取时间为2小时，过滤除固形物，得榛叶黄酮提取物，其中提取溶液与榛叶粉比(重量比)为10∶1。
本实施方式中榛叶粉为平榛的榛叶粉。
本实施方式得到的榛叶黄酮提取物中黄酮类物质含量的测定，依据中华人民共和国药典2010年版一部山楂叶含量测定项下总黄酮含量测定方法进行，按干燥品计算，以芦丁(C27H30O16)计，测得本实施方式提取到0.41g榛叶黄酮，榛叶黄酮收率仅为0.41％。
对比具体实施方式二十一至二十九可见，具体实施方式二十一至二十八的榛叶黄酮的收率高达0.57％～5.12％，比采用现有常规的回流提取方法(具体实施方式二十九记载)的收率(0.41％)高很多。

Claims (10)

1.一种榛叶黄酮的提取方法，其特征在于榛叶黄酮的提取方法是通过以下步骤实现的：
一、采摘无病害的榛属植物的叶子，用水清冲洗干净，然后在30℃~100℃条件下干燥至叶子中水分的质量百分含量低于3%，再将干燥后的叶子粉碎至粒径为20~120目，得榛属植物叶子粉体；
二、将步骤一得到的榛属植物叶子粉体和固定化酶混合得萃取料，其中榛属植物叶子粉体和固定化酶的质量比为0.1~100:1，固定化酶中采用的酶为纤维素酶、木聚糖酶、果胶酶、半纤维素酶和蜗牛酶中的一种或其中的几种；
三、将步骤二的萃取料装入萃取釜，进行超临界二氧化碳萃取得萃取混合物，其中萃取条件如下：萃取压力为15MPa~50MPa，萃取温度30℃~75℃，超临界二氧化碳流量为5~45kg/h，萃取时间为0.5h~3h；
四、将步骤三得到的萃取混合物通过减压分离釜，进行二级分离，其中一级减压分离压力为5~10MPa，温度为40~50℃，二级减压分离压力为5~6MPa，温度为35~50℃，获得榛叶黄酮提取物，即完成榛叶黄酮的提取方法。
2.根据权利要求1所述的一种榛叶黄酮的提取方法，其特征在于步骤一中所述榛属植物选自平榛、毛榛、刺榛、川榛、华榛、绒苞榛、滇榛、维西榛、藏刺榛、短柄川榛和欧洲榛中的一种或者其中两种之间的杂交品种榛中的一种。
3.根据权利要求1或2所述的一种榛叶黄酮的提取方法，其特征在于步骤二中榛属植物叶子粉体和固定化酶的质量比为1.5~50:1。
4.根据权利要求1或2所述的一种榛叶黄酮的提取方法，其特征在于步骤三中萃取条件如下：萃取压力为20MPa~40MPa，萃取温度40℃~70℃，超临界二氧化碳流量为15~35kg/h，萃取时间为0.8h~2.5h。
5.根据权利要求1或2所述的一种榛叶黄酮的提取方法，其特征在于步骤三中萃取条件如下：萃取压力为25MPa~30MPa，萃取温度50℃~65℃，超临界二氧化碳流量为20~30kg/h，萃取时间为1h~2h。
6.根据权利要求1或2所述的一种榛叶黄酮的提取方法，其特征在于步骤四中一级减压分离压力为10MPa，温度为45℃。
7.根据权利要求1所述的一种榛叶黄酮的提取方法，其特征在于步骤三中进行超临界二氧化碳萃取过程中，还添加了夹带剂，控制夹带剂与萃取料的质量比为1:1.4~20，夹带剂为甲醇、乙醇和丙酮中的一种或者其中几种的混合物。
8.根据权利要求7所述的一种榛叶黄酮的提取方法，其特征在于夹带剂为由有机溶剂溶解于pH值为4~7的缓冲液中配制的体积百分浓度为50%~90%的有机溶剂溶液，有机溶剂为甲醇、乙醇和丙酮中的一种或者其中几种的混合物。
9.根据权利要求7所述的一种榛叶黄酮的提取方法，其特征在于夹带剂是由有机溶剂溶解于水中配制的体积百分浓度为50%~90%的有机溶剂水溶液，有机溶剂为甲醇、乙醇和丙酮中的一种或者其中几种的混合物。
10.根据权利要求7、8或9所述的一种榛叶黄酮的提取方法，其特征在于控制夹带剂与萃取料的质量比为1:3~7。
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