CN105494430B - 一种载银低分子量壳聚糖复合微球抗菌剂及其制备方法 - Google Patents

一种载银低分子量壳聚糖复合微球抗菌剂及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种载银低分子量壳聚糖复合微球抗菌剂的制备方法及载银低分子量壳聚糖复合微球抗菌剂。本发明以低分子量壳聚糖为原料，将低分子量壳聚糖乙酸溶液、硝酸银水溶液及香草醛乙醇溶液混合形成复合溶胶；再以石蜡为连续相，失水山梨醇单油酸酯和烷基酚聚氧乙烯醚为复合乳化剂，银/低分子量壳聚糖溶胶为单体、三聚磷酸钠为交联剂配制乳液体系进行乳化交联，最后经洗涤干燥得到银/低分子量壳聚糖复合微球抗菌剂。本发明以低分子量壳聚糖为原料，可使纳米银粒子进入微球内部，从而明显提高复合抗菌剂的抗菌活性，所得抗菌剂具有广谱的杀菌性，对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌均具有高效的致死率。

Description

一种载银低分子量壳聚糖复合微球抗菌剂及其制备方法
技术领域
本发明属于抗菌新材料制备技术领域，尤其涉及一种载银低分子量壳聚糖复合微球抗菌剂及其制备方法。
背景技术
低分子量壳聚糖具有良好的生物相容性和降解性，水溶性大，在微环境中具有超强的抑菌作用和显著的保湿吸湿能力，且无毒副作用。但壳聚糖作为抑菌剂存在耐热性能不足和易洗脱等缺陷，采用有机和无机抑菌剂复配，既可弥补壳聚糖的不足，也有利于包埋无机抑菌剂的毒性，且在复配体系中，有机、无机抑菌剂的固有抑菌活性会显著提高。
纳米银容易与外来原子结合而释放银离子，具有抑菌范围广、持续杀菌时间长等优点。纳米银与壳聚糖分子中的氨基和羟基发生络合反应的活性较强，与壳聚糖复合后，可均匀而稳定地分散于壳聚糖基体中，其高效的抗菌活性、无毒性和耐药性可以有效提高壳聚糖抗菌剂的抑菌性能及环境适应性。
王德松等采用原位法和液相化学还原法制备出银/低分子量壳聚糖和银/低分子量壳聚糖/聚吡咯复合胶乳抗菌剂，经抗菌测试发现两种复合胶乳对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑制作用均明显高于单一的低分子量壳聚糖抗菌剂(复合材料学报，2014，31(5)：1250-1257)。然而，银/低分子量壳聚糖复合胶乳由于银粒子裸露在胶乳表面，瞬间抑菌活性强，长效抗菌性能却随着纳米银粒子的团聚而明显下降。若将银与表面积较大的壳聚糖微球材料复合，使银粒子均匀分散并包裹于交联壳聚糖分子的网状结构中，纳米银释放为银离子则较为缓慢，能够达到长久抑菌的效果。因此，载银低分子量壳聚糖复合微球可成为长效抑菌的高活性复合抗菌剂。
目前，研究人员发现的壳聚糖交联成球的主要方法有：
1.化学交联法：大分子链在光、热或交联剂等作用下通过化学键联结起来，形成网状或体形结构高分子。Zhang等以戊二醛作交联剂，制备出N-半乳糖壳聚糖包埋血清蛋白BSA微球。壳聚糖微球对被包埋物释放缓慢，在释放过程中极少出现瞬间释放速率极快的现象(Carbohydrate Polymers,2008,72:390-397)。然而，Genta认为戊二醛等有毒交联剂会使壳聚糖原有的生物黏附性受损(Carbohydrate Polymers,1998,36:81-88)。
2.喷雾干燥法：将料液雾化成微小的液滴，再与热风接触，瞬间蒸发溶剂形成粉体。由于壳聚糖微球是在空气中干燥制备的，往往成多孔结构，包埋物释放快，此法不适用于缓释体系(Journal of Pharmacy and Pharmacology,2003,55(7):921-931)。
