CN102175633B

CN102175633B - 粮食及其加工副产物中脂肪酶活力的快速测定方法

Info

Publication number: CN102175633B
Application number: CN 201110043917
Authority: CN
Inventors: 徐斌; 董英; 任晓锋; 李波; 苗文娟
Original assignee: Jiangsu University
Current assignee: Jiangsu University
Priority date: 2011-02-24
Filing date: 2011-02-24
Publication date: 2012-12-19
Anticipated expiration: 2031-02-24
Also published as: CN102175633A

Abstract

本发明涉及一种稻米、小麦及其加工副产物中脂肪酶活力的快速检测方法，涉及粮食精深加工领域。首先将米糠等待测样品进行部分脱脂，并根据其原始水分含量大小加入适量蒸馏水、调节至一定水分活度，然后往其中加入适量橄榄油，培养一段时间，最后由铜皂比色法测定其增加的游离脂肪酸量，换算得到米糠脂肪酶活力。该方法省去了脂肪酶的提取及纯化步骤，操作简便，结果准确，可广泛应用于粮食加工企业、仓储企业及粮油检测机构的粮油品质检验与控制。

Description

粮食及其加工副产物中脂肪酶活力的快速测定方法

技术领域

本发明涉及粮食精深加工领域，特指一种稻米、小麦、大豆及其加工副产物中脂肪酶活力的快速检测方法，可广泛应用于粮食加工企业、仓储企业及粮油检测机构的品质检验与控制。

背景技术

稻谷、小麦是人类主要食物资源，在加工过程中会产生大量的副产品――胚芽、麸皮、糠等，这些副产物含有丰富的营养物质，同时也富含脂肪酶、脂肪氧化酶等，在酶的催化作用下这些副产物很容易水解酸败，因而目前主要作为饲料出售，附加值较低。

为了充分利用粮食资源，需要对粮食及其加工副产物的品质进行酶的钝化处理，其中脂肪酶活力的准确测定是制定稳定化处理工艺的基础。谷物脂肪酶的活力测定一般分为三个步骤：首先是从谷物中提取脂肪酶；然后往酶提取液中加入底物并均质化，培育游离脂肪酸；最后对生成的游离脂肪酸进行检测，求出酶活力。即先进行脂肪酶的提取与纯化，再将酶与底物的混合培育脂肪酸，最后进行脂肪酸的测定。

人们已经开发了一系列谷物游离脂肪酸的测定方法，如：滴定法、比色法和色谱法等，其中最为常用的是滴定法和比色法。

比色法测定快速、灵敏度高且仪器价格便宜，受到人们青睐，尤其是铜皂比色法常用于测定样品中游离脂肪酸含量。迄今，该方法已历经了数次创新，Baker利用5%醋酸铜试剂与谷物中脂肪酸反应生成铜皂，通过吸光值求得谷物中游离脂肪酸含量；Duncombe使用Cu(NO₃)·3H₂O和三乙醇胺为铜试剂和显色试剂；Lowry等使用乙酸铜－吡啶作为铜试剂，省去了显色试剂；Kwon等人用异辛烷取代苯提取游离脂肪酸，改进后的方法省去了溶剂蒸发步骤，简化了测定过程。

综上，铜皂比色法用于粮食游离脂肪酸的测定已发展得较为成熟，但该法用于谷物脂肪酶活力的测定尚有两大限制因素。首先是谷物脂肪酶的提取与纯化过程繁琐；其次脂肪酶水溶液与水不溶性底物难以混合均匀。脂肪酶只能在油水接触面上起作用，水不溶性底物（如橄榄油）与酶液在混合反应时，由于均质条件的差异，其形成的乳化液往往不稳定，且乳液颗粒大小也不均衡，造成测定结果重现性差。

2003年，Goffman等人先用磷酸盐缓冲溶液浸提米糠脂肪酶，然后将粗酶液加入橄榄油乳化液中培养18h，再用铜皂比色法测定脂肪酶活力。该法虽省去了脂肪酶的纯化步骤，但其培养时间过长，不能适应脂肪酶活力快速测定的要求。

