CN101245326A

CN101245326A - 一种病毒或细菌的浓缩方法

Info

Publication number: CN101245326A
Application number: CNA2008100207919A
Authority: CN
Inventors: 侯继波; 王继春
Original assignee: Jiangsu Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Jiangsu Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2008-02-27
Filing date: 2008-02-27
Publication date: 2008-08-20
Anticipated expiration: 2028-02-27
Also published as: CN101245326B

Abstract

本发明涉及一种细菌和病毒的浓缩方法，属于生物技术领域。将0.1～1％的壳聚糖溶液加入5～15倍量体积的细菌或病毒培养液中，室温下100～300rpm搅拌5～30分钟，再加入1～30％的三聚磷酸钠或硫酸钠或柠檬酸钠或硫酸氨，继续搅拌15～50分钟，自然静置2～10小时待其自然沉淀至1/6以下，收取沉淀即得浓缩的细菌或病毒。本发明所用试剂仅为壳聚糖和三聚磷酸钠或硫酸钠或柠檬酸钠或硫酸氨两种。将悬浮的细菌或病毒沉淀后，仅需吸出上清达到浓缩的效果，并不需分离微球亦不关注其成球性状。其安全性好，成本低廉。整个工艺流程简便，成本低廉，效率高，易于大规模生产。

Description

一种病毒或细菌的浓缩方法

技术领域

本发明涉及一种细菌和病毒的浓缩方法，属于生物技术领域。

背景技术

壳聚糖(Chitosan)又名脱乙酰甲壳素，分子式是[C₆H₁₁NO₄]n，是甲壳素上的乙酰胺基脱去乙酰基而形成的，同时聚合度降低。壳聚糖来源丰富，成本低廉，且有良好的吸附性能和生物相容性，安全无毒，在医药、化工和农业等领域应用广泛。壳聚糖用脱除乙酰基的链节数占总链节数的百分数表示它的脱乙酰度，一般大于70％，其脱乙酰度与其吸附特性相关。

壳聚糖经交联剂作用后易形成微球，常用的制备方法有：乳化交联法，即将原料品溶解或分散于壳聚糖醋酸溶液中，混匀后加入到含有表面活性剂的油相中，经搅拌或超声处理，形成W/O型乳剂，用戊二醛等进行化学交联，通过离心，纯化制得；溶剂蒸发法，即将溶有原料品的壳聚糖醋酸溶液加入到甲苯中，经超声处理，形成W/O型乳剂，加入含戊二醛的甲苯，室温下搅拌，离心后蒸发溶剂制得微球；复乳法，即将原料品溶于有机溶液中，然后再分散于壳聚糖醋酸溶液中，形成O/W型乳剂，再滴加到油相中制成W/O/W型复乳，通过常压加热(或减压)或透析方法除去有机溶剂制得微球；凝聚法，即将硫酸钠或硫酸氨或三聚磷酸钠溶液滴入搅拌着的含吐温-80的壳聚糖醋酸溶液中，经超声或搅拌处理制得。前三种方法都要应用有机溶剂，对多肽等生物活性物质的活性影响大，而第四种方法因不使用有机溶剂，可克服其它方法的缺点，所用交联剂亦为无毒无害物质，安全性好。

应用凝聚法制备壳聚糖微球的方法已有数项专利申请，因所载原料品物质不同和制备工艺不同而有多种不同用途。如：名为“离子交联制备药物缓释用壳聚糖微球的方法”的99121128.6号申请专利是将1～8％含药物的壳聚糖溶液，再加入1～8％明胶或琼脂糖或者琼脂，搅拌均匀，然后在30～60℃恒温2～5小时，通过针头滴加入-10～15℃冷的植物油中，20～40分钟后，加入0.1～5％冷的三聚磷酸钠或硫酸钠或柠檬酸钠交联离子溶液，轻微搅拌20～40分钟后过滤，水洗干燥即可，此发明使制备的大粒径壳聚糖微球的机械性能得到显著的提高，并能方便地制备形态好、粒径小的壳聚糖微球。名为“一种壳聚糖微球/微囊及其制备方法”的200510055380.X号申请专利是将油相和占其0.1～4v％的表面活性剂一起搅拌；加入0.5～5％(w/v)的壳聚糖溶液(水相)，壳聚糖溶液与油相的体积比是1∶2～20，继续搅拌；再加入浓度为1～65％(w/v)的硫酸铵溶液，硫酸铵溶液与壳聚糖溶液的体积比为1∶1～20，继续搅拌；离心分离，分出沉淀物经洗涤干燥，即得微球。名为“一种具有生物活性药物的壳聚糖微球及其制备方法”的200510055381.4号申请专利是将生物活性药物溶解或分散于壳聚糖的溶液中，与加有表面活性剂的油相物质混合，经搅拌形成稳定的乳液后加入一定浓度的硫酸铵水溶液，搅拌沉淀一定时间后分离洗涤，真空干燥后即得到包埋了生物活性药物的粒径均一的壳聚糖微球控释载体。