3.复凝聚法：向壳聚糖稀酸溶液中滴加凝聚剂，降低壳聚糖溶解度，从而使壳聚糖从稀酸溶液中析出。此法受体系中的pH值影响较大。Vanden等用复凝聚法制备出负载牛血清蛋白的海藻酸钠-壳聚糖微球，发现其仅在中性条件下才具有较高的释放率(Journal ofControlled Release,2001,77(3):297-307)，应用领域受到限制。
4.乳化分散法：在两种不相溶的液体中加入适量表面活性剂形成乳状液，经交联剂固化得到聚合物微球。壳聚糖表面的亲水性低，微球易受到体系壳聚糖和被包埋物质的浓度、pH值等因素的改变而发生凝聚(Polymer International,2002,48:247)，所得微球粒径较小，但粒度分布较宽。
5.离子交联法：大分子链在离子交联剂作用下通过化学键联结起来，形成网状或体形结构高分子。此法的优点是制备过程中不使用毒性较大的有机溶剂，但微球粒径较大。Zeng等以三聚磷酸钠制备了壳聚糖微球，测试发现微球平均粒径为20μm～30μm(International Journal of Pharmaceutics,2011,421:283-290)。而作为抑菌剂，如此大尺寸粒径的微球很难进入菌细胞的细胞壁而杀灭细菌。
发明内容
本发明的目的在于提供一种载银低分子量壳聚糖复合微球抗菌剂及其制备方法，本发明提供的载银低分子量壳聚糖复合微球抗菌剂。
本发明提供了一种载银低分子量壳聚糖复合微球抗菌剂的制备方法，包括以下步骤：
(a)将低分子量壳聚糖的乙酸溶液与硝酸银水溶液混合，得到透明溶胶；
(b)将步骤a)得到的透明溶胶与香草醛的乙醇水溶液混合，得到复合胶乳；
(c)将失水山梨醇单油酸酯和烷基酚聚氧乙烯醚混合后与液体石蜡混合，形成乳液；将步骤(b)得到的复合胶乳与所述乳液混合，得到银/低分子量壳聚糖乳液；
(d)向所述步骤(c)得到的银/低分子量壳聚糖乳液中加入三聚磷酸钠进行交联固化，破乳、洗涤、真空干燥后得到载银低分子量壳聚糖复合微球抗菌剂。
本发明以低分子量壳聚糖为原料，将低分子量壳聚糖乙酸溶液、硝酸银水溶液及香草醛乙醇溶液混合形成复合溶胶；再以石蜡为连续相，失水山梨醇单油酸酯和烷基酚聚氧乙烯醚为复合乳化剂，银/低分子量壳聚糖溶胶为单体、三聚磷酸钠为交联剂配制乳液体系进行乳化交联，最后经洗涤干燥得到银/低分子量壳聚糖复合微球抗菌剂。本发明以低分子量壳聚糖为原料，可使纳米银粒子进入微球内部，从而明显提高复合抗菌剂的抗菌活性，所得抗菌剂具有广谱的杀菌性，对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌均具有高效的致死率。
本发明以低分子量壳聚糖为原料制备微球并负载纳米银，所述低分子量壳聚糖的粘均分子量优选为3.0×105～8.0×105，更优选为3.0×105～6.0×105。本发明对所述低分子量壳聚糖的来源没有限制，可以按照以下方法制备：
a1)壳聚糖的乙酸溶液与双氧水混合，加热搅拌反应后用碱液沉淀，得到低分子量壳聚糖。
所述步骤a1)中，所述壳聚糖的乙酸溶液中壳聚糖的浓度为20g/L～60g/L；所述壳聚糖的脱乙酰度为90％。具体而言，本发明首先配置浓度为10g/L～20g/L的乙酸水溶液，然后将脱乙酰度为90％的壳聚糖溶于所述乙酸水溶液中，得到浓度为20g/L～60g/L的壳聚糖乙酸溶液。
所述步骤a1)中，所述双氧水的质量浓度为30％；所述壳聚糖的乙酸溶液和所述双氧水的体积比优选为50:(4～20)，更优选为50:(6～16)。
本发明将双氧水加入到壳聚糖乙酸溶液中，加热搅拌反应使壳聚糖在双氧水的作用下降解，所述加热搅拌的温度为50℃～70℃，所述加热搅拌的时间为1h～5h。
降解反应完毕后，向得到的反应产物中加入碱液，使低分子量壳聚糖沉淀出来。在本发明中所述碱液为质量浓度为20％的氢氧化钠溶液，所述氢氧化钠溶液和壳聚糖乙酸溶液的体积比为(20～60)：50。
将得到的沉淀物洗涤、干燥至恒重，即可得到低分子量壳聚糖。
本发明将低分子量壳聚糖的乙酸溶液与硝酸银水溶液混合，得到透明溶胶，然后与香草醛的乙醇水溶液混合，得到复合胶乳。