2003年，F. EI Amrani 等发明了一种低水分体系下测定脂肪酶活度的方法，具体步骤如下图。该法将待测样品粉碎后，再与橄榄油混合，培养一段时间，然后采用滴定法测定游历脂肪酸含量。该法虽不用提取脂肪酶，但存在两个缺点：培养时间72h，太费时，如此长时间的主要目的是为了产生足够数量的游离脂肪酸，这是因为电位滴定测定游离脂肪酸的灵敏度低（相对于铜皂比色法）；其二需要用到恒pH自动电位滴定仪（目前国内还没有厂家生产该类仪器，需进口）。粮食中游离脂肪酸是有机弱酸的混合物，其滴定终点突变不明显，同时在粮食游离脂肪酸提取过程中，部分色素进入提取液，进一步增加了终点判断的难度，使得个体间终点判断差异增大。该法通过精密电位滴定仪准确判定终点或色谱法，但仪器都比较昂贵。

2006年，Devin等人发明了一种低水分体系下测定小麦和麸皮中脂肪酶活度的方法。该法无需提取及纯化脂肪酶，直接往脱脂小麦麸皮中加入水和底物，经过一段时间培养之后，通过铜皂比色法测定游离脂肪酸含量来计算脂肪酶活力。Devin 的方法仅探讨了水和橄榄油添加量对小麦脂肪酶活力的影响，但未说明以下问题：其一，Devin在测定麦麸脂肪酶活力时，其原始水分为15%，在此基础上实验得出优化的加水量，而原始含水量不同的谷物，该研究获得的绝对加水量便失去了参考价值；其二，样品、水和橄榄油三者混合程度对测定结果的重现性的影响极大，因为加入到待测样品中的水和橄榄油量相对很少，若采用常规方法难以充分混匀，这样会导致检测结果重现性差。而如何将样品、水和橄榄油有效混匀，研究人员没有明确指出。

发明内容

为了克服现有方法在测定谷物脂肪酶活力时，脂肪酶的提取与纯化过程繁琐，测定体系内各组分混合不匀导致结果重现性差，无法适应不同原始含水量的样品，耗时长等缺陷，本发明立足于水分活度这个对酶活力起重要作用的影响因子，提供一种在低水分体系下快速测定谷物脂肪酶活力的方法，可推广到粮食加工企业与储藏企业，用于粮食加工及其副产物品质的实时评估。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

首先将粮食及其加工副产物等待测样品用有机溶剂进行部分脱脂，并根据其原始水分含量大小加入适量蒸馏水（或30℃以下低温烘干），调节至一定水分活度，然后往其中加入适量橄榄油，并混合均匀，培养一段时间后，最后由铜皂比色法测定其增加的游离脂肪酸量，换算得到粮食及其加工副产物中脂肪酶的活力。

本发明的方法具体按照下述步骤进行：

（1）待测粮食及其加工副产物样品经粉碎后，过30目筛，取筛下物，加入5～10倍体积的有机溶剂置于气浴摇床中，以100～250rpm振荡脱脂20～120min；

（2）倾斜倒出脱脂的溶酶后，将样品置于烘箱中，20～60℃热风烘干0.5～3h去除残余溶酶，取出放入干燥器中；

（3）称取步骤2干燥后的样品适量，分别置于两试管中，一只空白A_i，另一只为A_f，往每只试管中分别加入0～2.5倍质量的蒸馏水（或30℃以下低温烘干0.5～6h），调节其水分活度为0.6～0.9，优选0.7～0.8；再加入0.2～2.5倍质量的橄榄油，将三者充分搅拌均匀；

（4）取步骤3空白管A_i中的试样，立即加入1~10倍体积的有机溶剂，涡旋振荡30秒，然后5000rpm离心3min，上清液倒入圆底烧瓶中，反复提取2～3次；

（5）取步骤3样品管A_f中的试样，25～75℃下，优选30～55℃，培养1～8h，优选2～4h后，取出，加入1～10倍体积的有机溶剂，振荡30秒，然后5000rpm转速下离心3min，上清液倒入圆底烧瓶中，反复提取2～3次；

（6）将步骤4、5得到的提取液在40℃以下减压蒸发，除去有机溶剂。剩余固形物溶于0.5～3倍样品质量的异辛烷后，加入1～2倍异辛烷体积的5%醋酸铜溶液（用吡啶调节其至pH5.5～6.5），振荡1min，4000rpm离心2~10min，获得有机相与水相；