微球亦不关注其成球性状。其安全性好，操作简便，成本低廉。

液体培养的细菌产物浓缩技术通常采用离心沉淀和静置沉淀的方法。离心沉淀法一般采取3500-5000rpm离心15-25分钟，倾去上清取沉淀，可将培养物浓缩10倍以上，但需消耗大量电能，且受机械限制，难于大规模生产。静置沉淀法是将培养物于室温或低温(4-10℃)下静止放置，让菌体自然沉淀，吸出上清达到浓缩的目的，一般需放置5天以上，最大浓缩比例难于超过3倍。

病毒的浓缩技术通常采用高速离心法和超滤法。高速离心法一般采取12000-15000rpm离心20-30分钟，倾去上清取沉淀，可将培养物浓缩10倍以上，但需消耗大量电能，且受机械限制，难于大规模生产。超滤法是应用专门设备，将病毒培养物中的水份除去，将病毒颗粒滤下达到浓缩目的，可将培养物浓缩10倍以上，缺点是生产成本高，生产速度和效率易受机械限制。

发明内容

技术问题本发明的目的是用一种安全、廉价且高效的方法将悬浮于培养液中的细菌或病毒浓缩5倍以上。

技术方案具体步骤是，将0.1～1％(W/V)的壳聚糖溶液(壳聚糖脱乙酰度为75～90％，分子量3000～300000)加入5～15倍量的细菌或病毒培养液中，在100～300rpm搅拌下室温作用5～30分钟，再加入1～30％的三聚磷酸钠或硫酸钠或柠檬酸钠或硫酸氨交联吸附了细菌或病毒的壳聚糖，继续搅拌15～50分钟使其充分作用形成微球，自然静置2～10小时待其自然沉淀至1/6以下时将上清吸去，收取沉淀即得浓缩的细菌或病毒。

有益效果与现有申请专利不同的是本发明的目的是用于细菌和病毒的浓缩，而不是制备微球作为载体或直接制备载药微球。所用试剂仅为壳聚糖和三聚磷酸钠或硫酸钠或柠檬酸钠或硫酸氨两种。将悬浮的细菌或病毒沉淀后，仅需吸出上清达到浓缩的效果，并不需分离微球亦不关注其成球性状。其安全性好，成本低廉。整个工艺流程简便，成本低廉，效率高，易于大规模生产。

本发明的优点是：

1、无毒无害，安全性好：本发明的方法中所用壳聚糖和三聚磷酸钠或硫酸钠或柠檬酸钠或硫酸氨对细菌和病毒的蛋白成份都没有破坏作用，在浓缩过程中能将病毒和细菌的抗原性保持完好。

2、成本低廉：本发明的方法中所用原材料来源广泛，成本低廉，所用设菌简单，能耗极低，所费成本是传统方法的1/3以下。

3、操作简便：本发明的操作流程极其简便，所用试剂仅两种，仅需在一般性容器中慢速搅拌，微球形成后能快速自然沉淀，将上清吸出后即达到浓缩的效果。

4、吸附沉淀效率高：本发明的方法能将培养液中的细菌或病毒吸附95％以上，形成微球后能沉淀至原液体积的1/5～1/10，达到高效浓缩的效果。

5、易于大规模生产：传统的离心法或超滤法等常受限于设备和能耗，大规模生产难度大，本发明的方法能克服这些缺点，非常便于大规模生产。

具体实施方式

实例1、新城疫病毒浓缩

将0.5％(W/V)的壳聚糖溶液(壳聚糖脱乙酰度为90％，分子量约200000)加入8倍量的新城疫病毒鸡胚尿囊液中，在200rpm搅拌下室温作用15分钟，再加入16％的三聚磷酸钠溶液交联吸附了新城疫病毒的壳聚糖，继续搅拌20分钟使其充分作用形成微球，自然静置5小时待其自然沉淀至1/5以下时将上清吸去，收取沉淀即得浓缩5倍的新城疫病毒，通过检测上清中残余新城疫病毒的HA效价证明其吸附率达97％以上。

实例2、大肠杆菌浓缩

将0.6％(W/V)的壳聚糖溶液(壳聚糖脱乙酰度为85％，分子量约250000)加入10倍量的大肠杆菌培养液中，在200rpm搅拌下室温作用15分钟，再加入25％的硫酸钠交联吸附了细菌的壳聚糖，继续搅拌20分钟使其充分作用形成微球，自然静置6小时待其自然沉淀至1/6以下时将上清吸去，收取沉淀即得浓缩6倍的细菌，通过对上清中的大肠杆菌的计数检测证明吸附率达95％。

附图说明

图1为病毒或细曲的浓缩操作流程图

Claims

1、一种细菌或病毒的浓缩方法，具体步骤是，

将质量体积比为0.1～1％的壳聚糖溶液加入5～15倍量体积的细菌或病毒培养液中，室温下100～300rpm搅拌5～30分钟，再加入1～30％的三聚磷酸钠或硫酸钠或柠檬酸钠或硫酸氨，继续搅拌15～50分钟，自然静置2～10小时待其自然沉淀至1/6以下时将上清吸去，收取沉淀即得浓缩的细菌或病毒。