在本发明中，所述低分子量壳聚糖的乙酸溶液中低分子量壳聚糖的浓度为20g/L～50g/L，首先配置浓度为10g/L～20g/L的乙酸水溶液，然后将低分子量壳聚糖溶于所述乙酸水溶液中，得到浓度为20g/L～50g/L的低分子量壳聚糖乙酸溶液。
所述硝酸银水溶液的浓度为0.1mol/L～0.3mol/L，优选为硝酸银的饱和水溶液。
本发明优选向低分子量壳聚糖乙酸溶液中逐滴滴加硝酸银溶液，使所述硝酸银和所述低分子量壳聚糖的质量比为4～15:100，搅拌至均匀，得到透明溶胶。
得到透明溶胶后，向其中逐滴滴加香草醛的乙醇水溶液，搅拌后得到银/低分子量壳聚糖复合胶乳。在本发明中，所述香草醛的乙醇水溶液中香草醛的浓度为50g/L；所述乙醇和水的体积比为2:1。逐滴滴加香草醛的乙醇水溶液，使所述香草醛和所述硝酸银的摩尔比为1～9:1，搅拌1h～2h后得到银/低分子量壳聚糖复合胶乳。
得到银/低分子量壳聚糖复合胶乳后，将其与乳液混合，得到银/低分子量壳聚糖乳液。所述乳液按照以下方法制备：
将失水山梨醇单油酸酯和烷基酚聚氧乙烯醚混合后与液体石蜡混合，形成乳液。
其中，所述失水山梨醇单油酸酯和烷基酚聚氧乙烯醚的质量比为3:1；所述失水山梨醇单油酸酯和烷基酚聚氧乙烯醚的总质量与所述液体石蜡的体积的比例为5g～10g：100mL。首先将失水山梨醇单油酸酯和烷基酚聚氧乙烯醚混合得到复合乳化剂，然后与液体石蜡混合得到乳液。
本发明优选在氮气保护下将复合胶乳与所述乳液混合，混合后，所述复合胶乳的浓度为20～50g/L，搅拌均匀后得到银/低分子量壳聚糖乳液。所述搅拌的时间优选为30min。
得到银/低分子量壳聚糖乳液后，向其中加入三聚磷酸钠进行交联固化，破乳、洗涤、真空干燥后得到载银低分子量壳聚糖复合微球抗菌剂。其中，所述三聚磷酸钠的质量与所述液体石蜡的体积的比例为2g～10g:100mL，优选为4g～8g:100mL。所述交联固化的温度为60℃，所述交联固化的时间为2h～5h，优选为4h～5h。
本发明还提供了一种载银低分子量壳聚糖复合微球抗菌剂，包括由低分子量壳聚糖在三聚磷酸钠作用下交联形成的微球和负载在所述微球内的纳米银。
其中，所述低分子量壳聚糖的粘均分子量为3.0×105～8.0×105，优选为3.0×105～6.0×105。
与现有技术相比，本发明将乳化分散法和离子交联法并用，形成了一种简便而有效的制备方法—乳化离子交联法，即在不相容的两种液体中加入表面活性剂，使体系形成稳定的细乳液，继而加入离子交联剂得到交联聚合物微球，不仅能够保持壳聚糖优良的生物性能，而且能够使纳米银粒子均匀分散并包埋于聚合物体系中，制备得到的纳米微球复合材料对革兰氏菌阳性菌和阴性菌均具有良好的抗菌活性，制备过程简单。
本发明与现有技术相比具有的优点在于：
(1)壳聚糖降解后得到的低分子量壳聚糖水溶性显著增强，且得到的微球粒径与长链高分子量的壳聚糖相比较小；另外，纳米银粒子表面吸附能力强，在乳液中附着在壳聚糖微球表面，通过静电斥力减小壳聚糖微球间的团聚，从而增强了壳聚糖基体对菌细胞壁的破坏能力。
(2)低分子量壳聚糖交联成球后可使银粒子固定于其网状结构中，既避免了纳米粒子的团聚又对其产生包埋和缓释作用，从而实现了长效抑菌。
(3)壳聚糖原料无毒，可降解；银离子还原剂和乳化交联体系中的连续相、交联剂均为低毒试剂。因此，应用以上原料合成出的银/低分子量壳聚糖微球属环境友好材料。
(4)本方法中原料来源广泛，价格便宜，微球制备过程简单，产品提纯简便且产率较高，适于规模化生产。
附图说明
图1为本发明实施例1制备的银/低分子量壳聚糖纳米复合微球的扫描电镜照片；
图2为本发明实施例1制备的银/低分子量壳聚糖纳米复合微球的透射电镜照片；
图3为本发明实施例1制备的银/低分子量壳聚糖纳米复合微球抗菌剂的光电子能谱图；
图4为本发明实施例1制备的银/低分子量壳聚糖纳米复合微球的X射线衍射图谱；