（7）经过步骤（6）获得的有机相，在715nm下测其吸光度值，试样吸光值与油酸异辛烷标准溶液的吸光值做比较；

（8）将步骤（7）中得到的吸光度值，代入下式计算脂肪酶活力：

其中LA = 脂肪酶活动度（U/g）；

1000为从 mol/L 到 μmol/mL的转换系数；

4为用于重溶油脂的异辛烷的体积（mL）；

v为加入橄榄油的体积（mL）；

A_f 为在715nm下经过培养的样品的吸光度；

A_i为在715 nm下空白样品的吸光度；

ε为油酸在715 nm下的摩尔吸光系数（M⁻¹•cm⁻¹）；

t 为培养时间（h）；

l 为路径长度（cm）；

s 为样品干重（g）。

其中上述测定过程中所用的橄榄油需要进行预先纯化。按照下述步骤进行：往橄榄油中边搅拌边加入约10～30％（W/V）的氧化铝，1h内每隔10～15分钟搅拌混合物一次。静置，待氧化铝沉淀后，过滤获得纯化的橄榄油。取一定量纯化橄榄油，加入1～3倍橄榄油体积的乙醚和1～3倍橄榄油体积的95%乙醇，以酚酞为指示剂，用0.05N的NaOH滴定，如果碱的用量超过橄榄油体积的1/10，重复纯化橄榄油一次。

其中所述的检测对象、橄榄油和蒸馏水三者混合可采用臼式研磨仪或电动匀浆机等混合仪器；其中所述的有机溶剂是指正己烷、乙醚或乙酸乙酯等。

其中所述的粮食及其加工副产物为小麦、稻谷、玉米、大豆、小麦胚芽、麸皮、米糠、糙米、玉米胚芽和大豆胚芽等。

本发明的优点：

本发明首先采用弱极性有机溶剂对测试样品进行部分脱脂，其目的是去除样品中已经存在的大部分游离脂肪酸，同时对样品中的脂肪酶也是一个激活的过程；本发明加入橄榄油是为脂肪酶提供催化底物。本发明通过加入一定量蒸馏水（或30℃以下低温烘干）是为了调节样品的水分活度，使谷物脂肪酶处于最适水分活度下，提高了测定灵敏度；本发明在测定过程中，样品、橄榄油和蒸馏水的混合采用电动匀浆机或臼式研磨仪等仪器将三者充分搅拌均匀，从而保证测定结果的重现性；本发明方法省去了脂肪酶的提取及纯化等一系列复杂的操作，在短时间内能快速测定脂肪酶活力。与目前常用的粮食及其副产物脂肪酶活力测定方法相比，简单、耗时短、重现性好。

附图说明

图1为具体的测定技术路线示意图；

图2为现有技术中测定脂肪酶活力的测定技术路线示意图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步阐述。

本发明测定过程中所用的橄榄油需要进行预先纯化。按照下述步骤进行：往橄榄油中边搅拌边加入约20％（W/V）的氧化铝，1h内每隔10分钟搅拌混合物一次。静置，待氧化铝沉淀后，滤纸过滤获得纯化的橄榄油。取5ml纯化橄榄油，加入5mL乙醚和5ml 95%乙醇，以酚酞为指示剂，用0.05N的NaOH滴定，如果碱的用量超过0.5ml，重复纯化橄榄油一次。

实施例 1

取米糠（原始含水率11.1%），过30目筛，取筛下物10g置于锥形瓶中，加入100ml正己烷，于气浴摇床中以170rpm振荡30min，取出后倒出正己烷，将米糠放入烘箱中30℃干燥30min，拿出后放入干燥器中备用。测定时从干燥器中取出2g干燥的脱脂米糠样品装入50ml离心管中，加入0.3ml蒸馏水，使样品的水分活度达8.2，然后加入1.5ml经纯化的橄榄油，利用电动玻璃匀浆机将离心管中的米糠、水和橄榄油充分混匀，混匀后离心管加盖于45℃培养箱放置2h。取出后加入10ml正己烷，于涡流振荡器上振荡30秒，5000rpm离心3min，将上层液倒入50毫升圆形磨口烧瓶中，该步骤重复2次。40℃旋转蒸发挥尽正己烷后，将残渣复溶于4ml异辛烷中，随后加入2ml 5%醋酸铜溶液（用吡啶调节其至pH6.1），涡流旋转1min，4000离心2min。随后以异辛烷为参比，在715nm下测定吸光度值，记作A_f。不经过培养，其余步骤均相同，测得的吸光度值记为A_i。以上过程重复三次，取平均值。将A_f和A_i，代入公式中计算出脂肪酶活力即可。

得出3组A_f分别为0.705，0.735，0.717，A_i分别为0.348，0.333，0.345。配置浓度为5～25mM油酸异辛烷标准溶液，制作标准曲线，据此求出的ε=113（M⁻¹•cm⁻¹），使用的比色皿厚度1cm，求得A_f均值=（0.705+0.735+0.717）/3=0.72，A_i均值=（0.348+0.333+0.345）/3=0.342，代入算式：1000*（4+1.5）*（0.72-0.342）/113*4*1*2=2.3U/g。则此米糠样品脂肪酶活力为2.3U/g。

实施例 2

取小麦胚芽（原始含水率13.2%），粉碎，过30目筛，取筛下物10g置于锥形瓶中，加入100ml乙醚，于气浴摇床中以250rpm振荡60min，取出后倒出正己烷，将脱脂麦胚粉放入烘箱中30℃干燥30min，取出后放入干燥器中备用。测定时从干燥器中取出3g干燥的脱脂麦胚粉装入50ml离心管中，加入0.6ml蒸馏水，使样品的水分活度达7.9，然后加入2.5ml经纯化的橄榄油，利用臼式研磨仪将麦胚粉、水和橄榄油充分混匀，混匀后移至离心管中，然后加盖于40℃培养箱放置4h。取出后加入10ml正己烷，于涡流振荡器上振荡30秒，5000rpm离心3min，将上层液倒入50毫升圆形磨口烧瓶中，该步骤重复2次。40℃下旋转蒸发挥尽正己烷后，将其中的剩余固形物复溶于4ml异辛烷中，随后加入3ml 5%醋酸铜溶液（用吡啶调节其至pH6.0），涡流旋转1min，4000离心2min。随后以异辛烷为参比，在715nm下测定吸光度值，记作A_f。不经过培养，其余步骤均相同，测得的吸光度值记为A_i。以上过程重复三次，取平均值。将A_f和A_i，代入公式中计算出脂肪酶活力即可。

测得3组A_f分别为0.432，0.428，0.427，A_i分别为0.216，0.212，0.22。配置浓度为1～10mM油酸异辛烷标准溶液，制作标准曲线，据此求出的ε=113（M⁻¹•cm⁻¹），使用的比色皿厚度1cm，求得A_f均值=（0. 432+0.428+0.427）/3=0.427，A_i均值=（0.216+0.212+0.22）/3=0.216，代入算式：1000*（4+1.5）*（0.427-0.216）/113*4*1*2=1.28U/g。则该小麦胚芽脂肪酶活力为1.28U/g。

实施例 3

取小麦麸皮（原始含水率13.5%），粉碎，过30目筛，取筛下物10g置于锥形瓶中，加入100ml正己烷，于气浴摇床中以200rpm振荡45min，取出后倒出正己烷，将脱脂麦麸放入烘箱中30℃干燥30min，拿出后放入干燥器中备用。测定时从干燥器中取出5g干燥的脱脂麦麸粉装入50ml离心管中，加入2.0ml蒸馏水，使样品的水分活度达8.1，然后加入3.5ml经纯化的橄榄油，利用电动玻璃匀浆机转子将离心管中的麦麸、水和橄榄油充分混匀，混匀后离心管加盖于35℃培养箱放置3h。取出后加入10ml正己烷，于涡流振荡器上振荡30秒，5000rpm离心3min，将上层液倒入50毫升圆形磨口烧瓶中，该步骤重复1次。40℃下旋转蒸发挥尽正己烷后，将其中的残渣复溶于4ml异辛烷中，随后加入5ml 5%醋酸铜溶液（用吡啶调节其至pH5.8），涡流旋转1min，4000离心2min。随后以异辛烷为参比，在715nm下测定吸光度值，记作A_f。不经过培养，其余步骤均相同，测得的吸光度值记为A_i。以上过程重复三次，取平均值。将A_f和A_i，代入公式中计算出脂肪酶活力。