图5为本发明实施例制备的银/低分子量壳聚糖微球对大肠杆菌(E.coli)和金黄色葡萄球菌(S.arueus)的抑菌率；
图6为本发明实施例1制备的银/低分子量壳聚糖微球对大肠杆菌(E.coli)和金黄色葡萄球菌(S.arueus)的抑菌作用随时间变化的趋势图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附表，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
将2.00g脱乙酰度为90％的壳聚糖加入50mL 20.0g/L的乙酸水溶液中，搅拌均匀后静置隔夜至完全溶解；然后加入6mL质量浓度为30％的双氧水，于60℃的水浴中持续搅拌3h，使壳聚糖降解。用30mL质量浓度为20％的NaOH水溶液将降解后的壳聚糖沉淀出来，先后用40mL去离子水和20mL无水乙醇洗涤，于80℃烘干至恒重，得到黏均分子量为6.0×105的低分子量壳聚糖。
将0.40g低分子量壳聚糖溶于20mL 10.0g/L的乙酸水溶液中，滴加浓度为0.2mol/L硝酸银水溶液1mL，搅拌30min后再逐滴加入浓度为50.0g/L的香草醛溶液(溶剂体积比：V水:V乙醇＝1:2)2mL，持续搅拌1h得到银/低分子量壳聚糖复合胶乳。
按照失水山梨醇单油酸酯(Span-80)和烷基酚聚氧乙烯醚(OP-10)质量比为3:1将失水山梨醇单油酸酯和烷基酚聚氧乙烯醚混合，得到复合乳化剂。称取6.00g所述复合乳化剂与100mL液体石蜡混合，搅拌均匀后形成乳液体系，在氮气保护下将4.00g新制备的银/低分子量壳聚糖胶乳作为分散相加入到上述混合液内，搅拌至乳化均匀，然后逐滴加入5.00g三聚磷酸钠，使低分子量壳聚糖于60℃交联固化4h。交联反应停止后，用30mL丙酮破乳，再依次用50mL去离子水和20mL无水乙醇洗涤，于80℃干燥至恒重，再在研钵中研磨细化，得到银/低分子量壳聚糖纳米复合微球。
本实施例中所制备的银/低分子量壳聚糖纳米复合微球的扫描电镜照片如图1所示，图1为本发明实施例1制备的银/低分子量壳聚糖纳米复合微球的扫描电镜照片。由图1可知，本发明制备的银/低分子量壳聚糖纳米复合微球为规则的球形，直径约为3～10μm，球体表面光滑且彼此无粘连。
本实施例中所制备的银/低分子量壳聚糖纳米复合微球的透射电镜照片如图2所示，图2为本发明实施例1制备的银/低分子量壳聚糖纳米复合微球的透射电镜照片。由图2可知，复合微球中纳米银粒子的平均粒径约为10～20nm，纳米粒子在微球中分散得比较均匀，无明显团聚现象。
本实施例所制备的银/低分子量壳聚糖纳米复合微球抗菌剂的光电子能谱图如图3所示，图3为本发明实施例1制备的银/低分子量壳聚糖纳米复合微球抗菌剂的光电子能谱图。谱图结果显示出C、O、N、P和Ag元素在微球表面的原子数含量分别为62.2％、30.7％、5.1％、1.8和0.2％。微球抗菌剂中银的总含量约为4.6％，而表面的银含量仅为0.2％，这说明大部分纳米银包埋在了微球中。
本实施例中所制备的银/低分子量壳聚糖纳米复合微球的X射线衍射图谱如图4所示，图4为本发明实施例1制备的银/低分子量壳聚糖纳米复合微球的X射线衍射图谱，图4中，(a)为低分子量壳聚糖的X射线衍射图谱，(b)为银/低分子量壳聚糖微球的X射线衍射图谱。图4中38.2°，44.4°，64.5°和73.2°处的衍射峰分别对应Ag/LMWC复合微球中银晶的(111)、(200)、(220)和(311)晶面，这表明微球中的纳米银晶型为面心立方，而此晶型结构的纳米银具有较高效的抑菌活性。
将3.00g牛肉膏、10.00g蛋白胨、5.00gNaCl倒入500mL蒸馏水中，不断地搅拌并加热至牛肉膏脱离纸，将pH调节至7.2～7.4，迅速将液体培养基装入锥形瓶中，用牛皮纸封口，捆绑，灭菌。在无菌室中将2mL双倍浓缩细菌(大肠杆菌和金黄色葡萄球菌)液体培养基分别装入试管中，塞紧胶塞，用牛皮纸包好并捆住，放入高压蒸汽灭菌器中进行高温灭菌。上述试管放入气浴恒温培养箱中于温度为35～37℃、转速为180～200r·min-1培养24h。以相应稀释倍数的液体培养基作为实验的空白基准，用紫外-可见分光光度计在波长为460nm处测量不同稀释浓度菌液的吸光度(UV)；对已培养24h的大肠杆菌培养皿进行细菌菌数目的统计，记作菌群落数(JQS)，与测得已培养24h相对应浓度的细菌吸光度值相对应，绘制标准工作曲线。用无菌水配置一系列浓度递减的银/低分子量壳聚糖微球悬浮液及低分子量壳聚糖微球悬浮液。在无菌室下燃烧的酒精灯旁，用微量注射器分别取2mL不同浓度的银/低分子量壳聚糖微球及低分子量壳聚糖微球悬浮液注入已灭菌的试管中。用微量注射器分别取0.2mL不同菌液注入上述装试管中，将试管放入气浴恒温培养箱中于温度为35～37℃、转速为180～200r·min-1培养24h。以对应用量的双倍浓缩液体培养基悬浮液为空白基准，在波长为460nm处分别依次测定已培养混合液的吸光度，记录数据，对应工作曲线计算出抑菌率，当吸光度为0时对应的样品浓度即为最小抑菌浓度。按照上述实验步骤培养出菌株，配制浓度略高于最小抑菌浓度的银/低分子量壳聚糖微球悬浮液，将其注射入培养出菌株的试管中，同样条件下继续培养24h，测定混合液的吸光度，记录数据，等比例增大悬浮液浓度，直至测定的吸光度为0，从而得到样品的最小杀菌浓度，结果参见图5和图6，图5为本发明实施例制备的银/低分子量壳聚糖微球对大肠杆菌(E.coli)和金黄色葡萄球菌(S.arueus)的抑菌率，图5中，CS为0.6g/L壳聚糖的抑菌率，LMWC为0.6g/L低分子量壳聚糖的抑菌率，1#为实施例1制备的0.6g/L银/低分子量壳聚糖复合微球的抑菌率，2#为实施例2制备的0.6g/L银/低分子量壳聚糖复合微球的抑菌率，3#为实施例3制备的0.4g/L银/低分子量壳聚糖复合微球的抑菌率，4#为实施例4制备的0.6g/L银/低分子量壳聚糖复合微球的抑菌率；图6为本发明实施例1制备的银/低分子量壳聚糖微球对大肠杆菌(E.coli)和金黄色葡萄球菌(S.arueus)的抑菌作用随时间变化的趋势图。图5中，1#数据显示，0.6g/L实施例1制备的银/低分子量壳聚糖复合微球对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌率分别为96.22％，97.14％。图6显示，银/低分子量壳聚糖复合微球对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度均为1.2g/L，最小杀菌浓度分别为2.4g/L和2.6g/L。
实施例2
将2.00g脱乙酰度为90％的壳聚糖加入50mL 20.0g/L的乙酸水溶液中，搅拌均匀后静置隔夜至完全溶解；然后加入10mL质量浓度为30％的双氧水，于60℃的水浴中持续搅拌3h，使壳聚糖降解。用30mL质量浓度为20％的NaOH水溶液将降解后的壳聚糖沉淀出来，先后用40mL去离子水和20mL无水乙醇洗涤，于80℃烘干至恒重，得到黏均分子量为4.3×105的低分子量壳聚糖。
取0.40g低分子量壳聚糖溶于20mL 10.0g/L的乙酸水溶液中，滴加浓度为0.3mol/L硝酸银水溶液1mL，搅拌30min后再逐滴加入浓度为50.0g/L的香草醛溶液(溶剂体积比：V水:V乙醇＝1:2)2mL，持续搅拌1h得到银/低分子量壳聚糖复合胶乳。
按照失水山梨醇单油酸酯(Span-80)和烷基酚聚氧乙烯醚(OP-10)质量比为3:1将失水山梨醇单油酸酯和烷基酚聚氧乙烯醚混合，得到复合乳化剂。称取6.00g所述复合乳化剂与100mL液体石蜡混合，搅拌均匀后形成乳液体系，在氮气保护下将6.00g新制备的银/低分子量壳聚糖胶乳作为分散相加入到上述混合液内，搅拌至乳化均匀，然后逐滴加入6.00g三聚磷酸钠，使低分子量壳聚糖于60℃交联固化4h。交联反应停止后，用30mL丙酮破乳，再依次用50mL去离子水和20mL无水乙醇洗涤，于80℃干燥至恒重，再在研钵中研磨细化，得到银/低分子量壳聚糖纳米复合微球。