得出3组A_f分别为：0.61，0.605，0.593，A_i分别为：0.148，0.146，0.144。配置浓度为5～25mM油酸异辛烷标准溶液，制作标准曲线，据此求出的ε=113（M⁻¹•cm⁻¹），使用的比色皿厚度1cm，求得A_f均值=（0.61+0.605+0.593）/3=0.603，A_i均值=（0.348+0.333+0.345）/3=0.146，代入算式：1000*（4+1.5）*（0.603-0.146）/113*4*1*2=2.78U/g。则此麦麸脂肪酶活力为2.78U/g。

Claims

1.粮食及其加工副产物中脂肪酶活力的快速测定方法，其特征在于按照下述步骤进行：

（3）称取步骤（2）干燥后的样品适量，分别置于两试管中，一只为空白管A_i，另一只为样品管A_f，往每只试管中分别加入0～2.5倍质量的蒸馏水或30℃以下低温烘干0.5～6h，调节其水分活度为0.6～0.9；再加入0.2～2.5倍质量的橄榄油，充分搅拌均匀；

（4）取步骤（3）空白管A_i中的样品，立即加入1~10倍体积的有机溶剂，涡旋振荡30秒，然后5000rpm离心3min，上清液倒入圆底烧瓶中，反复提取2～3次；

（5）取步骤（3）样品管A_f中的样品，25～75℃下，培养1～8h后，取出，加入1～10倍体积的有机溶剂，振荡30秒，然后5000rpm转速下离心3min，上清液倒入圆底烧瓶中，反复提取2～3次；

（6）将步骤（4）、（5）得到的提取液在40℃以下减压蒸发，除去有机溶剂；剩余固形物溶于4ml的异辛烷后，加入1～2倍异辛烷体积的5%醋酸铜溶液振荡1min，4000rpm离心2~10min，获得有机相与水相，其中所述的5%醋酸铜溶液使用前用吡啶调节其至pH5.5～6.5；

（7）经过步骤（6）获得的有机相，在715nm下测其吸光度值，样品吸光度值与油酸异辛烷标准溶液的吸光度值做比较；

Figure 2011100439176100001DEST_PATH_IMAGE001

其中LA = 脂肪酶活动度U/g；

1000为从 mol/L 到 μmol/mL的转换系数；

4为用于重溶油脂的异辛烷的体积mL；

v为加入橄榄油的体积mL；

A_f 为在715nm下经过培养的样品的吸光度值；

A_i为在715 nm下空白样品的吸光度值；

ε为油酸异辛烷在715 nm下的摩尔吸光系数M⁻¹•cm⁻¹；

t 为培养时间h；

l 为比色皿厚度cm；

s 为样品干重g；其中所述的有机溶剂为正己烷、乙醚或乙酸乙酯。

2.根据权利要求1所述的粮食及其加工副产物中脂肪酶活力的快速测定方法，其特征在于其中上述测定过程中所用的橄榄油需要进行预先纯化，按照下述步骤进行：往橄榄油中边搅拌边加入10～30％W/V的氧化铝，1h内每隔10～15分钟搅拌混合物一次；静置，待氧化铝沉淀后，过滤获得纯化的橄榄油；取一定量纯化橄榄油，加入1～3倍橄榄油体积的乙醚和1～3倍橄榄油体积的95%乙醇，以酚酞为指示剂，用0.05N的NaOH滴定，如果碱的用量超过橄榄油体积的1/10，重复纯化橄榄油一次。

3.根据权利要求1所述的粮食及其加工副产物中脂肪酶活力的快速测定方法，其特征在于其中所述步骤（3）中调节其水分活度为0.7～0.8；其中所述步骤（5）中样品管A_f中的样品， 30～55℃，培养2～4h后，取出，加入1～10倍体积的有机溶剂，振荡30秒，然后5000rpm转速下离心3min，上清液倒入圆底烧瓶中，反复提取2～3次。

4.根据权利要求1所述的粮食及其加工副产物中脂肪酶活力的快速测定方法，其特征在于其中所述的干燥后的样品、橄榄油和蒸馏水三者混合方法是采用臼式研磨仪或电动匀浆机混合仪器进行混和。

5.根据权利要求1所述的粮食及其加工副产物中脂肪酶活力的快速测定方法，其特征在于其中所述的粮食及其加工副产物为小麦、稻谷、玉米、大豆、小麦胚芽、麸皮、米糠、糙米、玉米胚芽或大豆胚芽。