用该复合微球以大肠杆菌和金黄色葡萄球菌为抗菌对象进行抑菌测试，方法同实施例1，结果表明，0.6g/L银/低分子量壳聚糖复合微球对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌率分别为97.02％，97.63％(图5中2#数据)；对两种菌的最小抑菌浓度均为0.8g/L，最小杀菌浓度分别为1.8g/L和2.0g/L。
实施例3
将3.00g脱乙酰度为90％的壳聚糖加入50mL 20.0g/L的乙酸水溶液中，搅拌均匀后静置隔夜至完全溶解；然后加入16mL质量浓度为30％的双氧水，于60℃的水浴中持续搅拌3h，使壳聚糖降解。用50mL质量浓度为20％的NaOH水溶液将降解后的壳聚糖沉淀出来，先后用50mL去离子水和20mL无水乙醇洗涤，于80℃烘干至恒重，得到黏均分子量为3.3×105的低分子量壳聚糖。
取0.40g低分子量壳聚糖溶于20mL 10.0g/L的乙酸水溶液中；滴加浓度为0.3mol/L硝酸银水溶液1mL，搅拌30min后再逐滴加入浓度为50.0g/L的香草醛溶液(溶剂体积比：V水:V乙醇＝1:2)3mL，持续搅拌1h得到银/低分子量壳聚糖复合胶乳。
按照失水山梨醇单油酸酯(Span-80)和烷基酚聚氧乙烯醚(OP-10)质量比为3:1将失水山梨醇单油酸酯和烷基酚聚氧乙烯醚混合，得到复合乳化剂。称取8.00g所述复合乳化剂与100mL液体石蜡混合，搅拌均匀后形成乳液体系，在氮气保护下将6.00g新制备的银/低分子量壳聚糖胶乳作为分散相加入到上述混合液内，搅拌至乳化均匀，然后逐滴加入8.00g三聚磷酸钠，使低分子量壳聚糖于60℃交联固化5h。交联反应停止后，用30mL丙酮破乳，再依次用50mL去离子水和20mL无水乙醇洗涤，于80℃干燥至恒重，再在研钵中研磨细化，得到银/低分子量壳聚糖纳米复合微球。
用该复合微球以大肠杆菌和金黄色葡萄球菌为抗菌对象进行抑菌测试，方法同实施例1，结果表明，0.4g/L银/低分子量壳聚糖复合微球对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌率分别为98.56％，98.98％(图5中3#数据)；对两种菌的最小抑菌浓度均为0.6g/L，最小杀菌浓度分别为1.4g/L和1.6g/L。
实施例4
将3.00g脱乙酰度为90％的壳聚糖加入50mL 20.0g/L的乙酸水溶液中，搅拌均匀后静置隔夜至完全溶解；然后加入12mL质量浓度为30％的双氧水，于60℃的水浴中持续搅拌3h，使壳聚糖降解。用50mL质量浓度为20％的NaOH水溶液将降解后的壳聚糖沉淀出来，先后用50mL去离子水和20mL无水乙醇洗涤，于80℃烘干至恒重，得到黏均分子量为5.7×105的低分子量壳聚糖。
取0.40g低分子量壳聚糖溶于20mL 10.0g/L的乙酸水溶液中；滴加浓度为0.2mol/L硝酸银水溶液1mL，搅拌30min后再逐滴加入浓度为50.0g/L的香草醛溶液(溶剂体积比：V水:V乙醇＝1:2)2mL，持续搅拌1h得到银/低分子量壳聚糖复合胶乳。
按照失水山梨醇单油酸酯(Span-80)和烷基酚聚氧乙烯醚(OP-10)质量比为3:1将失水山梨醇单油酸酯和烷基酚聚氧乙烯醚混合，得到复合乳化剂。称取8.00g所述复合乳化剂与100mL液体石蜡混合，搅拌均匀后形成乳液体系，在氮气保护下将5.00g新制备的银/低分子量壳聚糖胶乳作为分散相加入到上述混合液内，搅拌至乳化均匀，然后逐滴加入7.00g三聚磷酸钠，并使低分子量壳聚糖于60℃交联固化5h。交联反应停止后，用30mL丙酮破乳，再依次用50mL去离子水和20mL无水乙醇洗涤，于80℃干燥至恒重，再在研钵中研磨细化，得到银/低分子量壳聚糖纳米复合微球。
用该复合微球以大肠杆菌和金黄色葡萄球菌为抗菌对象进行抑菌测试，方法同实施例1，结果表明，0.6g/L银/低分子量壳聚糖复合微球对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌率分别为97.15％，97.67％(图5中4#数据)；对两种菌的最小抑菌浓度均为1.0g/L，最小杀菌浓度分别为2.0g/L和2.2g/L。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (7)

1.一种载银低分子量壳聚糖复合微球抗菌剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(a)将低分子量壳聚糖的乙酸溶液与硝酸银水溶液混合，得到透明溶胶；
(b)将步骤a)得到的透明溶胶与香草醛的乙醇水溶液混合，得到复合胶乳；
(c)将失水山梨醇单油酸酯和烷基酚聚氧乙烯醚混合后与液体石蜡混合，形成乳液；将步骤(b)得到的复合胶乳与所述乳液混合，得到银/低分子量壳聚糖乳液；
(d)向所述步骤(c)得到的银/低分子量壳聚糖乳液中加入三聚磷酸钠进行交联固化，破乳、洗涤、真空干燥后得到载银低分子量壳聚糖复合微球抗菌剂；
所述步骤a)中，所述低分子量壳聚糖的粘均分子量为3.0×105～8.0×105；所述低分子量壳聚糖的乙酸溶液中低分子量壳聚糖的浓度为20g/L～50g/L；
所述硝酸银水溶液为0.1mol/L～0.3mol/L；
所述硝酸银和所述低分子量壳聚糖的质量比为4～15:100。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述低分子量壳聚糖按照以下步骤制备：
a1)壳聚糖的乙酸溶液与双氧水混合，加热搅拌反应后用碱液沉淀，得到低分子量壳聚糖。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤a1)中，所述壳聚糖的乙酸溶液中壳聚糖的浓度为20g/L～60g/L；所述壳聚糖的脱乙酰度为90％；
所述双氧水的质量浓度为30％；
所述壳聚糖的乙酸溶液和所述双氧水的体积比为50:(4～20)；
所述加热搅拌的温度为50℃～70℃，所述加热搅拌的时间为1h～5h；
所述碱液为质量浓度为20％的氢氧化钠溶液。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤a)中，所述低分子量壳聚糖的粘均分子量为3.0×105～6.0×105。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤b)中，所述香草醛的乙醇水溶液中香草醛的浓度为50g/L；所述乙醇和水的体积比为2:1；
所述香草醛和所述硝酸银的摩尔比为1～9:1。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤c)中，所述失水山梨醇单油酸酯和烷基酚聚氧乙烯醚的质量比为3:1；
所述失水山梨醇单油酸酯和烷基酚聚氧乙烯醚的总质量与所述液体石蜡的体积的比例为5g～10g：100mL；
所述步骤(b)得到的复合胶乳与所述乳液在氮气保护下混合，混合后，所述复合胶乳的浓度为20～50g/L。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤d)中，所述三聚磷酸钠的质量与所述液体石蜡的体积的比例为2g～10g:100mL；
所述交联固化的温度为60℃，所述交联固化的时间为2h～5h。
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